Politechnika Wrocławska	INŻYNIERIA BIOREAKTORÓW Kinetyka enzymatyczna - komputery
		Cegła Piotr, 168657 Drozd Aleksandra, 168659 WT, 13.15	Prowadząca: Prof. Jolanta Bryjak Data ćwiczenia: 01.03.2011r.

1. Wstęp teoretyczny

Projektując procesy przemysłowe zachodzące w obecności enzymów ważne jest wcześniejsze określenie parametrów kinetycznych enzymu. Dla enzymów działających zgodnie z kinetyką Michaelisa - Menten są to stałe V_max i K_M. V_max jest maksymalną szybkością z jaką enzym może katalizować daną reakcję, co ma miejsce wtedy, gdy enzym w roztworze jest w pełni wysycony substratem. K_M czyli stała Michaelisa jest stężeniem substratu, dla szybkość reakcji katalizowanej przez enzym jest równa połowie szybkości maksymalnej [Kędryna i wsp., 2001]. Istnieją dwie metody określania parametrów kinetycznych, różniące się już na poziomie projektowania doświadczenia.

W pierwszej z nich wyznaczamy parametry z warunków początkowych szybkości reakcji. Dane do obliczeń uzyskujemy z początkowych etapów reakcji, gdy stopień przereagowania (czyli stosunek stężenia powstałego produktu do początkowego stężenia substratu) jest mniejszy niż 5%, a więc powstały produkt występuje w ilości, która nie jest w stanie spowodować inhibicji.

W ramach tej metody parametry kinetyczne można obliczyć na dwa sposoby. Pierwszym jest użycie regresji liniowej, w której linearyzujemy uzyskane dane, najczęściej przez stworzenie wykresu Lineweavera-Burka. Jest to wykres zależności odwrotności szybkości reakcji od odwrotności stężeń substratu. Dla prostej kinetyki bez inhibicji parametry wyznacza się z przecięcia linii trendu z osiami wykresu. Jednak ten sposób obliczeń opiera się głownie na najmniejszych wartościach stężeń i szybkości, przy których występują największe błędy, w związku sposób ten nie jest często stosowany [Szewczyk, 2005]. W przypadku występowania jednego z rodzajów inhibicji (co jest widoczne na wykresie Michaelisa-Menten odchyleniem punktów od prostej) potrzebna jest regresja nieliniowa. Uzyskane dane wprowadzamy do programu obliczeniowego, (jak na przykład używanego na zajęciach programu OriginPro8), który na podstawie wprowadzonych wcześniej matematycznych formuł wyznaczy szybkość maksymalną, stałą Michaelisa oraz stałą inhibicji.

Wartości wyliczone z warunków początkowych szybkości reakcji można zweryfikować drugą metodą - za pomocą reaktora okresowego. Reaktor okresowy stosowane są do dłuższych procesów, zachodzących z małą wydajnością. Typowa budowa reaktora to zbiornik z mieszadłem, w którym umieszcza się substraty i enzymy, a gdy reakcja dojdzie do oczekiwanego przez punktu następuje jej przerwanie i opróżnienie bioreaktora [Warych, 2004].

Schemat budowy [Warych, 2004]

Przy weryfikacji parametrów kinetycznych w reaktorze okresowym reakcję prowadzimy długo po przekroczeniu warunków początkowych reakcji, aż do całkowitego przereagowania substratu. Następnie uzyskane stężenia wstawiamy do całkowej postaci równania
Michaelisa - Menten i porównujemy wyliczony czas modelowy z czasem eksperymentalnym, co pozwala zauważyć ewentualną inhibicję. Tak uzyskane dane wprowadzamy do programu obliczeniowego wybierając odpowiednią funkcję i otrzymujemy obliczone wartości parametrów.

2. Wykonanie ćwiczenia i obliczenia

1. Wyznaczanie parametrów kinetycznych bez inhibicji.

Z otrzymanych wartości stężenia substancji (C_s) oraz szybkości reakcji (r)wyznaczono wykres Michaelisa-Menten:

Aby wyznaczyć szybkość maksymalną (V_max) oraz stałą Michaelisa (K_m) wyznaczono wykres Lineweavera-Burka:

Na podstawie równania linii trendu określono parametry kinetyczne równania Michaelisa-Menten:

V_max =

= 0,15 [
]

K_m =
=
= 0,60 [M]

Dzięki wyznaczonym parametrom kinetycznym obliczono czas modelowy reakcji z poniższego wzoru (z przykładem obliczenia):

t_model. =
* (K_m*ln
+ C_so - C_s) =
*(0,60*ln
+ 30 - 29,85) = 1,02 [min]

Wyniki otrzymane poprzez obliczenia pokrywają się z wynikami otrzymanymi z weryfikacji czasu reakcji w reaktorze okresowym. Zależności czasów przebywania od stężenia substratu przedstawione zostały na poniższym wykresie:

2. Wyznaczanie parametrów kinetycznych z inhibicją substratową.

Z podanych wartości stężeń substratu i szybkości reakcji wyznaczono wykres Michaelisa-Menten:

Wyznaczono również wykres Lineweavera-Burka:

Ponieważ zauważono nieprawidłowości w wykresie stworzonym w oparciu o podane wartości, stwierdzono występowanie inhibicji substratowej. Zaistniała konieczność wyznaczenia trzeciego parametru kinetycznego, czyli stałej inhibicji K_is. Do obliczeń wszystkich trzech parametrów kinetycznych wykorzystano program OriginPro8, który wykorzystuje do obliczeń regresję nieliniową. Oto otrzymane wyniki:

V_max = 0,15 ± 1,227*10^-16 [M/min]

K_m = 0,60 ± 1,595*10^-15 [M]

K_is = 50 ± 1,557*10^-13 [M]

