Wykład 1

Agar- nie upłynnia się w temp. 37⁰C (cieplarki do rozmnażania= temperatura ciała ludzkiego)

Hemoliza krwinek czerwonych- bakterie wytwarzają toksyny z hemolizynami

Podłoże do hodowli= agar+ substancje odżywcze (liofilizowane)

Sterylizacja- zabijanie wszystkich form drobnoustrojów: wirusy, grzyby, formy wegetatywne i przetrwalnikowe

Mikroskop elektronowy- powiększenie 30000x

Krótki rys historyczny

1500 r.- to co powoduje chorobę= TWORY ŻYWE

1695 r.- Antoni van Ieenvenhoek (podobno widział bakterie)

1822- 1895- Ludwig Pasteur: twórca mikrobiologii; choroby zakaźne; szczepionki; podłoża;

immunologia i fizjologia; podłoża stałe

1843- 1910- Robert Koch: mikroskop optyczny; wyhodował prątki gruźlicy; cholera; wąglik

1877- 1912- . Lister: antyseptyka

1929- Fleming: antybiotyki (1940- penicylina)

1931- mikroskop elektronowy

XIX- XX w- Nencki, Bujmid, Denysz, Adamski, Padlewski……

Biotechnologia:

1865- Mendel- przekazywanie cech dziedzicznych

1869- Misches- izolacja kwasu nukleinowego

1910- Thomas Hunthorgen- chromosomy, nośniki genów, początki genetyki

1953- Watson i Crick- podwójna helisa DNA

1970- PCRC, łańcuchowa reakcja polimerazy

Budowa anatomiczna komórki bakteryjnej:

1. Rzęski

2. Fimbrie

3. Otoczki

4. Śluz powierzchniowy

5. Ściana komórkowa

1. Bakterii Gram +

2. Bakterii Gram -

6. Przestrzeń pery plazmatyczna

7. Błona cytoplazmatyczna

8. Mezosomy

9. Rybosomy

10. Nukleoid

11. Cytoplazma

12. Wtręty cytoplazmatyczne

13. Przetrwalniki

Wtręty cytoplazmatyczne

1. Kwas β- hydroksymasłowy

2. Polifosforany metachromatyczne

3. Wielocukrowe

4. Tłuszcze

5. Inkluzje siarki

Przetrwalniki

• Wytwarzane przez ok. 150 gatunków bakterii, głównie z rodzaju Bacillus (laseczki tlenowe) i Clostridium (laseczki beztlenowe)

• Proces tworzenia przetrwalników to sporulacja

• Proces tworzenia rozpoczyna się zagęszczeniem cytoplazmy wokół nukleoidu, tworzenie się błony cytoplazmatycznej i wielowarstwowej ściany peptydo- glikonowej

• W przetrwalniku prawie ustają procesy metaboliczne, uwalniają się z komórek

• Bardzo oporne na działanie czynników fizycznych i chemicznych

• Mogą przeżywać w postaci spoczynkowej setki, a może i tysiące lat

Mezosomy

• Wewnątrzkomórkowe struktury błoniaste

• Woreczek będący inwaginacją błony cytoplazmatycznej

• Połączone z błoną cytoplazmatyczną

• Działają prawdopodobnie jako odpowiednik mitochondriów

• Biorą udział w transporcie elektronów

• Są centrum biosyntezy kwasów tłuszczowych

• Służą jako miejsce zakotwiczenia nukleoidu, mają wpływ na replikację materiału jądrowego

• U bakterii Gram + odgrywają rolę w tworzeniu przegrody; to jest w tworzeni ściany komórkowej

• Biorą udział w przenoszeniu części DNA do powstającego przetrwalnika

Rybosomy

• Znajdują się w cytoplazmie bakteryjnej w liczbie powyżej 10000/ komórkę

• Mogą tworzyć agregaty- polirybosom

• Centrum syntezy białek

• Budowa: 70% RNA i 30% białko

Nukleoid

• Nić kwasu dezoksyrybonukleinowego, będąca podwójną spiralą nici DNA

• Długość wynosi ok. 2μm i jest ciasno zwinięta w komórce

• Zawiera informację genetyczną dotyczącą podstawowych funkcji życiowych

• Podział jest synchronizowany z podziałem komórki

• Składa się z genów

Błona cytoplazmatyczna

• Błona selektywnie przepuszczalna, trójwarstwowa

• Zbudowana z białka i lipidów

• Lokalizacja enzymów transportowych (permeaz)

• Enzymy uczestniczące w biosyntezie ściany komórkowej

Ściana komórkowa

Bakterii Gram +	Bakterii Gram -
60- 100% peptydoglikanu; Polimery N- acetyloglukozaminy i kwasu N- acetylomuraminowego	Peptydoglikanu
Kwasy tajchojowe- ribitolowy, glicerolowy	Fosfolipidy, białka (poryny)
Kwasy mykolowe	Glikolipidy, lipid A
białka	Lipo polisacharyd (LPS)- endotoksyna Hetero dimer: Lipid A Oligocukier rdzeniowy Wielocukier, białko

Biologiczna rola ściany komórkowej

• Nadaje określony kształt

• Aktywność żywic jonowymiennych

• LPS- warunkuje chorobotwórczość; np. endotoksyna, antygen 0

składnik	Gram +	Gram -
LPS	-	+
Lipoproteiny	-	+
Białko	-	+
Lipidy	2%	10- 20%
Kwas tajchojowy	+	-
Polisacharyd	Więcej	Mniej
glikopeptyd	dużo	mało

Otoczki właściwe i śluz powierzchniowy

Na powierzchni wielu bakterii występuje warstwa śluzowa, nie związana z komórką. Jest dobrze rozpuszczalna w wodzie i ma lepkość większą od otoczki.

Otoczki

Mogą być wielocukrowe, np. u Streptococcus pneumoniae; polipeptydowe, np. B. anthracis; wielocukrowi- polipeptydowe, np. B. megaterium, B. subtilis. Zdolność do syntezy materiału otoczkowego jest genetycznie uwarunkowana.

Otoczka nie jest niezbędna do normalnego rozwoju. U niektórych bakterii otoczki wykazują różnice serologiczne, np. Str. pneumoniae, E. coli, Klebisiella, Haemophilus influenzae.

