20.11.2011

Wykład 8

Przygotowanie pacjenta do badań

• na 1-2 tygodnie przed badaniem - „normalna dieta”

• przed badaniem - na czczo (14-16 h)

• ostatni posiłek ok. 18

• przed badaniem - bez leków wpływających na gospodarkę lipidową

• przed badaniem - w spoczynku przez 30 minut

Warunki prowadzenia badania

• po zawale serca najwcześniej po 12 tygodniach

• po zabiegach chirurgicznych lub infekcjach najwcześniej po 8 tygodniach

Trwałość próbki

• najlepiej oznaczać w dniu pobrania

• 1-2 dni w 4^oC

• >3 dni do 1 miesiąca w -20^oC

• 1 miesiąc do 2 lat w -70^oC

Materiał kontrolny o dwóch różnych poziomach.

Cholesterol całkowity (CH)

Cholesterol w osoczu

75% CHE (wymaga przeprowadzenia do CHW do oznaczeń)

25% CHW

Cholesterol w erytrocycie (stąd wpływ hemolizy na wyniki)

20% CHE

80% CHW

Metody

• metoda enzymatyczna z esterazą i oksydazą cholesterolową

• metody jedno i wielostopniowe oparte o reakcję Liebermana-Burcharda

• metoda - testy paskowe

• metoda suchej chemii

• metody inne

• chromatografia gazowa

• HPLC

• GC - MS

Metody 4-stopniowe

• ekstrakcja cholesterolu

• zmydlanie

• izolowanie

• reakcja barwna

Metody 3-stopniowe

• zmydlanie

• ekstrakcja cholesterolu

• reakcja barwna

Metody 2-stopniowe

• ekstrakcja

• reakcja barwna

Metoda jednostopniowa

• reakcja barwna

Ekstrakcja

Cholesterol związany jet z lipoproteinami- należy go z tych połączeń wyeskstrachować mieszaniną odczynników:

• etanolu i eteru- całkowita ekstrakcja cholestrolu

• etanolu i ocetonu

• metanolu i cholorofmu (mieszanina Folcha)

Zmydlanie- hydroliza estrów Cholesterolu za pomocą alkoholowego roztworu KOH (na ciepło). Uzyskanie postaci wolnej CH.

Izolowanie

• najczęściej strącanie digitoiną

• powstają digitoidy

• stosunek molekularny Ch do digitoiny 1:1

• podczas strącania stosuje się nadmiar digitoiny

Reakcja barwna Liebermana i Burcharda - najstarsza

• do roztworu dodaje się mieszaninę bezwodnika CH₃COOH i stężony H2_SO₄.

• Roztwór: cholesterol w chloroformie, kwasie octowym, dioksanie lub bezpośrednia próbka surowicy/osocza

• reakcja nie jest swoista dla Cholesterolu- z odczynnikiem reagują także bilirubina, witaminy i inne sterole

Cholesterol + bezwodnik kwasu octowego + stężony kwas tiolowy → środowisko bezwodne →

→ kompleksy nienasyconych węglowodanów → jon karbonowy → dehydratacja → pomiar

Kwas p-toluenosulfonowy

z bezwodnikiem CH₃COOH, CH₃COOH lodowatym i H₂SO₄

Metoda enzymatyczna (metoda referencyjna i rutynowa)

esteraza cholesterolowa

hydroliza CHE + H₂O → CH + R-COOH

utlenianie CH + O₂ → 4cholestenon + H₂O₂ λ=240 nm

oksydaza cholesterolowa

Oznaczanie:

• elektroda tlenowa- oznaczanie tlenu zużytego w tej reakcji

• spektrofotometrycznie-pomiar powstałego D4 cholesterolu (Imax- 240nm)

Reakcja Hantzscha

katalaza+ metanol

metanol utlenia się do aldehydu mrówkowego, który w obecności acetylooctanu i amoniaku daje barwny kompleks (405-415nm)

H₂O₂ + CH₃OH HCHO + 2H₂O

HCHO + 2CH₃COCH₂COCH₃ + NH₃ → 3,5-diacetylo-1,4-dihydroaktydyna

Reakcja Trindera

kolorymetrycznie w obecności peroksydazy z 4-aminoantypiryną w obecności fenolu (500-550nm)

4-aminoantypiryna+ fenol = odczynnik Trindera

H₂O₂ + fenol+ 4-aminoantypiryna → barwnik chinoiminowy + 2H₂O

Metoda CHOD-PAP= oksydaza cholesterolowa + odczynnik Trindera

test optyczny H₂O₂ + etanol → aldehyd octowy +2H₂O

aldehyd octowy + NADP⁺ → kwas octowy + NADPH + H⁺

dehydrogenaza kwasu octowego

Metoda referencyjna

1. Abell, Levy, Brodie i Kendall

2. Metoda enzymatyczna z oksydazą cholesterolową

Metoda rozcieńczeń izotopowych z wykorzystaniem spektrometrii masowej

Metoda definitywna oznaczania cholesterolu (ID/MS)

