1
Ćwiczenie 3
Metody oznaczania stęŜenia białka
Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych
•
Kwas ortofosforowy – C
•
Wodorotlenek sodu – C
•
Miedzi (II) siarczan kryst. 5 hydrat – Xn, N
•
Etanol 96% - F
SPEKTROFOTOMETRIA ABSORPCYJNA
W metodach spektrofotometrycznych wykorzystuje się zjawisko pochłaniania (selektywnej absorpcji)
promieniowania przez badane substancje w celu ich wykrycia, identyfikacji lub ilościowego oznaczenia, gdyŜ
cechą charakterystyczną kaŜdej substancji chemicznej jest zdolność do absorpcji ściśle określonych kwantów
promieniowania z zakresu widma elektromagnetycznego. Ze względu na wykorzystywany zakres widma (Tab. 1)
dokonuje się podziału na spektrofotometrię absorpcyjną w świetle widzialnym, zwaną kolorymetrią
i absorpcjometrię w nadfiolecie i podczerwieni. W badaniach analitycznych zastosowanie znalazła
absorpcjometria w zakresie światła widzialnego (VIS) oraz bliskiego ultrafioletu (UV). Absorpcja promieniowania
z tych przedziałów długości fal zaleŜy głównie od ilości i rozmieszczenia elektronów w badanej cząsteczce, oraz
powoduje wzbudzenie cząsteczki danego związku polegające na przeniesieniu elektronów na wyŜszy poziom
energetyczny.
Rodzaj promieniowania
Długość fali
promienie
γ
poniŜej 10 pm
promienie X
10 pm-10 nm
ultrafiolet daleki
10-200 nm
ultrafiolet bliski
200-390 nm
światło widzialne
390-800 nm
podczerwień
800 nm-1 mm
Mikrofale
1 mm-30 cm
Tabela 1 Widmo promieniowania elektromagnetycznego.
Ilościową miarą charakteryzującą zdolność pochłaniania promieniowania przez dany związek jest absorbancja
oznaczana literą A (Uwaga: absorbancja zwana jest teŜ ekstynkcją i oznaczana literą E). Pomiar absorbancji
oparty jest na prawie Lamberta-Beera, które określa zaleŜność pomiędzy natęŜeniem promieniowania
padającego na roztwór danego związku (I
o
) a natęŜeniem promieniowania przechodzącego (I) przez warstwę
badanej próbki zgodnie z poniŜszym wzorem:
A = log (I
o
/ I) = kcl
2
A – absorbancja (ekstynkcja)
I
o
– natęŜenie światła monochromatycznego o określonej długości fali padającego na roztwór
I – natęŜenie światła po przejściu przez roztwór
k – współczynnik absorbancji właściwej dla danej długości fali, wielkość charakterystyczna dla danej
substancji (niezaleŜna od jej stęŜenia) i rozpuszczalnika dla danej długości fali, liczbowo równa
absorbancji roztworu o stęŜeniu 1 mol/l i grubości warstwy l = 1 cm
c – stęŜenie danego związku (mol/l)
l – grubość warstwy absorbującej, standardowo l = 1 cm, gdyŜ w badaniach biochemicznych grubość
stosowanych kuwet wynosi zwykle 1 cm
Badanie selektywnego pochłaniania promieniowania przez dany związek w zaleŜności od długości fali
λ
pozwala
na wyznaczenie jego widma absorpcyjnego. Rozkład maksimów i minimów w widmie zaleŜy od właściwości
barwnych związku (maksimum absorbancji określa barwę). Gdy zakres długości fal promieniowania
absorbowanego przez dany związek jest dostatecznie wąski, to związek ten ma barwę dopełniającą do barwy
absorbowanego promieniowania. Jeśli dany związek absorbuje promieniowanie o kilku barwach, to jego
ostateczna barwa jest kombinacją barw dopełniających do tych absorbowanych. Związki bezbarwne nie
pochłaniają fal w widzialnym obszarze widma, a z kolei związki czarne pochłaniają wszystkie długości fal. Dzięki
znajomości widma absorpcyjnego badanego związku moŜliwe jest oznaczenie jego stęŜenia (ilości) w roztworze,
gdyŜ moŜna wybrać światło monochromatyczne o takiej długości fali, która jest maksymalnie absorbowana przez
dany związek. Do oznaczania stęŜenia bezbarwnych związków stosuje się specjalne odczynniki, z którymi tworzą
one barwne pochodne.