Biologiczna rola otoczek i śluzu powierzchniowego:

• Ochrona przed wysychaniem

• Ułatwienie adhezji

• Ochrona przed fagocytozą

• Ochrona przed bakteriofagami

• Czynnik chorobotwórczości bakterii

Rzęski

• Umożliwiają ukierunkowany ruch komórek

• Są to długie, puste w środku nicie o długości kilka razy większej od długości komórki

• Wyróżniamy bakterie jednorzęse, dwurzęse, czuborzęse, okołorzęse

• Wytwarzanie rzęsek jest cechą gatunkową

• Zbudowane są z białka- flageliny (antygen H), można wyróżnić kilka antygenów rzęskowych w rzęskach jednego gatunku bakterii

• Bakterie wykazują zjawisko chemotaksji, dzięki nim mogą poruszać się w kierunku substancji odżywczych oraz oddalać się od substancji szkodliwych

Fimbrie

• Liczba na komórkę wynosi od kilku do kilkunastu na jedną komórkę, mogą występować 2 (lub więcej) typy jednocześnie

• Wytwarzane przez liczne gatunki Enterobacteriaceae, Pseudomonas

• Wyróżnia się:

• Fimbrie pospolite- determinowane przez geny chromosomu

• Fimbrie płciowe- determinowane przez plazmidy zakaźne; biorą udział w koniugacji

• Zbudowane z białka piliny w kształcie rurki, pełnowartościowe antygeny

• Właściwości adhezyjne

Porównanie

	bakterie		wirusy
wielkość	10 μm		<0,01 μm
Widzialność	Mikroskop świetlny		Mikroskop elektronowy
Przesączalność	-		+
Budowa komórki	Skomplikowana		prosta
Hodowla podłoża sztuczne	+		-
Wrażliwość na antygeny	+		-
immunogenność	umiarkowana		duża
Kwas nukleinowy	RNA i DNA	RNA lub DNA

Różnice fizjologiczne

cecha	Gram +	Gram -
Zapas wolnych aminokwasów	Duży	Mały/ brak
Wrażliwość na penicylinę	Duża *	Mała **/*
Lizozym	+ *	-**
Detergenty	+	-
Barwniki	+	-
mydła	+	-
*- protoplast **- sferoplast

Wykład 2




Wirus- winion










































Przetrwalnik (endospora)



















Fag




Skład chemiczny bakterii:

Woda 73- 86%

Sucha masa 14- 27%

W tym białka 42- 63% s.m.

RNA ok. 15% s.m. DNA ok. 2% s.m.

Lipidy 3- 23% s.m. Wielocukry ok. 10% s.m.

Przetrwalniki

Zarodniki

Ziarnistości: woluty nowe, lipidowe, węglowodanowe

Protoplasty- komórki bakterii Gram + pozbawione ściany komórkowej

Sferoplasty- komórki bakterii Gram - pozbawione ściany komórkowej

Skład chemiczny wirusów:

Woda 70- 85%

Białko 42- 92%

Polisacharydy 0- 16%

Lipidy 0- 60%

DNA 4- 14% (tylko wirusy DNA)

RNA 1- 50% (tylko wirusy RNA)

Klasyfikacja bakterii:

Rodzina Enterobacteriaceae; Microcaceae

Rodzaj Escherichia; Staphylococcus

Gatunek Escherichia coli; Staphylococcus ureus

Szczep 012 B6; MRSA (oporne na metacylinę)

Hipoteza prionów

Białkowe cząstki infekcyjne są czynnikami etiologicznymi encefalopatii gąbczastych- CJD (choroba Creutzfelda- Jacoba)

Prusiner- Nobel 1997

Choroba wściekłych (szalonych) krów, rozmiękczanie mózgu

Inaktywacja prionów:

• Para 134⁰C przez 1 h

• NaOH 1M- 24h

• 5% podchloryn sodu- 24h

• 3% siarczan dodecylu 100⁰C- 10 minut

• 6M izotiocyjanian guanidyny przez 15 minut

NIE!!! Etanol, H₂O₂, aldehyd glutarowy, fenol, tlenek etylenu, formalina, 121⁰C przez 20- 30 minut, jodoform, kwas nadoctowy

Klasyfikacja tkanek:

Klasa
I wysoka zakaźność	Mózg, rdzeń kręgowy, gałka oczna
II umiarkowana zakaźność	Jelita, węzły, śledziona, przysadka, nadnercza
III bez zakaźności	Śluzówki, wątroba, płuca, trzustka, grasica
IV bez zakaźności	Serce, nerki, jajniki, mięśnie gładkie, kości, skóra, mocz, ślina

Rozwój/ wzrost bakterii







Faza I- spoczynkowa, adaptacyjna

Faza II- intensywny podział, wzrost logarytmiczny

Faza III- stacjonarna, niezmienna (zmętnienie podłoża)

Faza IV- spadkowa, spoczynkowa (starość)

Podłoża stałe- ruch własny 50- 80 km/ h, Browna, „kropla wisząca”

Podłoża płynne- urzęsienie

Taksje: - chemo; - aero; -foto; -magneto

Zapotrzebowanie wzrostowe:

	Podłoże zwykłe	Hodowla kom.	Organizm zw.	Organizm czł.
Bakterie	+	+	+/-	+
Krętek blady	-	-	+/-	+
Prątki trądu	-	-	-	+
Grzyby	+	+	+/-	+
Riketsje	-	+	+/-	+
Mikoplazmy	+	+	+	+
wirusy	-	+/-	+/-	+

Zawartość niektórych witamin w μm/ 1 g suchej masy

witamina	bakterie	drożdże	glony
Tiamina	≤132	3- 90	<18
Ryboflawina	≤350	40- 80	≤50
Biotyna	0,5- 2,5	0,2- 3,6	0,1
B12	3- 5	<0,3	6,3
PABA	100	10- 180	-
Kw. pantotenowy	100	10- 150	-

Temperatura a rozwój bakterii

bakterie	Temp. minimalna	optimum	Temp. maksymalna
Psychrofilne	0	10- 20	Ok. 30
Mezofile	10	24- 40	0k. 45
Termofilne	40	50- 55	Ok. 70
Hipertermofilne- do 100^0C, a nawet > 150^0C

Hipotermofilne <0⁰C, np. -30, a nawet - 100⁰C (temp. konserwująca drobnoustroje)

Tlen

pH 4,0- 8,0 (2,0- 9,5)

przy pH= 4,2 grzyby najlepiej tworzą alkohol


Helicobacter pyroli pH 2 (żołądek)



















