SPRAWOZDANIE:

Kolorymetryczne oznaczanie stężenia białka przez reakcję z barwnikiem Coomassie Brillant Blue

G-250

1. WYKONANIE ĆWICZENIA

1. Opis przygotowania standardu:

1. Pobrano 0,5 ml standardu do probówki i dodano do niego 2 ml buforu standardowego

2. Zmierzono ekstynkcję tak otrzymanego roztworu przy 280 nm

3. Na podstawie pomiaru ekstynkcji i odpowiedniego współczynnika ekstynkcji (dla immunoglobuliny A₂₈₀^0,1%=1,5) wyliczono rzeczywiste stężenie standardu

4. Następnie przygotowano serię rozcieńczeń standardu (dopełniono buforem standardowym), w taki sposób, że otrzymano kolejno 0 μg, 1 μg, 2 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg, 40 μg białka w 100 μl buforu standardowego.

Ekstynkcja standardu: A₂₈₀=0,073

Stężenie białka standardowego:

Gdzie:

ε - współczynnik ekstynkcji

l - długość drogi w warstwie optycznej roztworu

A - absorbancja

C - stężenie badanej substancji

Do pomiaru użyto roztwór rozcieńczony 5-krotnie.

Rzeczywiste stężenie standardu: 0,244

Tabela 1: Przygotowanie standardu immunoglobuliny G

nr próbki	m standardu[μg] teoretyczna	m standardu[μl] rzeczywista	Vstandardu­ [μl]	Vbuforu­ [μl]	A595	A465	A595/ A465
1	~ 0	0	0	100	0,386	0,750	0,515
2	~ 1	0,996	4,115	96,0	0,474	0,710	0,668
3	~ 2	1,993	8,230	82,0	0,722	0,612	1,180
4	~ 5	5,006	20,576	79,0	1,071	0,488	2,195
5	~ 10	9,963	41,152	59,0	1,683	0,309	5,447
6	~ 20	19,999	82,30	18,0	1,846	0,269	6,862
7	~ 40	24,400	100	0	1,629	0,323	5,043

2. Opis przygotowania immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu:

1. Rozpipetowano do czterech probówek kolejno po 10 μl, 20 μl, 40 μl, 60 μl roztworu immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu

2. Dopełniono buforem do 100 μl

Tabela 2: Immunoglobulina G o nieznanym stężeniu

Nr próbki	V IgG [μl]	V buforu [μl]
8	10	90
9	20	80
10	40	60
11	60	40

3. Opis przygotowania lizozymu o nieznanym stężeniu:

1. Rozpipetowano do czterech probówek kolejno po 10 μl, 20 μl, 40 μl, 60 μl roztworu lizozymu o nieznanym stężeniu

2. Dopełniono buforem do 100 μl

Tabela 3: Lizozym o nieznanym stężeniu

Nr próbki	V próbki [μl]	V buforu [μl]
12	10	90
13	20	80
14	40	60
15	60	40

4. Opis przygotowania albuminy wołowej o nieznanym stężeniu:

1. Rozpipetowano do czterech probówek kolejno po 10 μl, 20 μl, 40 μl, 60 μl roztworu albuminy wołowej o nieznanym stężeniu

2. Dopełniono buforem do 100 μl

Tabela 4: Albumina wołowa o nieznanym stężeniu

Nr próbki	V próbki [μl]	V buforu [μl]
16	10	90
17	20	80
18	40	60
19	60	40

5. Przygotowanie białka o znanym stężeniu w obecności SDS:

1. Do czterech probówek dodano kolejno po 41 μl białka

2. Do probówek z białkiem dodano następnie: 0 μl, 10 μl, 20 μl, 50 μl 10% (w/v) SDS.

3. Probówki uzupełniono do 100 μl buforem standardowym.

Tabela 5: Stężenie białka w obecności SDS

Nr próbki	V SDS[μl]	V białka[μl]	V buforu[μl]
20	0	41	59
21	10	41	49
22	20	41	39
23	50	41	9

6. Przygotowanie białka o znanym stężeniu w obecności NaCl:

1. Do czterech probówek dodano kolejno po 41? μl białka (10 μg)

2. Do probówek z białkiem dodano następnie: 0 μl, 10 μl, 20 μl, 50 μl 3 M NaCl

3. Probówki uzupełniono do 100 μl buforem standardowym.

Tabela 6: Stężenie białka w obecności NaCl

Nr próbki	V NaCl[μl]	V białka[μl]	V buforu[μl]
24	0	41	59
25	10	41	49
26	20	41	39
27	50	41	9

Objętość V_standardu:

masa rzeczywista:

2. WYNIKI I ANALIZA WYNIKÓW

Sporządzono wykres zależności [A595/A465]=f(m) na podstawie wyników z tabeli dot. przygotowania standardu immunoglobuliny G

Wykres 1: Wykres zależności A₅₉₅/A₄₆₅ = f(m[µg]):