Na ich podstawie obliczono modelowy czas reakcji z całkowej postaci równania Michaelisa-Menten, uwzględniającej stałą inhibicji (przykład):

t_model. =
* (K_m*ln
+ C_so - C_s + (
)*(C_so² - C_s²) =
*(0,60*ln
+ 30 - 29,85 + (
)*(30²-29,85²) = 1497,27 [min]

Na poniższym wykresie została przedstawiona zależność czasu modelowego oraz czasu z reaktora okresowego od stężenia substratu:

3. Wyznaczanie parametrów kinetycznych reakcji w obecności izoenzymów

Wyznaczenie parametrów za pomocą regresji liniowej:

Z otrzymanych danych wyznaczono wykres Michaelisa-Menten, aby sprawdzić, czy nie wystąpiła inhibicja:

Nie stwierdzono inhibicji, wobec tego wyznaczono kolejną zależność, tym razem zależność r/C_s od r:

Na powyższym wykresie można było zauważyć dwa obszary, dla których możliwe było wyznaczenie dwóch różnych linii trendu, co wskazywało na występowanie dwóch izoenzymów.

Kolejnym krokiem było wybranie kilku punktów wykresu o dużej wartości stężenia substratu, które układają się w przybliżeniu w linię prostą, dzięki czemu wyznaczono parametry r₁, V_2max oraz K_2m.

Przykłady obliczeń:

V_2max=
=
= 0,50 [M/min]

K_2m =
=
= 0,63 [M]

r ₁= r -
= 0,063 -
= 0,044 [M/min]

Wartości V_1max, K_1m oraz r₂ wyznaczono w taki sam sposób. Wyniki:

V_1max = 0,152 [M/min]

K_1m = 0,06 [M]

r₂ = 0,019 [M/min]

Ostatecznie można było zauważyć, że szybkość reakcji jest wypadkową szybkości reakcji obu izoenzymów, co ilustruje poniższy wykres.

Wyznaczenie parametrów za pomocą regresji nieliniowej:

Do wyznaczenia parametrów kinetycznych za pomocą regresji nieliniowej użyto programu OriginPro8. Oto otrzymane wyniki:

V_1max = 0,2 ± 9,858*10^-16 [M/min]

K_1max = 1,5 ± 1,292*10^-14 [M]

V_2max = 0,3 ± 1,043*10^-15 [M/min]

K_2m = 0,1 ± 5,739*10^-16 [M]

4. Wyznaczenie parametrów kinetycznych reakcji, gdy inhibitorem jest produkt reakcji.

Na początek wyznaczono czas przebywania nie uwzględniając inhibicji (jak w zwykłym równaniu Michaelisa-Menten). Wartości parametrów przyjęto takie same jak w podpunkcie 1szym, tj. Wyznaczanie parametrów kinetycznych bez inhibicji (V_max=0,15[M/min], K_m=0,6[M]).

Weryfikacja w reaktorze okresowym wskazuje jednak, że inhibitorem jest produkt reakcji, ponieważ wraz ze wzrostem stężenia produktu czas reakcji znacznie się wydłuża. Zostało to przedstawione na poniższym wykresie:

Za pomocą regresji nieliniowej wyznaczono trzy parametry kinetyczne reakcji: V_max, K_m oraz K_ip.

Otrzymano następujące wyniki:

V_max = 0,15 ± 523,844 [M/min]

K_m = 0,5 ± 106203,466 [M]

K_ip = 0,4 ± 177799,602 [M]

Pomimo tak dużego odchylenia standardowego, modelowy czas reakcji wyszedł bardzo podobny do zmierzonego czasu w reaktorze okresowym:

Przykład obliczenia modelowego czasu reakcji:

t_model. =
*(K_m*(1+
)*ln(
)+(1 -
)*(C_so - C_s) =
*(0,5*(1+
)*ln(
)+(1 -
)*(30-29,85) = 1,41 [min]

Na poniższym wykresie przedstawiono zależność czasu modelowego oraz czasu w reaktorze okresowym od stężenia substratu:

3. Omówienie wyników

Obie poznane na zajęciach metody pozwalają na obliczenie parametrów kinetycznych reakcji. Każda z nich ma jednak swoje zastosowania, zalety oraz wady. W metodzie z warunków początkowych szybkości reakcji parametry kinetyczne można obliczać za pomocą linearyzacji tylko w przypadkach, kiedy nie występuje inhibicja. Regresja liniowa pozwala jedynie zauważyć występowanie inhibicji, jednak do określenia jej stałej potrzebna jest regresja nieliniowa. W przypadku występowania izoenzymów regresja liniowa wymagałaby kilkuetapowego obliczania parametrów, co jest procesem pracochłonnym. Regresja nieliniowa znacznie ułatwia obliczenia, gdyż wymaga tylko wartości inicjacyjnych.

Weryfikacji w reaktorze okresowym można dokonać jedynie za pomocą regresji nieliniowej. Metoda da ma duże wartości aplikacyjne, ale potrafi „zgubić” niektóre wartości.

Dla prostych przypadków można używać obu metod, jednak występowanie inhibicji, działanie izoenzymów i inne nieprzewidziane, zachodzące podczas reakcji zjawiska wymagają dostosowania metody do przetwarzania uzyskanych danych.

Literatura:

1. Kędryna T., Gałka-Walczak M., Ostrowska B., Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej z ćwiczeniami, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, 2001

2. Szewczyk K. W., Bilansowanie i kinetyka procesów biochemicznych, Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, 2005

3. Warych J., Aparatura chemiczna i procesowa, Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, 2004

C_s

r

1/r

1/C_s

r r

C_s

1/r

1/C_s

r

C_s

r

r/C_s

C_s

C_s

C_s

---