2 5 7 10

Porównanie

	endotoksyny	egzotoksyny
Źródło	Gram ujemne	Gram dodatnie i ujemne
Skł. Chemiczne	LPS	Białko
Antygen	LPS	Białko
Toksyczność cząstek	Lipid A	?
Temperatura	Stabilna	Labilna
Swoistość	Brak	Tak
Uwalnianie z komórki	liza	aktywne

Efekty biologiczne endotoksyn:

• Wstrząs

• Odczyn skórny Schwartzmana

• Gorączka (pirogenność)

• Leukocytoza

• Obniżenie ciśnienia krwi

• Agregacja płytek krwi

• Aktywność adjuwantowa

• Działanie mitogenne

• Aktywacja makrofagów

• Indukcja nieswoistej odpowiedzi i wiele innych

Egzotoksyny	Endotoksyny
Wydzielone przez żywe komórki, znajdują się w dużej ilości w pożywce	Uwalniane z komórek po ich dezintegracji
Wysoce toksyczne, powodują śmierć w dawkach mikrogramowych	Słabo toksyczne, powodują śmierć w dawkach miligramowych
Względnie niestałe, zostają unieczynnione przez ogrzewanie w T= 60^0C	Termostabilne
Można przez formalinę przeprowadzić w toksoid	Nie można przeprowadzić w toksoid
Silny antygen	Nie wywołują powstawania przeciwciał o wysokim mianie
Proteiny	Kompleksy lipopolisacharydowe
Wytwarzane głównie przez bakterie Gram dodatnie	Wytwarzane głównie przez bakterie Gram ujemne


ENZYM apoenzym (białko)

Koenzym (grupa prostetyczna)

Substrat

Enzymy konstytucyjne

Enzymy adaptacyjne

Autotrofy (proste związki nieorganiczne)

Heterotrofy (organiczne źródła C i N)

Czynniki niezbędne: S, Fe, Mg, P, tiamina, ryboflawina, witamina B6, biotyna, PABA

Enzymy bakteryjne; optimum zależy od:

• Czynników genetycznych

• Substratu

• pH

• temperatury

• O₂ i CO₂

Enzymy zewnątrzkomórkowe rozkładające:

• białko, proteazy

• Lipidy, lipazy, lecytynaza

• Węglowodany

• Kwasy nukleinowe

• Inne hemolizyny, hialuronidaza

Enzymy wewnątrzkomórkowe:

1. Swoiste:

• Hydrolazy

• Liazy

• Transferazy

• Fosforylazy

• Izomerazy

• Ligazy- syntetazy

• Permeazy- translokaza

2. Enzymy oksydoredukcyjne

• Oksydazy

• Oksydazy cytochromowe

• Peroksydazy

• Dehydrogenazy

• Hydrogenazy

Anabolity:

• Polisacharydowe: wielocukry, śluzy, glikogen, skrobia

• Białkowe: toksyny (jady), enzymy: hemolizyny, koagulaza, proteazy

• Tłuszczowe: woski, lipidy

• Barwniki:

• Zewnątrzkomórkowe: pyocyanina

• Wewnątrzkomórkowe: chromoproteiny (złociste, żółte, pomarańczowe, czerwone)

• Witaminy

• Aminokwasy

• Czynniki wzrostowe

Katabolity:

• Gazowe: CO₂, H₂S, NH₃, NH₂

• Nieorganiczne: azotyny, azotany, chlorki, tlenki, fosforany, siarczany

• Organiczne

• Kwasy: mlekowy, mrówkowy, octowy, masłowy, walerianowy, propionowy, bursztynowy

• Alkohole: etylowy, metylowy, glicerol

• Aminy: histamina, tyramina, kadaweryna, putresceina, agmutyna

• Amidy: amoniak i dwutlenek węgla

• Indol z tryptofanu

• Mocznik

Antygen= immunogen

Podany pozajelitowo (parenteralnie) ma zdolność do wywołania odpowiedzi immunologicznej w formie przeciwciał (immunoglobulin) lub komórek zdolnych do reakcji immunologicznej. Antygen, np. białko, bakterie, drożdże, toksyny bakteryjne, wirusy

Cecha: swoistość



Odporność swoista





Czynna Bierna





Naturalna sztuczna naturalna sztuczna

(choroba) (szczepionki) (matka- płód) (surowica)

Odporność nieswoista, czynniki:

• Genetyczne

• Wiek

• Hormony

• Bariery ochronne: skóra, błony śluzowe, kwas solny

• Zanieczyszczenie środowiska



Odporność nieswoista

Komórkowa humoralna

Fagocytoza „naturalne” p- ciała

Leukergia lizozym

Interferon polipeptydy zasadowe

Inhibitory wirusów

Dopełniacz; properdyna

Wykład 3

Cechy drobnoustrojów chorobotwórczych:

• Zjadliwość (wirulencja, patogenność)

• Inwazyjność

• Alergizacja

• Egzotoksyny

• Endotoksyny (pirogeny, LPS)

Bakteriemia- obecność drobnoustrojów i ich metabolitów we krwi

Toksemia- obecność toksyn we krwi

Posocznica= bakteriemia; bakterie bezpośrednio dostają się do krwi

Zapalenie miejscowe: obrzęk, przekrwienie, temperatura, ból, upośledzenie czynności

Zapalenie ogólne: temperatura, zaburzenia krążenia, objawy OUN i ze strony narządów wewnętrznych

Zakażenie:

• Przez ciągłość

• Przez styczność

• Drogą chłonną

• Drogą hematogenną

• Drogą pni nerwowych

W macicy (wstępujące, zstępujące)

- podczas porodu

- po porodzie



Zakażenia jawne

ogólne miejscowe

1. Ostre

2. Podostre

3. Przewlekłe

Zakażenia utajone

1. Latentne

2. Bezobjawowe


Czas wylęgania: 1- 50 dni, nawet lata! (czas od infekcji do pierwszych znamion infekcji)

Wirus hepatitis C= HCV żółtaczka typu C

• Nowy wirus o niepoznanej do końca budowie i patogenności

• Nieznana droga zakażenia

• Brak szczepionki

• Długi okres inkubacji

• W 100% onkogenny

Drogi szerzenia się zakażeń:

• Bezpośrednia:

• Łożyskowa, pochwowa, stosunki płciowe, ręce, pocałunki, rany, ukąszenia, kontakt bezpośredni

