Określanie żywotności i proliferacji

komórek metodami

spektrofotometrycznymi

Spektrofotometria

Spektrofotometria UV-VIS oparta jest na pomiarze absorbancji

A

l

badanego roztworu przy określonej długości fali

l

(200 – 780

nm) zgodnie z prawem Lamberta-Beera:

A

l

= e

l

x l x c

e

l

– współczynnik absorbcji

l – grubość warstwy absorbującej

c – stężenie analitu w roztworze

Absorbancję definiujemy jako :

A

l

=

log I

0

/I

I

0

- natężenie promieniowania padającego na ośrodek

I – natężenie promieniowania po przejściu przez ośrodek

Źródło
światła

Monochromator

filtr

Rozdzielacz

Płytka 96
dołkowa

detektor

Określanie proliferacji i żywotności - test

MTT

Zasada testu: dehydrogenaza

bursztynianowa, enzym obecny w

wewnętrznej błonie mitochondrium

przekształca rozpuszczalną w wodzie

żółtą sól tetrazoliową - MTT (bromek-

3[4,5-dwumetylotiazylo-2-yl]-2,5-

dwufenylotetrazolu) do

nierozpuszczalnych kryształów

formazanu o barwie purpurowej.

Kryształy rozpuszcza się stosując

różnego rodzaju detergenty (np. SDS).

Intensywność zabarwienia (mierzona

spektrofotometrycznie) jest wprost

proporcjonalna do ilości żywych

komórek. W zależności od czasu

inkubacji, test MTT może służyć do

określania cytotoksyczności

substancji (24h inkubacja) lub jej

wpływu na proliferacje komórek

(96h).

Przekształcenie MTT do formazanu

Płytka 96 dołkowa z wykonanym testem MTT

dehydrogenaza

redukcja

Inne sole tetrazoliowe

• XTT - większa czułość,

krótszy czas inkubacji oraz

produkt rozpuszczalny w

wodzie.

• WSTs (Water soluble

Tetrazolium salts) –

Wykorzystując transport

elektronów związany z

NAD(P)H i 1-metoksy PMS

dochodzi do redukcji WST

na zewnątrz komórki

(większa czułość, produkt

rozpuszczalny w wodzie).

XTT

Stopień uszkodzenia błon komórkowych -

test LDH

Test pozwala ocenić

cytotoksyczność związku.

Badanie opiera się na pomiarze

aktywności dehydrogenazy

mleczanowej (LDH) uwalnianej do

środowiska na skutek uszkodzenia

błony komórkowej przez badaną

substancje. LDH przekształca

mleczan do pirogronianu, czemu

towarzyszy redukcja NAD

+

do

NADH. Następnie diaforaza

redukuje przy udziale NADH sól

tetrazoliową (żółta) do formazanu

(purpurowy). Intensywność

barwy, mierzona

spektrofotometrycznie jest

proporcjonalna do ilości

uwolnionego LDH, a więc jest

miarą cytotoksyczności badanego

związku.

Neutral Red (NR)

Wychwyt czerwieni obojętnej

polega na pobieraniu barwnika

(Neutral Red/Toluylene Red/Basic

Red 5) przez żywe komórki i

gromadzeniu go w lizosomach (słaby

kation, pH lizosomów < pH

cytoplazmy, co umożliwia NR

wiązanie się miejscami anionowymi

do macierzy lizosomalnej. Zazwyczaj

3 godzinna inkubacja z roztworem

NR). Następnie komórki utrwala się,

lizuje i uwalnia barwnik. Komórki

martwe lub uszkodzone nie pobierają

NR. Ilość pochłoniętego barwnika jest

więc wprost proporcjonalna do ilości

żywych komórek co umożliwia

przeprowadzenie pomiaru metodami

spektrofotometrycznymi i określenie

cytotoksyczności badanego związku.

Immunoenzymatyczny test BrdU

Polega na wykrywaniu przy

pomocy przeciwciał

monoklonalnych znakowanych

enzymem (test ELISA) analogu

tyminy - BrdU (5-bromo-2-

deoksyurydyny), która

wbudowuje się do nowo

syntezowanych nici DNA. Po

denaturacji dsDNA, stosuje się

przeciwciała anty-BrdU

znakowane np. peroksydazą

chrzanową, która przekształca

bezbarwny substrat

tetrametylbenzydyne (TMB) w

barwny produkt (żółty, po

zatrzymaniu reakcji kwasem

siarkowym - niebieski).

Intensywność zabarwienia jest

proporcjonalna do poziomu

syntezy DNA i liczby dzielących się

komórek.

BrdU

Elementy testu BrdU