2013/14 sem. letni
Wyznaczanie stałych równania kinetycznego reakcji hydrolizy sacharozy
(inwertaza)
Cel ćwiczenia: zapoznanie się z procedurą postępowania przy wyznaczaniu stałych równania
kinetycznego
MATERIAŁY I METODY
Materiały
- inwertaza otrzymana nieodpłatnie z firmy Novozyme;
- 2 M roztwór sacharozy;
- 0.1 M bufor octanowy, pH 4.5;
- odczynnik do oznaczania stężenia glukozy – odczynnik I
Aparatura specjalna
- spektrofotometr UV-VIS Shimadzu;
- termostatowane reaktory mieszalnikowe
Metody
Przygotowanie roztworów
Substrat. Do cylindra miarowego na 100 ml wprowadzić 50 ml 2M sacharozy (roztwór 1),
dodać 50 ml 0.1 M buforu octanowego i dobrze wymieszać (roztwór 2). Następnie 50 ml
świeżo przygotowanego roztworu wlać do kolejnego cylindra miarowego i uzupełnić
buforem do 100 ml (roztwór 3). Analogicznie przygotować roztwory 4 i 5 przez 2-krotne
rozcieńczenie roztworu poprzedzającego. Kolejne 4 roztwory przygotować przez 3-krotne
rozcieńczenia (15 ml roztworu sacharozy + 30 ml buforu). Należy pamiętać o dokładnym
wymieszaniu roztworów.
Enzym. Przygotować 20 ml roztworu wyjściowego inwertazy o stężeniu 1 mg/ml w 0.1 M
buforze octanowym. Dobrze wymieszać. Przygotować przez rozcieńczenie 2 roztwory
enzymu:
I – do badań kinetycznych – 25x (2 ml E + 48 ml buforu);
II – do procesu w reaktorze okresowym – 4x (2,5 ml E + 7,5 ml buforu).
Oznaczanie stężenia glukozy testem enzymatycznym.
Zasada metody. Glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej utlenia się do kwasu
glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Ten ostatni reaguje w obecności
peroksydazy z kwasem hydrobenzoesowym (HBA) i 4-aminoantypiryną (AAP) tworząc
czerwony barwnik chinonoiminę, którego intensywność zabarwienia mierzona przy długości
fali 500 nm jest wprost proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce.
Glukoza + O
2
+ H
2
O
kwas glukonowy +H
2
O
2
H
2
O
2
+ HBA + AAP
chinonoimina + 4 H
2
O
Odczynniki: Odczynnik I (składniki aktywne: oksydaza glukozowa, peroksydaza, AAP,
HBA, bufor fosforanowy), stabilizowany standard glukozy 15 mM.
Oznaczanie stężenia glukozy. Do suchych i czystych probówek wprowadzić po 1 cm
3
odczynnika do oznaczania glukozy. Przygotować również 4 probówki na standardy
glukozowe i kontrolę (próbkę do zerowania aparatu). Z reaktorów pobierać próbki po 10 ul
(lub 50 ul w przypadku reaktora 8 i 9) i dozować je bezpośrednio do probówek
zawierających odczynnik I. Analogicznie postąpić ze standardami i kontrolą (próbka do
zerowania aparatu). Każdorazowo kilkakrotnie przepłukać końcówkę odczynnikiem I.
Probówki pozostawić przez 5 min w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni, a następnie
zmierzyć absorbancję (500 nm) wobec próby kontrolnej (1 ml odczynnika I + 10 ul 0,1 M
buforu octowego pH 4,5).
Obliczanie stężenia glukozy. Wartości absorbancji dla 3 standardów glukozy uśrednić i
przyjąć, że C
śr
= 7,5 mM. Z proporcji obliczyć stężenie w próbkach badanych, a otrzymane
wartości pomnożyć przez (ewentualne) rozcieńczenie. W efekcie otrzymuje się stężenie
glukozy w mM roztworu reakcyjnego.
Pomiar zmiany stężeń reagentów w początkowych etapach reakcji.
Przygotować roztwory sacharozy o stężeniach:
Nr reaktora
1
2
3
4
5
6
7
8
9
C
sacharozy
[M]
2,0
1,0
0,5
0,25
0,125
0,0417 0,0139 0,0046 0,0015
Do termostatowanych (35
C) reaktorów mieszalnikowych wprowadzić po 20 cm
3
przygotowanych roztworów, włączyć mieszanie i zamknąć korkiem. Po 10-15 min
preinkubacji do reaktorów wprowadzić kolejno dokładnie po 4 ml roztworu enzymu (I),
włączając jednocześnie stoper. Po 10-15 sec pobrać z reaktora dokładnie 10 ul (lub 50 ul)
mieszaniny reakcyjnej i dodać do probówki zawierającej 1 cm
3
odczynnika I. Probówkę
zamieszać i wstawić na 5 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni. Kolejne próbki do
Oksydaza glukozowa
Peroksydaza
analiz pobierać po 1, 2, 3, 4 i 5 minucie lub po 2, 4, 6, 8 i 10 min (dla roztworów (1), (2) i
(3)).
Pomiar zmiany stężenia glukozy podczas procesu hydrolizy sacharozy
Do
termostatowanego
(35
C) reaktora mieszalnikowego wprowadzić 20 cm
3
przygotowanego roztworu substratu nr 5, włączyć mieszanie i zamknąć korkiem. Po 10-15
min preinkubacji do reaktora wprowadzić 4 ml roztworu enzymu (II), włączając jednocześnie
stoper. Po 10-15 sec pobrać z reaktora 0,1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodać do probówki
zawierającej 0,4 cm
3
0,1 M buforu octowego o pH 4,5 (5-krotne rozcieńczenie próbek).
Probówkę zamieszać i pobrać z niej 10 ul i postępować jak opisano wcześniej. Kolejne
próbki do analiz pobierać po 5, 10, 15, 20 min, a następne co 10 min. Uwzględnić 5-krotne
rozcieńczenie próbki pobranej z reaktora.
Sprawozdanie winno zawierać: wstęp (np. o enzymie, jego wykorzystaniu w przemyśle),
metodykę (należy pamiętać o formie bezosobowej np. dodano, zmierzono...), przykładowe
obliczenia, wyniki i dyskusję wyników.
Uwaga! Enzymatyczna metoda oznaczania stężenia glukozy jest mikrometodą. Zlewki,
cylindry, probówki, itd. należy przed myciem przepłukać wodą z kranu, następnie
umyć wodą z dodatkiem niewielkiej ilości “Ludwika”, po czym płukać dużą ilością
wody z kranu (15x) i 3x wodą destylowaną. I należy pamiętać, że wszystko ma też
powierzchnię zewnętrzną. Ponieważ wszystkie grupy ćwiczeniowe korzystają z tego
samego szkła, nieuwaga 1 osoby może być przyczyną złych wyników grup następnych.
Konsekwencje braku utrzymania odpowiedniej czystości szkła laboratoryjnego: kłopoty
z wyznaczeniem stałych równania kinetycznego, brak możliwości symulacji procesu w
reaktorze okresowym, problemy z oceną z ćwiczeń.
Zagadnienia na kartkówkę:
1.
Rodzaje inhibicji i jak zmieniają się parametry kinetyczne.
2.
Założenia potrzebne do wyprowadzenia równania M-M.
3.
Równanie Michaelisa-Menten.
4.
Znajomość instrukcji.
5.
Proszę przynieść kalkulatory!