• Pośrednia:

• Powietrzno- kropelkowa (śluz, kurz) np.: grypa, katar, gruźlica, zapalenie płuc, błonica, wąglik

• Wodno- pokarmowa (kał, woda, mleko, lody, mięso, ręce…) np.: zakażenia jelitowe, cholera, dur brzuszny, dury rzekome, czerwonka, zatrucia i zakażenia pokarmowe, gruźlica, WZW, bruceloza, salmonellozy, laseczki jadu kiełbasianego (jej toksyna najsilniejsza), enterowi rusy

• Przedmioty użytkowe (ręczniki, bielizna, szczoteczki, żyletki, naczynia, sztućce, zabawki, igły, strzykawki, narzędzia…) np.: rzeżączka, tężec, zgorzel gazowa, dur powrotny, choroby skóry, WZW, zakażenia przyranne

• Gleba (wydaliny, wydzieliny, warzywa…) np.: dur brzuszny, dury rzekome, czerwonka, tężec, zgorzel gazowa, wąglik, pasożyty

• Owady (wszy, pchły, muchy, komary, kleszcze) np.: dur brzuszny, dury rzekome, czerwonka

• Zwierzęta, np.: wścieklizna, zapalenie opon mózgowych

• Zakażenia szpitalne, np.: Pseudomonas aeruginosa (u oparzonych)

Zatrucie- okres wylęgania w godzinach

Zakażenie- okres wylęgania w dobach, tygodniach, miesiącach, latach

Wpływ warunków środowiska na rozwój bakterii:

• Faza gazowa, aeracja

• Temperatura (sterylizacja= wyjaławianie)

• Wysuszenie

• Zamrażanie

• Ciśnienie osmotyczne, plazmoptyza, plazmoliza

• Napięcie powierzchniowe

• pH

• NaCl, halofile

• Ultradźwięki, kawitacja

• Promieniowanie

• Czynniki chemiczne

• 
  Dezynfekcja

• Antyseptyka

• Konserwacja

• 
  aseptyka

• Antybiotyki

• Chemioterapeutyki (hamują replikację wirusa)

• Ciśnienie atmosferyczne potrzebne do osiągnięcia gorącej nasyconej pary wodnej w autoklawie

Metody zapobiegania zakażeniom:

• Ochrona wrót zakażenia: opatrunki, antyseptyka, maski, ustniki, okulary, filtry, rękawiczki

• Wczesne chirurgiczne opracowanie ran, np. oparzeń

• Antybiotyki i chemioterapeutyki, zapobiegawczo?

• Surowice i szczepionki: tężec, grypa, WZW, DiTePe, Pseudovac

• Przerywanie dróg:

• Sterylizacja- wyjaławianie

• Antyseptyka higieniczna skóry, np. rąk

• Antyseptyka chirurgiczna skóry rąk

• Dezynfekcja wody, ścieków, wydalin

• Dezynfekcja powierzchni użytkowych

• Higiena żywienia (mycie, gotowanie)

• Higiena sprzątania (na wilgotno, „Rainbow”)

• Dezynsekcja

• Deratyzacja

• Izolacja (dżuma, cholera, dur plamisty)

• Izolacja domowa (grypa, katar, anginy, zakażenia pokarmowe)

• Kwarantanna (cholera, dżuma, dur plamisty)

• Kordon sanitarny (rejon, miasto, kraj)

Cechy drobnoustrojów:

• Nie są głupie efekt ewolucji przez miliardy lat

• Poradzą sobie w każdym środowisku chemicznym, fizycznym czy biologicznym

• Są bardziej niebezpieczne (patogenne), gdy:

• Makroustrój jest osłabiony, np. brak odporności

• Działają w grupie (biofilm)

• Nauczyły się zakażać nasz gatunek (mieliśmy pecha :P)

• Badają aktywnie swoje środowisko na odległość, wysyłając sygnały i nasłuchując odpowiedzi. Jest to „chemiczna echosonda” lub „chemiczny radar”. Tymi zawodowcami są pary cząsteczek egzotoksyn. Czy to ciekawostka z życia bakterii???

• Czy „ciekawostka” ta ma znaczenie praktyczne? Ma- i to duże.

Efekt:

- oporność i wielooporność na czynniki chemiczne, antybiotyki i inne

- Enterococcus spp., Pseudomonas spp. To bakterie XXI wieku

- te właściwości są przekazywane innym gatunkom bakterii (np. plazmidy R), nawet rodzajom

Wykład 4

Mikrobiologiczne bezpieczeństwo leków i materiałów

Bezpieczeństwo środków farmaceutycznych jest problemem terapeutycznym oraz produkcyjnym i analitycznym związanym z:

• Obecnością zanieczyszczeń drobnoustrojowych np. bakterii, grzybów i wirusów jako etiologicznych czynników infekcyjnych drogą leku

• Zanieczyszczeń produktami metabolizmu np. endotoksyn i egzotoksyn lub substancji pirogennych

• Utrata właściwości terapeutycznych np. penicylin i cefalosporyn pod wpływem β- laktamaz bakteryjnych

• Zmiana cech organoleptycznych leku, biodeterioracja

• Utrata właściwej postaci farmaceutycznej np. rozpad tabletek, fermentacja


Źródła i drogi transmisji oraz sposoby ograniczenia zanieczyszczeń:








































Chlorheksydyny- antyseptyk adsorbujący się w skórze

Nawiew laminarny prędkość powietrza 0,3- 0,5 m/s

Mikrobiologia w produkcji leków wg UE

• Problem zanieczyszczeń i zakażeń drogą leku

• Metody izolacji, identyfikacji i liczenia bakterii CFU, jtk

• Czystość mikrobiologiczna środowiska produkcji pomieszczenia, urządzenia, surowce, personel, bioareozol, drogi szerzenia

• Dekontaminacja środowiska, powietrze (HEPA, MFI, LAF), dezynfekcja, antyseptyka, sterylizacja, konserwacja, eradykacja, monitoring oraz walidacja

• Dekontaminacja skóry rąk: antyseptyka higieniczna i chirurgiczna, technika mycia oraz zakładanie i zdejmowanie rękawiczek, monitoring i walidacja

Mikrobiologiczne metody kontroli leków wg FP VII 2006 (Eur. Pharm)

