STRONY 88-

Rozdział 6

Wektory do klonowania E. Coli

Techniki wykorzystywane w klonowaniu genów zostały już opisane, wiemy już jak oczyszcza się DNA z ekstraktu komórkowego, jak konstruuje się rekombinowane cząsteczki, jak wprowadza się je od komórek oraz jak odróżnia się kolonie zrekombinowane od niezmienionych. Teraz przyjrzymy się odkładnie wektorom do klonowania, ich właściwościom oraz sposobom ich użycia. Największą różnorodność wykazują wektory do klonowania bakterii E. Coli. Te drobnoustroje od ponad 50 lat są stałym obiektem badań genetyków i biologów molekularnych. Wyjątkowo szeroka wiedza o biochemii, genomie i morfologii tych bakterii pozwala na wykorzystanie jej w eksperymentach klonowania. W tym rozdziale piszemy najczęściej używane wektory do knowania tych bakterii.

6.1 Wektory oparte na plazmidach

Najprostsze i najczęściej używane wektory oparte są o architekturę plazmidów. Olbrzymia ich ilość jest dostępna do klonowania z E. Coli. Są łatwe w uzyskiwaniu i oczyszczaniu, maja duży współczynnik transformowalności, zawierają markery, i są zdolne do przyjmowania fragmentów o długości nawet do 8 kb. Najwięcej rutynowych eksperymentów jest wykonywanych właśnie nap plazmidach.

Pierwszym odkrytym był pBR322, nie jest ze względu na przestarzałość już wykorzystywany ale stanowi doskonałą ilustracje większości cech i właściwości wektorów. Dlatego nasze badania oprzemy o strukturę właśnie tego plazmidu.

Nomenklatura:

pBR322, to z pozoru enigmatyczna nazwa, oto co oznaczają jej człony:

p - plazmid

BR - inicjały odkrywców, Bolivar i Rodriguez

322 - nr eksperymentu, w którym otrzymano prawidłowe wektory

Użyteczne właściwości pBR322:

Genetyczna oraz fizyczna mapa tego wektora pokazuje nam czemu jest tak dobry w klonowaniu. Pierwsza użyteczną cechą jest jego rozmiar. Jak wiadomo DNA nie może być zbyt duże(do 10 kb), aby nie sprawiać problemów podczas oczyszczania. Wektor pBR322 ma całkowity rozmiar 4,363 kb, co oznacza ze nie tylko on może być łatwo oczyszczony ale również jego zrekombinowana postać z insertem aż do około 6 kb, nadal jest stosunkowo prosta do zebrania z mieszaniny.

Druga zaletą jest obecność dwóch genów markerowych - odporności na ampicylinę i tetracyklinę, które zamiennie są używane w procesie już poznanym - insercyjnej inaktywacji. Insercja może odbywać się w wielu miejscach tych genów i z użyciem niemal dowolnej restryktazy, ze względu na obecność w dużej ilość różnorodnych miejsc ciecia.

Trzeci plus polega na dużej ilości kopii tego wektora, po wprowadzeniu 15 cząsteczek plazmidu jego ilość w krótkim czasie rośnie do 1000-3000 przy użyciu opisywanego już procesu amplifikacji plazmidu z użyciem chloramfenikolu. Daje to ostatecznie dużą wydajność replikacji tego wektora.

Mapa pBR322:

Rodowód pBR322:

Wektor w stanie naturalnym oczywiście nie posiada wszystkich podanych wyżej cech.

Powstanie tego plazmidu jest efektem długotrwałych prac projektowych oraz doświadczeń wykorzystujących techniki opisane w rozdziale 4. pBR322 jest plazmidem produkowanym obecnie komercyjnie przez duże koncerny i stanowi zlepek trzech naturalnie występujących plazmidów: R1, R6-5 i pMB1. Pierwszy z nich dostarczył genu oporności na ampicylinę, z drugiego pochodzi oporność na tetracyklinę, a trzeci jest dawcą ori (miejsca startu replikacji).

Bardziej wyrafinowane plazmidy E. Coli

pBR322 został badany w latach 70. a pierwsza publikacja na jego temat ukazał się w 1977 roku, od tamtego czasu badacze próbowali znaleźć coraz to lepsze wektory i efektem ich pracy było opracowanie wektora pBR327. Zlikwidowano w nim geny markerowe, i zmieniono zdolności replikacyjne i koniugacje, czego efektem było:

-pBR327 ma większą ilość kopii, nie jest ona niewiarygodnie wielka, lecz powoduje ze łatwiej jest badan geny w pewnych konkretnych eksperymentach gdzie istotnym parametrem jest ilość kopii wektora. W tych przypadkach dawka wektora staje się ważne, bo im więcej egzemplarzy klonowanego genu, tym bardziej prawdopodobne jest to, że efekt sklonowanego genu na komórki gospodarza będzie wykryty. pBR327, z wysoką liczbą kopii, jest zatem lepszym wyborem niż pBR322 dla tego rodzaju pracy.