Cholesterol + Cholesterol znakowany (1:1) → hydroliza estrów

Hemoliza wpływa na stężenie Ch w osoczu (↑)

w osoczu in vitro ChW: ChE 1:3

w erytrocytach 4:1

Bilirubina w stężeniu>10mg% wpływa na oznaczenie CH- przyjmuje się poprawki zależnie od stężenia bilirubiny

przy stężeniu bilirubiny >5mg% na każdy 1mg% należy dodać 2,5mg%CH !!!(specjalizacja)

Wartości ↑

• pierwotne hipercholesterolemie

• wtórne hipercholesterolemie w przebiegu

• przewlekła niewydolność nerek

• zespół nerczycowy

• przewlekłe choroby wątroby i dróg żółciowych (szczególnie pierwotna żółciowa marskość wątroby)

• niedoczynność tarczycy

• cukrzyca (źle wyrównana)

• leki: gestageny (doustne środki antykoncepcyjne), glikokortykoidy, leki moczopędne

Zakres wartości prawidłowych trudny do zdefiniowania(odbiega od zakresu wartości pożądanych = nie powodujących ↑ ryzyka choroby niedokrwiennej serca)

• duża zmienność biologiczna (wiek, płeć, dieta, wahania sezonowe, dobowe, faza cyklu menstruacyjnego, ciąża, zawał mięśnia sercowego, zabiegi chirurgiczne)

• duża częstość hipercholesterolemii

• długi okres latencji do klinicznych objawów następstw hipercholesterolemii zakłada się zakres wartości pomiędzy...

Triglicerydy (TG)

Estry glicerolu i kwasów tłuszczowych

Metody kolorymetryczne (chemiczne)

• Ekstrakcja z odczynnikiem Bloora (etanol:eter etylowy 3:1 v/v)

• ekstrakcji ulegają także FL

• suszenie ekstraktu i ważenie

Adsorpcja

• usuwanie FL- adsorpcja mieszaniną albuminy i zeolitu

• usuwanie glukozy- adsorpcja mieszaniną Ca(OH)₂ i CuSO₄

Zmydlanie

• etanolowym roztworem KOH

• następnie usuwanie glicerolu

reakcja barwna- glicerol utlenia się pod wpływem kwasu nadjodowego

• Metody enzymatyczne:

hydroliza triacyloglicerol+ 3H2O → glicerol + 3 KT

lipaza

Oznaczanie glicerolu z wykorzystaniem testu optycznego

1. kinaza glicerolowa

glicerol + ATP → glicerofosforan + ADP

dehydrogenaza glicerolofosforanowa

glicerofosforan + NAD+ → fosfodihydroksyaceton + NADH + H⁺

2. kinaza pirogronianowa

glicerol + ATP → glicerolofosforan + ADP

LDH

pirogronian+ NADH + H⁺ → mleczan + NAD⁺

Z wykorzystaniem metody kolorymetrycznej

1. kinaza glicerolowa

glicerol + ATP → glicerofosforan + ADP

dehydrogenaza glicerolofosforanowa

glicerofosforan + NAD+ → fosfodihydroksyaceton + NADH + H⁺

diaforaza

NADH + H⁺ + barwnik tetrazoliowy → formazon + NAD+ 500nm

2. kinaza pirogronianowa

glicerol + ATP → glicerolofosforan + ADP

dihydrolaza glicerolofosforanowa

glicerofosforan + O₂ → fosfodihydroksyaceton + H2O₂

peroksydaza

H₂O₂ + fenol + 4-1minoantypiryna → barwnik chinoiminowy + 2H₂O

Zakres wartości prawidłowych stężenia TG

50-180 mg/dl (0,55-2,0 mmol/l)

przelicznik z (mg/dl) na (mmol/l): 0,0114

Nieprawidłowe stężenia TG

wartości podwyższone

• pierwotne hipertrójglicerydemie

• wtórne hipertrójglicerydemie w przebiegu

• cukrzyca

• dna moczanowa

• choroba Cushinga

• gammopatie monoklonalne

• toczeń rumieniowaty układowy

• choroba spichrzenia glikogenu

• ciąża

• skłonność do otyłości, nadużywania alkoholu, dieta bogatowęglowodanowa

• leki: blokery recetora β, tiazydy, glikokortykoidy, estrogeny (doustne leki antykoncepcyjne)

---