• Badanie jałowości, pirogeny, endotoksyny, Kat. 1

• Badanie czystości mikrobiologicznej leków: Kat. 2, 3A, 3B, 4A i 4B, surowców i środowiska produkcji, wymagania ilościowe i jakościowe, walidacja

• Badania skuteczności środków konserwujących

• Antybiotykoterapia kontrolowana, wrażliwość i oporność

• Zakażenia szpitalne i pozaszpitalne w tym apteczne, zapobieganie, przerywanie dróg zanieczyszczeń i zakażeń, np. antyseptyka skóry rąk

• Problem unieszkodliwiania infekcyjnych opadów szpitalnych i aptecznych, przeterminowane leki

Wymagania czystości mikrobiologicznej leków wg FP VII

• Kat. 1- leki jałowe: iniekcje, infuzyjne, krople oczne

• Kat. 2- leki do stosowania miejscowego i w układzie oddechowym

• Kat. 3A- preparaty doustne i doodbytnicze

• Kat. 3B- preparaty doustne zawierające surowce pochodzenia naturalnego *

• Kat. 4A- preparaty ziołowe poddawane działaniu wrzącej wody

• Kat. 4B- preparaty ziołowe nie poddawane działaniu wrzącej wody

* ≤10⁴ bakterii/ 1g; 10² grzybów; 10² Enterobacteriaceae i innych Gram- ujemnych z wykluczeniem Salmonella 10 g; E. coli 1 g; S. aureus 1 g

Zasadnicze wymagania dotyczące walidacji badań mikrobiologicznych leków

Definicja walidacji: udokumentowany program dający wysoki stopień pewności, że określony proces, metoda lub system będzie w sposób powtarzalny prowadził do otrzymania wyników spełniających określone kryteria akceptacji:

1. Walidacja alternatywnych badań jakościowych do wykrywania lub braku drobnoustrojów

2. ……… ilościowej: do oceny liczny drobnoustrojów

3. ……… identyfikacji drobnoustrojów

Parametry walidacji: dokładność, precyzja, specyficzność, liniowość, granica oznaczalności, granica wykrywalności, odporność na zmiany

Produkty lecznicze i surowce o niewłaściwej czystości mikrobiologicznej wg FP VII zdyskwalifikowane w latach 1998- 2007

- wytwórnie farmaceutyczne, leki 1,2% *

Surowce, woda 16,0% *

- apteki, leki recepturowe 19,8% **

Surowce, woda 30,1% **

* badania własne od. 10000 prób leków

** laboratorium Kontroli Jakości Leków, WIF w Poznaniu

Metody kontroli czystości mikrobiologicznej środowiska tzw. przestrzeni pracy:

1. Powietrze:

• Sedymentacja wg Kocha (półilościowa)

• Filtracja z zastosowaniem filtrów membranowych lub żelatynowych (ilościowa i zalecana przez FP VII)

• Metoda uderzeniowa MicroBio de Ville

• Metoda Oliwara dla boksów laminarnych

2. Powierzchnie użytkowe (stoły, podłogi, ściany, sprzęty, ręce, rękawice, odzież, buty)

• Metoda kontaktowa- odciskowa, płytki RODAC- 25 cm², metoda wymazów z 25 cm², wypłukiwań ze sprzętu

3. Ciecze

• Metoda filtracji przez sączki membranowe lub bezpośredniego posiewu

Wymogi czystości mikrobiologicznej powietrza, powierzchni i personelu

Najczęściej wybierana KLASA D

Powietrze: 200 cfu/ cm³

Powierzchnie 25 cm²: podłoga: 200

Urządzenia: 50- 80

Personel 25 cm²: ręce i rękawice: 50

Ubranie: 100

Źródła drobnoustrojów w środowisku receptury aptecznej:

• Drobnoustroje pochodzące od nosicieli- skórne, nosowe lub jelitowe, np.: drobnoustroje alarmowe (alertowe), zaniedbania dezynfekcji, antyseptyki i eradykacji, ryzyko zanieczyszczeń na poziomie 10⁴ jtk/ 25 cm²

• Mikroflora górnych dróg oddechowych personelu ryzyko zanieczyszczeń na poziomie 10⁴- 10⁵ jtk/ ml śliny profilaktyka za pomocą masek

• Mikroflora przejściowa i bytująca skóry rąk, np. kasa zaniedbanie antyseptyki, np. nieskuteczne procedury mycia i dekontaminacji, ryzyko zanieczyszczeń na poziomie 10³- 10⁴ jtk/ 25 cm²

• wentylacja powietrza, bioareozol

• Powietrze zewnętrzne (okna, drzwi, szczelność) ryzyko zanieczyszczeń na poziomie 10⁴- 10⁶ jtk/ 25 m³

• Mikroflora złuszczonego naskórka, obecność 10⁶ cząstek/ godzinę, w tym 10⁵ jtk/ m³ powietrza, dekontaminacji bioaerozolu

• Pył roboczy z ubrań, sprzętu, podłóg, ścian, bioaerozol produkcyjny, ryzyko zanieczyszczeń 10³ jtk/ m³, dekontaminacja

• Drobnoustroje z korozji biologicznej ścian i instalacji 10⁴ jtk/ m³

• Zanieczyszczone surowce, produkty, np. woda, sprzęt, opakowanie, pojemniki, butelki, zaniedbania sterylizacji, dezynfekcji i antyseptyki

Jakość mikroflory receptury aptecznej

Bioaerezol recepturowy to obecność najczęściej:

• Micrococcus spp., Streptococcus spp., Bacillus spp.

• Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens

• Flavobacterium spp., Brevibacterium spp.

• Corynebacterium spp.

• Aspergillus Niger

• Penicillium spp., Fusarium spp.

• Candida albicans i inne gatunki

Kolonizacja skóry rąk personelu szpitalnego- mikroflora stała i przejściowa

• Staphylococcus CNS (18 gat.) i MRCNS do 60- 80%, wśród CNS kolonizacja 10³- 10⁵ cfu/ cm² u 90% populacji

• Staphylococcus aureus MRSA VISA przejściowo

• Micrococus spp. < 10⁴ cfu/ cm² (11 gat. U 40- 50% populacji)

• Enterococcus faecalis VRE, HLAR, nosicielstwo 6- 10%, flora stała

• Bacillus spp. < 10³ cfu/ cm²

• E. coli ETEC, ESBL (+) flora przejściowa

• Pałeczki niefermentujące: P. aeruginosa i inne gatunki, Acinetobacter spp., flora przejściowa

• Propionibacterium Agnes, flora stała

• C. albicans, Malassezja furfur, Pitylosporum spp.