Tabela 7: Wyznaczone stężenia IgG, albuminy wołowej i lizozymu

Nr.	A595	A465	A595/A465	mx[µg]	Vx[µl]	Cx[µg/µl]	Cxśr[µg/µl]
Immunoglob. G	8	0,379	0,731	0,518	0,073	10	0,007	0,029
		9	0,499	0,681	0,733	0,743	20		0,037
		10	0,707	0,654	1,081	1,833	40		0,046
		11	0,613	0,640	0,958	1,448	60		0,024
	Lizozym	12	0,372	0,697	0,534	0,120	10		0,012	0,012
		13	0,411	0,686	0,599	0,325	20		0,016
		14	0,448	0,705	0,635	0,439	40		0,011
		15	0,470	0,715	0,657	0,507	60		0,008
	Albumina wołowa	16	0,543	0,632	0,859	1,139	10		0,114	0,119
		17	0,701	0,594	1,180	2,143	20		0,107
		18	0,953	0,506	1,883	4,345	40		0,109
		19	1,213	0,370	3,278	8,711	60		0,145

Przykładowe obliczenia:

Z równania krzywej standardowej wyznaczono ilość mikrogramów białek

Tabela 8 : Wyznaczone stężenie białka standardowego w obecności SDS i NaCl

Odczynnik	Nr	A595	A465	A595/A465	Vodcz[µl]	Codcz[µg/100µl]	mx[µg]	Vx[µl]	Cx[µg/µl]
SDS	20	1,521	0,333	4,568	0	0	12,746	41	0,311
		21	0,77	0,506	1,522	10	0,01	3,213	41	0,078
		22	0,771	0,507	1,521	20	0,02	3,209	41	0,078
		23	0,77	0,489	1,575	50	0,05	3,378	41	0,082
	NaCl	24	1,37	0,385	3,558	0	0	9,587	41	0,234
		25	1,255	0,431	2,912	10	0,01	7,563	41	0,184
		26	1,219	0,45	2,709	20	0,02	6,928	41	0,169
		27	1,104	0,52	2,123	50	0,05	5,095	41	0,124

Przykładowe obliczenia :

C_odcz [µg/100µl próbki] (SDS):

C_odcz [µg/100µl próbki] (NaCl)

3. WNIOSKI

• Wykonując krzywą standardową, usunięto punkt pomiarowy nr 5. Odbiegał on znacznie od innych punktów i był przyczyną dużego błędu. Przyczyną błędu mogła być niedokładność pipetowania.

• Zauważono że po dodaniu SDS nie otrzymano stałej zależności absorbancji. Stało się tak z powodu, że SDS konkuruje z barwnikiem. Wiąże się on z białkiem w stosunku 1 g białka na 1,5 g SDS. Okazało się, że wraz ze wzrostem stężenia SDS wzrasta stężenie białka.

• Zupełnie inaczej sytuacja przedstawi się po dodaniu NaCl. W tym wypadku, wraz ze wzrostem stężenia odczynnika, stężenie białka maleje. Jest to związane z wysalaniem. Wpływ na to zjawisko ma także utrata otoczki solwatacyjnej molekuł.

Metoda Bradford

Jest to metoda zaliczana do metod kolorymetrycznych. Polega ona na tym, że substancja po związaniu z białkiem zmienia swój kolor. Reakcja barwnika z białkiem jest odwracalna.

Stosowany w niej odczynnik (Coomasie Brillant Blue G-250) zmienia swą barwę po uwolnieniu bądź związaniu protonu.

- pH<0,5 - odczynnik barwi się na czerwono i przyjmuje ładunek +1

- pH 2-3 - odczynnik barwi się zielono, cząsteczka jest nienaładowana

- pH 3-9 - barwnik po związaniu z białkiem barwi się na niebiesko, sumaryczny ładunek w jego cząsteczce wynosi -1

Zalety:

- metoda Bradford jest najmniej wrażliwą na obecność typowych związków chemicznych (w porównaniu do innych metod)

- najprostsza i najczulsza z pośród metod kolorymetrycznych

- metoda ta jest znacznie czulsza od dowolnej metody opartej na absorbancji aminokwasów w ultrafiolecie i w odróżnianiu od tych ostatnich na pomiar nie ma wpływu obecność kwasów nukleinowych lub innych silnie absorbujących w ultrafiolecie zanieczyszczeń

- oznaczenia można wykonywać w obecności powszechnie stosowanych buforów, EDTA, tiolowych, sacharozy, glicerolu

Wady:

- metoda Bradford wrażliwa jest na obecność surfaktantów, dlatego też gdy się mierzy stężenie białka w roztworze zawierającym detergenty lepiej jest używać metody BCA

- mała specyficzność wobec różnych białek.

- nawiązując do zasady działania metody, kiedy stężenie białka jest wysokie cała ilość barwnika może zostać przyłączona do białka. Mierzone maksimum absorbancji będzie mierzone przy dł fali 595nm. Jednak, kiedy stężenie białka jest relatywnie małe absorbancja przy dł fali wynoszącej 465 nm pochodząca od pozostałego barwnika, która nie może się przyłączyć do białka, wpłynie na dokładność wyników pomiarów.

IV. LITERATURA

[1] Jakób M. Kolorymetryczne oznaczenie stężenia białka przez reakcję z barwnikiem Coomassie Brilliant Blue G-250 Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z enzymologii

[2] http://www.biotechnologia.com.pl/biotechnologia-portal/info/biotechnologia/32_opracowania/8450,detekcja_biaek_przy_uzyciu_technologii_western_blot_.html

[3] Lü X. , Li D. , Huang Y. , Zhang Y. Application of a modified Coomassie brilliant blue protein assay in the studyof protein adsorption on carbon thin films; 2007; Science Direct; 6843-6846

---