Rodowód wektora pBR322:

-delecja niektórych genów pBR327 powoduje również jego niezdolności do koniugacji i czyni go niekoniugacyjnym plazmidem. Jest to rozwiązanie pożyteczne dla równowagi środowiska biologicznego, gdyż brak koniugacyjności powoduje niemożność transferu plazmidu do komórek w sposób bezpośredni. Przy pracy ze szczególnie gorszymi koloniami, zapobiega to wyhodowaniu szczepu odpornego na antybiotyki w przypadku jakiejś awarii podczas eksperymentu. pBR322 będą w pełni koniugacyjny mógłby stanowić w tym względzie większe zagrożenie

Plazmid pUC8:

Plazmid ten wyhodowany na bazie pBR322 jest używany ówcześnie od wielu badań i ma 3 podstawowe przewagi nad innymi wektorami. Jego struktura powstała poprzez delecje niektórych nukleotydów w strukturze, przez co miejsce ciec zniknęło z genu oporności na ampicylinę, i przeniosło się do genu lacZ'. Pierwsza z nic dotyczy liczby kopii, która jest olbrzymia , nawet przed amplifikacja pUC8 występuje w komórce w ilości 500-700 kopii.

Wydajność ta spowodowana jest losowymi mutacjami nie obejmującymi ori. Druga polega na tym ze inaktywacja insercyjna polega na selekcji biało-niebieskiej o której już mówiliśmy, czyli jest procesem, który można wykonać na 1 płytce, w bardzo szybki sposób.

Trzecia zaleta leży w miejscach ciecia, które mogą być rozpoznawane przez EcoRI i BamHI, przez co fragmenty powstale maja lepkie konce i niep otrzeba do ich użycia ani linkera ani adaptora.

Plazmidy pUC:

Inne wektory pUC maja różne zestawy miejsc ciecia, przez co przerozne molekuly DNA mogą być wprowadzane, co wiecej jeden z nich zaiwera poodbne miejsca co M13, przez co możliwa jest transformacja takiego materiału do postaci jednoniciowej.

Plazmid pGEM3Z:

Ten plazmid jest bardzo podobny do plazmidu pUC, ma geny markerowe, gen lacZ', podobnie rozmieszczone miejsca ciec dla restryktaz, a do tego ma niemal taki sam rozmiar. Różnica polega na tym ze pGEM3Z ma dwa dodatkowe kawlaki DNA, które zawieraja sekwencje rozpoznawane przez polimerazę RNA. Te sekwencje, nazywane promotrowymi leżą po przeciwnych stronach od miejsca ciecia , w które najczesciej wklnoowuje się insert. Oznacza to żę w mieszaninie zawierajacej polimerazę RNA, dojdzie od transkrypcji wprowadzonego genu, gdyż polimeraza rozpozna i ropzocznie proces przpeisywania DNA na RNA. Wyprodukowane RNA może posluzyc jako sonda do hybrydyzacji lub do badań nad procesem transkrypcji, usuwania intronów lub syntezy białek. Owe promotory nioe są promotorami dla tpyowej polimerazy RNA, lecz dla specjalnej polimerazy kodowanej przez faga T7 i dla polimerazy z faga SP6. Obydiwe polimerazy są syntetyzowane in vitro w trkacie eksperymentu klonowania spsosród fagó dodanych do mieszaniny. Są bardoz aktywnymi enzymai, które w ciągu 20 min, jakie zajmuje fagowi cykl lityczny, są w stanie wytworzyc 1-2 mg RNA an minute, czyli wiecej niż standardowe enzymy w komorce E. Coli.

pGEM3Z:

6.2 Wektory oparte na bakteriofagu M13

Najwazniejsza kwestią w wektorach jest ich zdolnosc do replikacji. W plazmidach nie ma z tym problemu, gdyż zawieraja onem iejsca ori które są kompatybilne z mechanizmai replikacji gospodarza. Z bakteriofagami tkaimi jak λ czy M13 sytuacja jest bardziej skomplikowana. Cząsteczka DNA faga zawiera pewne geny konieczne do replikacji czy produkcji bialkowych elemnetow otoczki faga(np. kapsydu), lecz kazda drobna zmiana może powodowac ich uszkodzenie o co nietrudno, gdyż komórka bakterii walczy z genomem bakteriofaga. Dalteog istnieje pewne restrykcje w operowaniu wektorami fagowymi jak i koniecznosc ich modyfikacji w stosunku do zwyklych genomów fagowych.

Jak skonstruować wektor do klonowania oparty na fagu?