Drobnoustroje izolowane ze skóry rąk personelu aptecznego

• Stahylococcus CNS

• Staphylococcus MRCNS

• Staphylococcus MRSA

• Micrococcus spp.

• Enterococcus spp.

• E. coli ESBL (+)

• Pseudomonas aeruginosa

• Acinetobacter spp.

• Candida spp.

Kategorie mikroflory skóry rąk:

1. Flora przejściowa: (transient skin flora) obca skórze, składająca się z drobnoustrojów niezdolnych do stałego przebywania na niej i rozmnażania się. Mikroorganizmy te stanowią zanieczyszczenia, nabyte w kontakcie ze środowiskiem, pozostające na powierzchni skóry okresowo, ale wystarczająco długo, aby mogły stać się źródłem infekcji.

2. Flora stała to drobnoustroje namnażające się w skórze, są to:

• Gram-dodatnie bakterie (Staphylococcus sp., Corynebacterium sp.);

• bakterie beztlenowe (w gruczołach łojowych - Propionibacterium acnes)

• Gram-ujemne pałeczki (w miejscach wilgotnych - Acinetobacter sp.).

Stopnie dekontaminacji skóry rąk:

• Zwykłe, codzienne mycie za pomocą mydła i wody, usuwa większość mikroflory „przejściowej” skóry rąk

• Higieniczna antyseptyka polega na zastosowaniu środka, najczęściej alkoholowego w celu usunięcia i/ lub zabicia mikroflory przejściowej skóry rąk

• Chirurgiczna antyseptyka polega na zastosowaniu środka, najczęściej chlorheksydyny w alkoholu, o działaniu dwufazowym (przedłużonym) po desorpcji chlorheksydyny ze skóry przedostaje się do soku rękawiczkowego

1. W celu usunięcia i zabicia mikroflory przejściowej i bytującej w skórze

2. W celu ograniczenia liczby drobnoustrojów w soku rękawiczkowym

Higieniczne mycie i opracowanie antyseptyczne skóry rąk:

Sposób:

• „etap brudny” mydło płynne lub stałe, woda, mycie wg schematu, ręcznik 1- razowy

• „etap czysty”-> alkoholowy preparat wcierać i rozcierać do wysuszenia

Popełniane błędy i zaniedbania w antyseptyce skóry rąk:

• Lekceważenie kontaminacji skóry

• Brak czasu, nadmiar pracy, niewygoda, brak sprzętu i środków

• Zbyt krótki czas użycia antyseptyka, zbyt mała jego objętość, stosowanie na mokrą/ brudną skórę oraz pomijanie niektórych obszarów dłoni

• Po procesie mycia tylko osuszanie, bez antyseptyku

• Nadwrażliwość skóry na środki antyseptyczne

• Antyseptyka „kieszonkowa”- atomizery

• Otwarty system dozowania antyseptyku

• Brak przeszkolenia w procedurze mycia

• Użycie rękawiczek (antyseptyk przed i po zastosowaniu)

Środki antyseptyczne- wymagania

• Działanie bójcze dwufazowe, przedłużone, min. 2-3 h po użyciu

• Nie wysusza, nie drażni skóry

• pH= 5,5- 7,0, d= 0,8- 0,9 g/ cm³, lepkość 1- 1,3 Pas, bezbarwne, klarowne

• trwałe w temperaturze pokojowej

• biodegradowalne substancje czynne i pomocnicze

Czynniki i środki dezynfekcyjne

1. CHEMICZNE

• aldehyd glutarowy 0,2% dla 2 m²- najsilniejszy

• pochodne fenolu, krezolu

• alkohole

• biguanidy (chlorheksydyny)

• kwas nadoctowy

• organiczne związki chloru, jodu, jodofory

• czwartorzędowe sole amoniowe, detergenty

• preparaty trój enzymatyczne (proteaza)

• związki zawierające aktywny tlen, H₂O₂

2. FIZYCZNE

• Para wodna temp. 105- 110 ⁰C 5- 10 minut

• Prom. UV 250- 260 nm (dla powietrza)

• Woda 93- 95⁰C 10- 30 minut wspomaganie za pomocą ultradźwięków

Sterylizacja leków i materiałów medycznych:

• Skuteczność procesu jest określona jako SAL- 1*10^-6 cfu/ jednostkę, co oznacza, że ryzyko przeżycia drobnoustrojów wynosi ≤ 1 na 1000000 wysterylizowanyh jednostek procesu finalnego

• Obowiązujące procedury postępowania w zakresie sterylizacji za pomocą: pary wodnej, tlenku etylenu, radiacyjna, formaldehyd, plazma

• Problem opakowań sterylizacyjnych

• Metody kontroli

• walidacja

Wykład 5

Metody dekontaminacji powietrza:

• filtry HEPA

• UV- urządzenia przepływowe (dezynfekcja powierzchni, na którą pada)

• MFI (Multifunction Ion Air Cleaning)- wykorzystanie procesu jonizacji i przyciągania elektrostatycznego cząstek biologicznych o wielkości > 0,003 μm, dekontaminacja na poziomie <1 cfu/ m³; prędkość przepływu= 0,5 m/s

Proces usuwania zanieczyszczeń metodą MFI

1. Zasysanie i przepływ powietrza

2. Wymuszone nadanie ładunku ujemnego (jonizacja) cząstkom zanieczyszczeń o wielkości > 0,003 μm

3. Przyciąganie elektrostatyczne ujemnych cząstek do ścian tunelu o ładunku dodatnim

4. Zniszczenie żywych drobnoustrojów i spłukanie ścian tunelu

Konserwacja leków:

• Ma na celu zachowanie jałowości lub wymaganej czystości mikrobiologicznej leku przez cały okres jego przydatności oraz zabezpieczyć gotowy lek przed wtórnym zanieczyszczeniem i rozwojem drobnoustrojów gdy jest on przechowywany lub pobierany z opakowania przeznaczonego dla wielokrotnego użytku

• Konserwację zaleca się w tych przypadkach, gdy postać lub skład leku sprzyjają przeżyciu i rozwojowi drobnoustrojów, stosuje się ją zarówno dla preparatów jałowych, np. kropli do oczu oraz tych, dla których jałowość nie jest wymagana. Zanieczyszczenie leku drobnoustrojami może być źródłem infekcji u pacjenta leczonego danym preparatem, jak i może spowodować rozkład substancji czynnych zawartych w leku, co może ograniczyć jego przydatność terapeutyczną. Dodawanie środków konserwujących nie może zastępować ZASADY DOBREJ PRAKTYKI WYTWARZANIA (GMP)

Środki konserwujące są to substancje chemiczne, które dodane do leku zabezpieczają go przed rozwojem drobnoustrojów. Mogą to być substancje bakteriostatyczne, które uniemożliwiają rozmnażanie się drobnoustrojów obecnych w lekach dla których nie jest wymagana jałowość lub dostających się do leku podczas jego nieaseptycznego wykonywania.

