27.11.2012

Wykład 9

Fosfolipidy (PL)

Estry alkoholu i kwasu ortofosforowego z kwasami tłuszczowymi, w surowicy ok. 95% PL zawiera cholinę - głównie lecytynę(główny fosfolipid osocza).

A1- uwalnia resztę acylową w pozycji a

C- uwalnia resztę fosfocholiny (pierwsza reakcja w teście)

A2- uwalnia resztę acylową w pozycji b

D- uwalnia resztę choliny

Oznaczanie:

GT, PL osocza

lecytyna

sfingomielina

inne

1. fosfataza alkaliczna

fosfocholina + H₂O → cholina + Pi

kinaza choliny

cholina + ATP → fosfocholina + ADP

kinaza pirogronianianowa

ADP + fosfoenolopirogronian → pirogronian + ATP

LDH

pirogronian+ NADH+ H+ → mleczan + NAD⁺

2. oksydaza choliny

cholina + 2O₂+ H₂O → betaina + H₂O₂

H₂O₂+ fenol+ 4-aminoantypiryna → barwnik chinoiminowy + 2H₂O 500-550nm odczynnik Trindera

Oznaczanie FL

• znaczenie kliniczne oznaczania FL

• fosfor, FL 6-11 mg/dl

• stężenie FL 150-300mg/dl

• stosunek CH/FL = 0,98 (wzrasta z wiekiem do 1,4)

• ↑ stężenia

• miażdżyca naczyń

• niewydolność wątroby

• cukrzyca

• oznaczanie lecytyny w płynie owodniowym- ocena dojrzałości układu oddechowego płodu

• stężenie > 5,1 mg/dl - prawidłowe dojrzewanie

• stężenie 4,5-5,1 mg/dl - zaburzenia dojrzewania

HDL

Ocena frakcji

• obniża powikłania kliniczne miażdżycy

• wartości referencyjne

• podfrakcje HDL - ich udział w odwrotnym transporcie cholesterolu

• metoda izolacji frakcji i podfrakcji HDL - metody I, II i III generacji.

Przy triglicerydach powyżej 300 nie można wyliczyć LDL.

Metoda referencyjna - β-kwantyfikacji (ultrawirowanie, strącanie, kolorymetria)

Metody izolacji HDL

• metody I generacji - strąceniowe

• metody II generacji - MAG - magnetic with dextran sulfate

• metody III generacji - bezpośrednie

Metody strąceniowe

• precypitacja lipoprotein VLDL, IDL, Lp(a), LDL, ChM

• za pomocą polianionów reagujących z dodatnio naładowananymi grupami lipoprotein

• w obecności kationów dwuwartościowych reakcja ulega przyspieszeniu

• precypitacja 10-15min → wirowanie 45000g/min lub 1500g/30min w supernatancie: HDL (oznaczamy metodą enzymatyczną)

Najczęściej stosowane mieszaniny polianionów z 2 wartościowymi kationami:

• heparyna z Mn²⁺

• siarczan dekstranu z Mn²⁺ (najlepszy przy wysokich stężeniach TG)

• kwas fosforowolframowy z Mg²⁺

• glikol polietylenowy 20000(wytrąca także HDL2)

gdy stężenie TG> 400mg/dl precypitacja jest utrudniona. Należy zastosowa wirowanie, filtrację lub rozcieńczanie badanej próbki osocza.

Metody bezpośrednie

Oznaczanie Ch we frakcji HDL - metodą enzymatyczną z Ab poliwalentnymi przeciwko apo-B

- czynników kompleksujących

• cyklodekstryna- opłaszcza lipoproteiny (głównie z apo-B, HDL są opłaszczone w niewielkim stopniu) = osłania CH we frakcjach poza HDL przed enzymami uczestniczącymi w reakcji

• spcyficzny detergent usuwa cyklodekstynę z frakcji HDL. Metody bezpośrednie zakończone są reakcją Trindera.

