Określanie żywotności i proliferacji

komórek metodami

spektrofotometrycznymi

Spektrofotometria

Spektrofotometria UV-VIS oparta jest na pomiarze absorbancji A

l

badanego roztworu przy określonej długości fali l (200 – 780 nm)
zgodnie z prawem Lamberta-Beera:

A

l

= e

l

x l x c

e

l

– współczynnik absorbcji

l – grubość warstwy absorbującej
c – stężenie analitu w roztworze

Absorbancję definiujemy jako :

A

l

= log I

0

/I

I

0

- natężenie promieniowania padającego na ośrodek

I – natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek

Źródło
światł
a

Monochromator filtr

Rozdzielacz

Płytka 96
dołkowa

detektor

Określanie proliferacji i żywotności -

test MTT

Zasada testu: dehydrogenaza

bursztynianowa, enzym

obecny w wewnętrznej błonie

mitochondrium przekształca

rozpuszczalną w wodzie żółtą

sól tetrazoliową - MTT (bromek-

3[4,5-dwumetylotiazylo-2-yl]-

2,5-dwufenylotetrazolu) do

nierozpuszczalnych kryształów

formazanu o barwie

purpurowej. Kryształy

rozpuszcza się stosując różnego

rodzaju detergenty (np. SDS).

Intensywność zabarwienia

(mierzona

spektrofotometrycznie) jest

wprost proporcjonalna do ilości

żywych komórek. W zależności

od czasu inkubacji, test MTT

może służyć do określania

cytotoksyczności substancji

(24h inkubacja) lub jej wpływu

na proliferacje komórek (96h).

Przekształcenie MTT do formazanu

Płytka 96 dołkowa z wykonanym testem MTT

dehydrogenaza

redukcja

Inne sole tetrazoliowe

• XTT - większa czułość,

krótszy czas inkubacji
oraz produkt
rozpuszczalny w wodzie.

• WSTs (Water soluble

Tetrazolium salts) –
Wykorzystując transport
elektronów związany z
NAD(P)H i 1-metoksy PMS
dochodzi do redukcji WST
na zewnątrz komórki
(większa czułość, produkt
rozpuszczalny w wodzie).

XTT

Stopień uszkodzenia błon

komórkowych - test LDH

Test pozwala ocenić

cytotoksyczność związku.

Badanie opiera się na pomiarze

aktywności dehydrogenazy

mleczanowej (LDH) uwalnianej

do środowiska na skutek

uszkodzenia błony komórkowej

przez badaną substancje. LDH

przekształca mleczan do

pirogronianu, czemu

towarzyszy redukcja NAD

+

do

NADH. Następnie diaforaza

redukuje przy udziale NADH sól

tetrazoliową (żółta) do

formazanu (purpurowy).

Intensywność barwy, mierzona

spektrofotometrycznie jest

proporcjonalna do ilości

uwolnionego LDH, a więc jest

miarą cytotoksyczności

badanego związku.

Neutral Red (NR)

Wychwyt czerwieni

obojętnej polega na

pobieraniu barwnika (Neutral

Red/Toluylene Red/Basic Red

5) przez żywe komórki i

gromadzeniu go w lizosomach

(słaby kation, pH lizosomów <

pH cytoplazmy, co umożliwia

NR wiązanie się miejscami

anionowymi do macierzy

lizosomalnej. Zazwyczaj 3

godzinna inkubacja z

roztworem NR). Następnie

komórki utrwala się, lizuje i

uwalnia barwnik. Komórki

martwe lub uszkodzone nie

pobierają NR. Ilość

pochłoniętego barwnika jest

więc wprost proporcjonalna do

ilości żywych komórek co

umożliwia przeprowadzenie

pomiaru metodami

spektrofotometrycznymi i

określenie cytotoksyczności

badanego związku.

Immunoenzymatyczny test

BrdU

Polega na wykrywaniu przy

pomocy przeciwciał

monoklonalnych znakowanych

enzymem (test ELISA)

analogu tyminy - BrdU (5-

bromo-2-deoksyurydyny),

która wbudowuje się do nowo

syntezowanych nici DNA. Po

denaturacji dsDNA, stosuje się

przeciwciała anty-BrdU

znakowane np. peroksydazą

chrzanową, która przekształca

bezbarwny substrat

tetrametylbenzydyne (TMB) w

barwny produkt (żółty, po

zatrzymaniu reakcji kwasem

siarkowym - niebieski).

Intensywność zabarwienia jest

proporcjonalna do poziomu

syntezy DNA i liczby

dzielących się komórek.

BrdU

Elementy testu BrdU