Rozwój drobnoustrojów w leku zależy od wielu czynników związanych z samym lekiem, należy tutaj wymienić skład i postać leku.

Cechy dobrego środka konserwującego:

• Rozpuszczalność w leku wymagającym konserwacji

• Właściwości lipofilowe i hydrofilowe

• Brak zapachu, smaku, barwy

• Trwałość i aktywność bójcza w środowiskach o różnym pH i temperaturze

• Oporny na działanie światła, tlenu

• Brak wpływu na działanie farmakologiczne leku, nawet w czasie długiego przechowywania

• Działanie w niskich stężeniach

• Szybkie działanie bójcze

• Trudności w wytwarzaniu form opornych

Chemiczne środki konserwujące powinny być stosowane do konserwacji:

• Leków do oczu z wyjątkiem pojemników jednodawkowych

• Roztworów iniekcyjnych i zawiesin (pojemniki wielodawkowe, surowice i szczepionki, np. autoszczepionki, organopreparaty)

• Kropli do nosa

• Leków doustnych

• Roztworów leków stosowanych zewnętrznie oraz maści o charakterze emulsji typu o/w i w/o

Czynniki warunkujące skuteczność działania środka konserwującego:

• Aktywność w stosunku do pałeczek Gram ujemnych- Pseudomonas aeruginosa w lekach do oczu

• Rodzaju Pseudomonas i gronkowców w lekach dermatologicznych

• Grzybów w lekach doustnych

Najczęściej stosowane środki konserwujące należą do grupy

• fenoli,

• alkoholi,

• kwasów organicznych,

• biguanidów,

• organicznych związków rtęciowych i IV- rzędowych zasad amoniowych,

• możliwe jest wykorzystanie działania wspomagającego EDTA lub addycji czy synergizmu dla działania środków konserwujących, np. na pałeczkę P. aeruginosa w kroplach do oczu.

Zalecane mieszaniny środków konserwujących do leków ocznych

I) chlorek benzalkoniowy Octan lub glukonian chlorheksydyny	0,05 g/l 0,10
II) chlorek benzalkoniowy Alkohol β- fenyloetylowy	0,05 4,00
III) boran fenylortęciowy Alkohol β- fenyloetylowy	0,01 4,00
IV) azotan fenylortęciowy Alkohol β- fenyloetylowy	0,02 4,00
V) tiomersal Alkohol β- fenyloetylowy	0,2 4,00
VI) boran fenylortęciowy	0,01 g/l
VII) hydroksybenzoesan metylu Hydroksybenzoesanu propylu Alkohol β- fenyloetylowy	0,65 0,35 4,00

Drobnoustroje testowe

• Pseudomonas aeruginosa

• Staphylococcus aureus

• Candida albicans

• Aspergillus Niger

• Escherichia coli (dla preparatów doustnych)

• Zygosacharonryces rouxi (dla preparatów z dużą ilością cukru)

Endotoksyny w lekach infuzyjnych- natura i wykrywanie

• Substancje pirogenne, jak np. lipopolisacharydy (LPS), nazywane także endotoksynami, są ważnym czynnikiem toksycznym i przyczyną różnorodnych zakażeń organizmu prowadzącym do śmierci po podaniu parenteralnym.

• Pirogeny są to wielkocząsteczkowe związki wchodzące w skład ściany komórkowej bakterii, szczególnie Gram ujemnych. W skład kompleksu endotoksycznego wchodzi wielocukier, białko i lipid A. substancje endotoksyczne są termo stabilne, uwalniane z komórki po jej zniszczeniu, np. po wyjałowieniu za pomocą pary wodnej pod ciśnieniem.

• Płyny infuzyjne muszą być kontrolowane na obecność endotoksyn za pomocą wykrywania właściwości pirogennych tych substancji . badanie polega na pomiarze przyrostów temperatury ciała królików po dożylnej iniekcji roztworu badanego płynu infuzyjnego

• FP VII- wykrywanie endotoksyn bakteryjnych za pomocą testu LAL z zastosowaniem lizatu amebocytów skrzypłocza. Wyróżnia się trzy techniki badania: żelową, zmętnieniową oraz chromogenną.

Główne przyczyny błędów i zaniedbań w postępowaniu aseptycznym:

• Przestarzałe i niewłaściwe techniki mycia i dezynfekcji narzędzi i pomieszczeń

• Zaawansowane metody leczenia, sprzęt trudny do mycia, dezynfekcji i sterylizacji

• Niewłaściwa metoda i częstotliwość kontroli sterylizacji

• Błędy i zaniedbania w zakresie antyseptyki skóry rąk, środki dwufazowe, technika mycia

• Zaniedbania w zakresie antyseptyki pola operacyjnego, ran, odleżyn

• Trudności eradykacja drobnoustrojów alarmowych pacjenta i personelu

• Kosztowna dekontaminacja powietrza, warunki pracy, problem Legionelli spp., zagadnienie dymów chirurgicznych (smugi laserowe)

• Trudności izolacji pacjenta zakażonego i/ lub ochrony przed drobnoustrojami

• Duża ruchliwość personelu i pacjentów, kontakty, procedury

• Błędy w zakresie prania bielizny szpitalnej, obieg bielizny czystej i brudnej, barierowość ubrań i obłożeń zabiegowych

• Świadomość personelu w zakresie higieny, ciągłe szkolenie

• Brak nadzoru nad postępowaniem i unieszkodliwianiem odpadów infekcyjnych

• Problem jakości rękawiczek i masek chirurgicznych

• Szeroka „konsumpcja” antybiotyków, oporność

• Obniżona odporność pacjenta, wiek, inwazyjne procedury, uraz fizyczny (np. oparzenie), stres