Problem zilustrujemy na przykladzie faga M13. Normalny genom M13 liczy 6,4 kb, i stanowi grupe scisle upakowanych genów, klucozwych dla replikacji faga. Istniej lacznie tylko 507-nukleotyowdy odcinek , gdzie moznaby wprowadzic insert. Pierwszym krokiem jest zatem wprowadzenie w tym miejscu genu lacZ', dostaniemy wtedy wektor M13mp1, który będzie produkowal niebieskie lysinki i będzie mogl być znaleziony za pomocą selkecji bialo-niebieskiej. Problem polega na tym ze trzeba stworzyc miejsce cieca w tym genie, aby wprowadzic tam nasz insert - sekwencje która już tam jest - GGATTC, zmienimy na rozpoznawaną przez restryktazę EcoRI - GAATTC, za pomocą mutagenezy ukierunkowanej in vitro, przez co dostaniemy wektor M13mp2. Gen lacZ' zostanie przez to zmieniony, ale jego produkt nadal będzie funkcjonwal sprawnie i pozowli na odróżnienie bialo-niebieskie.

Nastepnym krokiem jest wprowadzenei dodatkowych miejsc restrykcyjnych do genomu. Odbywa się to dzięki wprowadzeniu polilinkerów, które są sztucznie syntetyzowanymi oligonukleotydami, zawierajacymi całą mase miejsc restrykcyjnych, maja również lepkie konce, dzięki czemu latwo mogą być zligowane z M13mp2, w miejscu EcoRI, dajac tym samym cala serie miejsc restrykcyjnych w obrębie genu lacZ'. Tak nowopowstały wektor nosi nazwę M13mp7.

Genom M13:

Konstrukcja M13mp1 i mp2:

Konstrukcja M13mp7:

Polilinker jest zaprojektowant tka aby nadla zachować pełną funkcjonalność genu lacZ'.

Bardziej wyrafinowane wektory takie jak M13mp8, maja wbudowaną cała serie polilinkerów w gen lacZ'. Dzeiki temu po cieciach w tym miejsach mogą być generowane przeróżne lepkie konće, gotowe do zligowania z insertami.

Wekory hybrydowe plazmid- M13

Chcoaz wektroy M13 maja jeszcze jedna zankomitą cechę jaka jest mozliwosc produkcji jednoniocwego kolistego DNA, to mają też poważna wadę - ogranicozne miejsce dla insertu. Inserty nie mogą przekraczać 3 kb. Aby objesc ten problem stworzono wektory hybrydowe, zwane fagemidami.

Wektor hybrydowy pEMBL8:

Przykladem fagemidu jest pEMBL8, który zostal skonstruowany poprzez wprowadzenie do pUC8 fragmentu z M13 o dlugosci 1300 bp. Ten konkretny wbudowany fragment zawiera w sobie sekwencje która sygnalziuje enzymom konwersje fromy dwuniciowej do formy jednoniciowej. Mimo ze fragment ten znajduje się w innym otoczeniu, niż był w formie macierzystej, jest on nadal funkcjonalny po wbudowaniu do plazmidu pUC. Jedyne co jest wymagane to obecność innych fagów M13 w mieszaninie, które staja się fagmai pomocniczymi, dostraczajacymi niezbedne enzymy do replikacji oraz bialka do budowy otoczki. pEMBL8, zaiwrera oczywsice cała reszte pocohdzącą z pUC8, a zatem i dobrze nam znany gen lacZ', dzięki czemu możemy przperowadzic łatwo selkcję biało-niebieską. Z pEMBl8, dzięki jego mozliwosc przejscia do formy jednoniciowej inserty mogą mieć długośc nawet do 10kb.

Wektory oparte na fagu λ:

Dwa problemy musza być rozwiazne zanim stowrzymy wektor oparty na fagu λ.

• pierwszy to wielkosc insertu, jaki można wstawic - niem oze on być wiekszy niż 3 kb, ponieważ całkowita wielkosc DNA λ, nie moze przekroczyc 52 kb, jelsi by przekorczyła takie DNA nie może pakowane in-vitro razem z cala reszta faga, tj. otoczką białkową. Stanowi to psrą limitację, obrazowana an tym rysunku:

• drugi problem spowodwany jest duzym rozmiarem genomu faga λ, przez co zaiwera on mnsotwo przypadkowych sekwencji ropoznawnych przez restryktazy, co może psowodwać pociecie waznych genów które uniemozliwią pozniejsza religację tych fragmentów, przeskodzą w replikacji lub po prstu zniszczą DNA λ. Widac to an tym rysunku:

Widzac te problemy dziwi nas ze mnostwo wektorów λ jest uzywanych i ze w dodatku mogą pomiescic inserty wielkosci 5 do 25 kb, czyli nieosiagalne dla plazmidów czy wektorów M13.

---