Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa

Im. Prezydenta Stanisława Wojciechowskiego w Kaliszu

Instytut Politechniczny - Inżynieria Środowiska

Specjalizacja - Wentylacja i klimatyzacja

Technika wykonywania preparatów mikroskopowych

Wykonała:

Marta Nasidłowska

Prowadzący zajęcia:

Mgr Barbara Sencio

Biologiczny preparat mikroskopowy jest to część tkanki organicznej przygotowana do obserwacji mikroskopowej. Sposób preparowania próbki zależy od rodzaju mikroskopu i celu badań.

Cechy preparatu:

Preparat przeznaczony do badania mikroskopem optycznym powinien spełniać następujące warunki:

• Powinien być bardzo cienki z dwóch powodów:

- przezroczystości dla światła,

- nie nakładania się struktur z różnych warstw preparatu.

• Powinien być trwały mechanicznie - nie wysychać, nie kurczyć się, nie pękać.

• Powinien być trwały biologicznie - nie ulegać biodegradacji np. z powodu grzybów, bakterii.

Etapy obróbki:

Aby spełnione były powyższe wymagania, badany obiekt musi zostać:

• pocięty na cienkie plastry (ręcznie lub za pomocą mikrotomu). Jedynie drobne obiekty biologiczne (np. mikroorganizmy, niewielkie bezkręgowce, pyłek roślin, zarodniki) są badane w całości;

• wysuszony lub woda powinna być zastąpiona substancją neutralną biologicznie, bądź substancją o właściwościach bakterio- i grzybobójczych;

• w razie konieczności wybarwiony, w celu uwidocznienia naturalnie przejrzystych struktur biologicznych lub dla poprawienia kontrastu;

• umieszczony na szkiełku podstawowym i nakryty szkiełkiem nakrywkowym. Szkiełko nakrywkowe często jest hermetycznie przyklejone do podstawowego, aby odizolować preparat od wpływu otoczenia. Zamiast stosowania dwóch oddzielnych szkiełek, używa się również slajdów, czyli szkiełek sklejonych fabrycznie. Slajdy mogą być napełniane płynnym preparatem, po czym uszczelniane.

Proste preparaty, przeznaczone do niezbyt dużych powiększeń, mogą być przygotowywane ręcznie przy pomocy skalpela i typowych odczynników chemicznych (parafina, wosk, barwniki). Przy bardzo małych powiększeniach można nawet zrezygnować z całego procesu preparacji i umieścić próbkę na szalce Petriego. W przypadku bardziej zaawansowanych obserwacji mikroskopowych, do przygotowania preparatów mikroskopowych służy specjalny przyrząd - mikrotom.

Metody barwienia komórek w preparatach:

Barwienie komórek ma na celu ułatwienie obserwacji ich kształtu oraz odróżnienia ich od innych elementów preparatu. Jest to proces fizykochemiczny.

Podział metod barwienia:

*Barwienie proste-w tym barwieniu stosujemy jeden barwnik, błękit metylenowy lub fuksynę, fiolet goryczkowy i krystaliczny. Barwniki stosuje się najczęściej w postaci nasyconych roztworów alkoholowych.
Do tego barwienia należy przygotować preparat wysuszony na powietrzu i utrwalony.

*Barwienie złożone-stosujemy tu dwa lub więcej barwników. Przy tym barwieniu stosuje się często zaprawy.

*Metoda Grama - metoda barwienia bakterii. Pozwala doświadczalnie zróżnicować te organizmy na dwie duże grupy (Gram-dodatnie i Gram-ujemne) ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej.

*Bakterie Gram-ujemne (w skrócie G-) to bakterie barwiące się na czerwono w barwieniu metodą Grama.

W budowie komórki bakterii G-, w przeciwieństwie do Gram-dodatnich, wyróżnia się zewnętrzną błonę komórkową. Ściana komórkowa bakterii G- jest cieńsza, zawiera mniej warstw peptydoglikanu (mureiny).

*Bakterie Gram-dodatnie, G+ - bakterie barwiące się na niebiesko w barwieniu metodą Grama.

W budowie komórki bakterii G+, w przeciwieństwie do Gram-ujemnych, nie wyróżnia się zewnętrznej błony komórkowej. Ściana komórkowa bakterii G- jest cieńsza od bakterii G+.

*Barwienie negatywne bakterii, polegające na barwieniu tła, a bakterie pozostają niezabarwione,
oraz

*Barwienie pozytywne, polegające na barwieniu bakterii, z których przygotowany jest preparat.

*Barwienie negatywno-pozytywne- jest to kombinacja tych dwóch barwień. Polega to na stosowaniu jednego z wymienionych przy metodzie negatywnej barwników gruboziarnistych.

*Barwienie przyżyciowe - barwienie żywych komórek, lub tkanek barwnikami, które nie są dla nich toksyczne. Barwienie to umożliwia badanie struktury żywych komórek oraz obserwację dynamicznych procesów w nich zachodzących, unikając zaburzeń spowodowanych śmiercią komórek i procesami po niej następującymi.

Technika każdego barwienia polega na pokrywaniu szkiełka podstawowego z naniesionym i utrwalonym preparatem-barwnikiem na określony czas, a następnie spłukiwaniu poszczególnych barwników wodą przed nalaniem następnych. Czasami w zależności od przepisu stosuje się także takie substancje jak alkohol, czy płyn Lugola, a także podgrzewanie preparatu nad palnikiem. Preparat po wysuszeniu obserwuje się pod imersją. Wyróżnić można także barwienie bakterii przeżyciowe (rzadkie) i pośmiertne (częściej stosowane).

---