• Walidacja każdego procesu aseptycznego

• Zaniedbania audytu wewnętrznego to wzrost ryzyka zanieczyszczeń i zakażeń

Najważniejsze problemy infektiologii

• Nowe i ponownie pojawiające się drobnoustroje

• Zaburzenia immunologiczne

• Terapia i diagnostyka inwazyjna

• Chirurgia i traumatologia, oparzenia

• Przeszczepy

• Nowotwory lite i białaczki

• Zakażenia szpitalne

Przyczyny związane z pojawianiem się nowych chorób infekcyjnych

• Stosowanie leków i środków przeciwbakteryjnych

• Stosowanie pestycydów

• Promieniowanie UV i radionuklidy

• Interwencje lekarskie

• Ewolucja i zmiany genetyczne drobnoustrojów

• Zanieczyszczenie środowiska

• Starzenie się populacji

• Zmiany demograficzne, społeczne, polityczne, klimatyczne, wojny, stres, bioterroryzm

Biotechnologia farmaceutyczna- nowa dziedzina mikrobiologii i farmacji

• Poszukiwanie substancji biologicznie czynnych, np. antybiotyków typu β- laktamowe, amino glikozydy, tetracykliny, makrolity, antracykliny

• Biosynteza aminokwasów, nukleotydów, witamin, enzymów i ich inhibitorów

• Projektowanie metabolizmu szczepów wysokowydajnych

• Wytwarzanie leków metodami inżynierii genetycznej

• Są to rekombinowane białka, np. substancje aktywne dla terapii, przeciwciała monoklonalne, szczepionki nowe adiuwanty

• Wskazania terapeutyczne: immunoterapia, terapia chorób nowotworowych, anemia, fibrynoliza

Problem broni biologicznej to przykład koncepcji wykorzystania osiągnięć biologii molekularnej do „konstrukcji” różnych patogennych drobnoustrojów

• Uzyskanie szczepów bardziej zjadliwych, opornych na antybiotyki czy środki dezynfekcyjne

• Uzyskanie tzw. Broni etnicznej, czyli drobnoustrojów atakujących tylko określone grupy, nacje, rasy, np. wirus ospy prawdziwej

• Uzyskanie drobnoustrojów tak zmutowanych, by mogły przetrwać w warunkach ekstremalnych

• Uzyskanie nowych, zmienionych patogenów, trudnych do wykrycia

Skutki narastania oporności:

• Brak efektu terapeutycznego, wielooporność

• Oporność krzyżowa

• Problem enterokoków i pneumokoków

• Problem Gram ujemnych pałeczek

• Nosicielstwo, problem eradykacja

• Oporność na środki dezynfekcyjne i antyseptyczne

• Poszukiwanie nowych antybiotyków i chemioterapeutyków

Reprocesowanie

To uzdatnianie skontaminowanego wyrobu jednorazowego użycia w celu ponownego użycia, np. za pomocą dezynfekcji, mycia, płukania, suszenia, pakowania i sterylizacji

Odpady infekcyjne

• Unieszkodliwiane za pomocą sterylizacji parowej

• Autoklawy o pojemności 1- 10 ton (m³), stacjonarne lub przejezdne

• Proces: gromadzenie i selekcja, rozdrabnianie, próżnia, sterylizacja 30- 40 minut, kontrola, suszenie, granulacja

• Wynik: jałowy granulat o zmniejszonej objętości o 80%, zawierający 10% wody zmiana klasyfikacji odpadu z niebezpiecznego na komunalny

• Spalanie, nawet ekologiczne, w porównaniu do sterylizacji jest procesem inwestycyjnie i eksploatacyjnie 3- 10 razy droższym

Nowe, nieznane przed 1980 rokiem, drobnoustroje wywołujące zakażenia u ludzi; nowe zagrożenia:

HIV	AIDS
Helicobacter pylori	Choroba wrzodowa żołądka
Hepatitis C (HCV)	Zmiany nowotwoowe
Wirus Ebola, Sabia	Gorączka krwotoczna
BSE, priony	Encefalopatia gąbczasta bydła
Pseudomonas aeruginosa	Miażdżyca tętnic
Infekcje przewlekłe	Zaburzenia psychiczne, demencje, nadciśnienie, cukrzyca, stwardnienie rozsiane, choroba Alzheimera

Wirusy i bakterie to nie tylko infekcje:

Wirus brodawczaka- rak szyjki macicy, jamy ustnej, krtani i skóry

Bakteria Helicobacter pylori- miażdżyca tętnic, udar mózgu, rak żołądka

Wirus cytomegalii- rak jelita grubego

Bakteria Chlamydia pneumoniae- stwardnienie rozsiane, choroba Alzheimera

Wirus opryszczki HHV-8- rak prostaty, mięsak Kaposiego

Wirus HHMMTV- rak piersi

Wirus Borrelia Burgdorferi- depresja

Wirus Epsteina- Barr- rak nosa i gardzieli, Chłonia Burkitta

Krętek blady- uszkodzenia mózgu wywołujące objawy zbliżone do różnych schorzeń psychicznych, np. schizofrenii

Wirus grypy- schizofrenia, psychozy

Bakterie paciorkowca- anoreksja, nerwica natręctw, syndrom Tourette'a

Wirus Borna- schizofrenia, autyzm

Bakteria Borrelia burgorferi- psychozy, depresja





29

osłonka

kapsyd

kapsomery

Nić DNA lub RNA

Ochrona zewnętrzna

Ochrona wewnętrzna

Błona cytoplazmatyczna

Cytoplazma (zagęszczona informacja genetyczna)

Jednostki tworzące kolonie (TK), LICZBA BAKTERII

grzyby

bakterie

alkalofile

acidofile

neutrofile

Powietrze, drobnoustroje, kurz, pył, bioareozole recepturowy smog

Narzędzia, sprzęty, opatrunki, płyny, leki, bielizna, odpady

Filtry HEPA, ULPA, metoda MFI, LAF

sterylizacja

Ściany, podłogi, meble, aparatura

Apteka

Receptura

leki

Czyszczenie, mycie, dezynfekcja

Personel: skóra rąk, śluzówki nosogardzieli

Skóra rąk chirurga, śluzówki nosogardzieli

Antyseptyka higieniczna, antybiotyki, erudykacja

Antyseptyka chirurgiczna, erudykacja, „respiratory” osobiste

---