LDL

1. Metoda bezpośrednia

wzór Friendewalda- oznaczanie stężenia CH całkowitego, TAG, HDL- podstawienie do wzoru

Ch- LDL = ChT- Ch-HDL - TG/5 (mg/dL)

Ch- LDL = ChT- Ch-HDL - TG/2,2 (mmol/L)

• Wzór Friendewalda nie powinien być stosowany gdy: stężenie TAG przekracza 300mg/dl (400mg/dl)

• Surowica zwiera znaczne ilości chylomikronów (mleczna)

• materiał nie został pobrany na czczo

• u pacjentów z dysbetalipoproteinemia

2. Metody strąceniowej- selektywna precypitacja z

1. heparyną w niskim pH

2. siarczanem poliwinylu

metody wykorzystujęce mieszanię Ab- poliklonalnych przeciwko apo-A1 i apo-E związanych z żywicą, które wiążą i usuwają HDL, IDL, HDL

metody enzymatyczne- z homogennymi reagentami- pomiar stężenia LDL po zamaskowaniu CH związanego z frakcjami innymi niż LDL

Oznaczanie lipoprotein b

metoda ultrawirowania z precypitacją z polianionami (metoda referencyjna)

elektroforeza lipoprotein- metoda półilościowa z oceną densytometryczną

Chromatografia

• kolumna agarozowa

• HPLC

Lp(a) - bardzo aterogenne

• chromatografia

• elektroforeza

• ultra wirowanie

• bezpośrednie.

Lp-X

• marker cholestazy

• fizjologicznie - brak

• u osób z wrodzonym niedoborem LCAT

• obecna u osób żywionych pozajelitowo emulsjami tłuszczowymi - rozdział elektroforetyczny

Teorie powstawania miażdżycy

• lipidowa

• zakrzepowa

• homocysteinowa

• stan zapalny śródbłonka

• infekcyjna.

Czynniki ryzyka choroby wieńcowej

• palenie papierosów

• nadciśnienie

• hipercholesterolemia

• niskie stężenie HDL

• płeć męska ( w okresie pomenopauzalnym ryzyko u kobiet jest takie samo jak u mężczyzn)

• cukrzyca

• wczesna choroba wieńcowa u bliskich krewnych

• choroba naczyń obwodowych i mózgowych u krewnych

• zespół metaboliczny

• otyłość

Lipidowe czynniki ryzyka choroby wieńcowej

Ch całkowity/ HDL >5

LDL/HDL >4

duże stężenie TAG przy niskim stężeniu HDL

obecność małych gęstych LDL

Czynniki wpływające na stężenie frakcji lipoprotein

LDL HDL

Aktywność fizyczna ↓ ↑

glikokrtykoidy, androgeny, ↑ ↓

β-blokery, leki moczopędne

estrogeny N/↑ ↑

gestageny ↑ ↓

Test zimnej floatacji

ocena wyglądu zimnej surowicy/osocza ( na czarnym tle)

mętny wygląd- zależny od nadmiaru TG (HDL lub ChM)

do wąskiej probówki nalewamy 2-5ml surowicy i wstawiamy do lodówki na 12-18h

↑ChM- typ1 ↑ChM- typ V ↑ VLDL- typ IV/IIB

↑ VLDL

Schemat postępowania profilaktycznego

• <200 mg/dl - prawidłowa dieta, badania za 5 lat

• 200-240 mg/dl + czynnik ryzyka - prawidłowe żywienie, badania za rok

• 200-240 mg/dl + 2 lub więcej czynników ryzyka, dołączyć do grupy z >240 mg/dl i tam, gdzie obecne są objawy kliniczne miażdżycy (choroba niedokrwienna serca, cukrzyca, zółtaczka).

Rozpoznanie dyslipoproteinemii

Po 2 badaniach w odstępie 2-3 tygodni.

Badania rutynowe

• CH, TG, LDL, HDL

• test zimnej flotacji.

W epidemiologii miażdżycy

• LDL-CH/HDL-CH

• CH/HDL-CH - oporność tkankowa na insulinę

• TG/HDL-CH - marker małych gęstych LDL, oporność tkankowa na insulinę

• log TG/HDL-CH - korelacja ze zwrotnym transportem CH, korelacja z ilością małych gęstych LDL.

---