ĆWICZENIE 6
Kataliza enzymatyczna. Chemiczny i biochemiczny rozkład polisacharydów
Oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wohlgemuta
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest porównanie skuteczności i warunków procesu rozkładu skrobi. Porównanie polega na obserwacji procesów: chemicznego (pod wpływem ogrzewania w środowisku silnie kwaśnym) i enzymatycznego(w obecności amylazy zawartej w ślinie)
Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wohlgemuta
Zasada:
Za jednostkę wzorcową aktywności przyjmuje się w tej metodzie taką ilość enzymu, która w czasie 30 min. rozkłada do stadium achrodekstryn 1 mg skrobi. Wynik podaje się w mililitrach roztworu 0,1 % skrobi rozłożone w czasie 30 min przez 1 ml śliny.
UWAGA: Rozpad cząsteczek skrobi przebiega przez trzy stadia pośrednie:
1. stadium dekstryn, wśród których tworzą się kolejno:
amylodekstryny - barwią się z jodem na niebiesko-fiołkowo
erytrodekstryny - barwią się z jodem na czerwono
achrodekstryny - nie barwią się z jodem
2. stadium maltozy
3. stadium glukozy.
Ostatecznym produktem rozkładu skrobi jest glukoza.
Wykonanie:
Do 1 ml śliny dodać 4 ml buforu cytrynowo-fosforanowego i wymieszać.
W statywie przygotować 10 probówek
Do pierwszej z nich odmierzyć 4 ml sporządzonego uprzednio roztworu śliny a do następnych po 2 ml buforu cytrynowo-fosforanowego
Z pierwszej probówki pobrać 2 ml roztworu i przenieść do probówki drugiej. Wymieszać!
Z drugiej probówki pobrać 2 ml r-ru i przenieść do trzeciej. Wymieszać! itd. ...
Z 10 probówki pobrać 2 ml i odrzucić.
Otrzymuje się w ten sposób następujące rozcieńczenia śliny:
1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560, co odpowiada następującym ilościom śliny w probówkach: 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 0,0125; 0,006 ml.
Do każdej probówki dodać po 2ml 0,2 % roztworu skrobi w 0,9 % NaCl (jony chlorkowe są aktywatorami amylazy)
Zawartość wszystkich probówek dokładnie wymieszać i pozostawić na 5 min.
Po upływie 5 min do każdej probówki dodać po 3 krople jodu w jodku potasu, zaczynając dodawanie od probówki zawierającej ślinę najbardziej rozcieńczoną (ostatniej w szeregu) i pozostawić na 30 min.
Zaobserwować, w której probówce reakcja z jodem będzie ujemna (stadium achrodekstryn)
Obliczyć aktywność amylazy śliny wyrażając ją liczbą równą ilości ml 0,2 % roztworu skrobi rozłożonego w czasie 30 min.
Przykład obliczeń:
Przypuśćmy, że stadium achrodekstryn wystąpiło w probówce 4. Ilość skrobi w tej probówce równa jest 2 ml. Czyli w probówce 4 nastąpił rozkład 2 ml roztworu skrobi po czasie 30 min.
Ponieważ próba ta zawierała 0,05 ml pierwotnej śliny otrzymujemy proporcję:
0,05 ml śliny rozkłada - 2 ml roztworu 0,2 % skrobi
1,0 ml śliny rozkłada - x ml skrobi
x = 2 : 0,05 = 40
Czyli 1 ml śliny rozłoży 40 ml roztworu skrobi. Aktywność amylazy wynosi więc 40 jednostek.
3. Kwasowa hydroliza skrobi:
Wykonanie:
Przygotować 20 probówek ustawiając je w dwóch szeregach. Do pierwszego szeregu wprowadzić po jednej kropli rozcieńczonego roztworu jodu w jodku potasu.
W zlewce przygotować roztwór: 45 ml kleiku skrobiowego + 18 ml 2n kwasu siarkowego. Dobrze wymieszać.
Do pierwszych 2 probówek stojących naprzeciw siebie wprowadzić po 1 ml uprzednio przygotowanego roztworu kleiku skrobiowego z kwasem.
Pozostałą zawartość zlewki ogrzewać do wrzenia i co 90 sek. pobierać po 2 ml płynu i rozlać jak poprzednio do 2 probówek. Pobieranie prowadzić do momentu zaniku barwy z jodem.
W probówkach zawierających jod wyróżnić kolejne stadia hydrolizy skrobi.
Poprosić prowadzącego o wytypowanie probówek z produktami hydrolizy skrobi dla których wykonana zostanie reakcja Fehlinga.
Zawartość wytypowanych probówek zobojętnić NaOH (papierek wskaźnikowy) i wykonać reakcję Fehlinga, uchwycić moment kiedy reakcja ta wypada dodatnio i zaobserwować wzrastającą wydajność tej reakcji w trakcie przebiegu hydrolizy.
Wykonanie reakcji Fehlinga: W probówce (czystej) zmieszać 1 ml roztworu Fehlinga I i 1ml roztworu Fehlinga II. Przygotować cztery probówki z mieszaniną roztworów Fehlinga. Zawartość probówek (z roztworami Fehlinga i zobojętnionym roztworem kleiku skrobiowego) ogrzać do wrzenia. Obydwa roztwory zlać razem. Zaobserwować występujące zabarwienie.
W sprawozdaniu opisać i porównać obydwa procesy, zanotować obserwacje i wyciągnąć wnioski (kolory i produkty rozkładu).