Rys. 1 Widmo absorpcyjne
StęŜenie badanej substancji w roztworze moŜna obliczyć:
1. korzystając bezpośrednio z prawa Lamberta-Beera dokonując pomiaru absorbancji próby badanej (A
b
)
i absorbancji próby wzorcowej o znanym stęŜeniu (A
w
):
A
b
/A
w
= kc
b
l/kc
w
l = c
b
/c
w
⇒
⇒
⇒
⇒
c
b
= (A
b
/A
w
)c
w
Uwaga: PowyŜszą zaleŜność moŜna stosować tylko wtedy, gdy obserwuje się prostoliniową zaleŜność
między stęŜeniem danego związku a mierzoną absorbancją.
2. stosując krzywą kalibracyjną (wzorcową, standardową)
Dokonuje się pomiaru absorbancji próby badanej (A
b
) i absorbancji kilku prób wzorcowych o znanym
stęŜeniu (A
w1
...A
wn
), a po wykreśleniu zaleŜności absorbancji próbek wzorcowych (A
w
) od ich stęŜenia
(c
w
) otrzymuje się prostą przechodząca przez początek układu współrzędnych. Znając absorbancję badanej
próby z krzywej wzorcowej odczytuje się stęŜenie zawartego w niej związku, ale jedynie w jej prostoliniowym
zakresie.
Uwaga 1: Na osi odciętych odkłada się wartości stęŜeń, a na osi rzędnych – uzyskane wartości absorbancji.
Uwaga 2: Przyjmuje się, Ŝe absorbancja czystego rozpuszczalnika (w którym rozpuszczony się dany
związek) i względem, którego wykonuje się pomiary spektrofotometryczne wynosi zero. Ślepa odczynnikowa
A
3
(ślepa, próbka kontrolna) składa się ze wszystkich odczynników dodawanych w takiej samej ilości oraz takiej
samej kolejności jak miało to miejsce w przypadku próbki właściwej.
Rys. 2 Krzywe wzorcowe dla: a – roztworu stosującego się do prawa Lamberta-Beera, b – roztworu
wykazującego przy duŜych stęŜeniach odchylania od praw absorpcji.
1. Oznaczanie zawartości białka metodą pomiaru w nadfiolecie
Aminokwasy nie absorbują światła widzialnego (tj. są one bezbarwne) i z wyjątkiem aminokwasów
aromatycznych (Trp, Tyr, Phe, His) nie absorbują równieŜ światła nadfioletowego o długości powyŜej 240 nm.
Białka natomiast absorbują światło nadfioletowe w paśmie 260-290 nm, ze względu na obecność w ich
łańcuchach aminokwasów aromatycznych (głównie reszt Trp i Tyr odpowiedzialnych za pochłanianie większości
światła ultrafioletowego). Zwykle odczytu absorbancji białek dokonuje się przy długości fali 280 nm, gdyŜ Trp i Tyr
wykazują maksimum absorbancji właśnie przy tej długości fali. Przyjmuje się, Ŝe ilość zaabsorbowanego światła
jest proporcjonalna do ilości białka, ale róŜne ilości Trp i Tyr w poszczególnych białkach powodują utrudnienie
w ilościowej ocenie stęŜenia białka w roztworze tą metodą. Dodatkowo w tym samym zakresie światła UV
absorbują równieŜ kwasy nukleinowe i nukleotydy, których maksimum pochłaniania jest przy długości fali 260 nm.
W zmodyfikowanej metodzie spektrofotometrycznej stęŜenie białka w próbce określa się na podstawie
róŜnicy absorbancji mierzonych przy długościach fal 260 i 280 nm stosując kuwetę kwarcową o grubości 1 cm,
a stęŜenie białka wyraŜone w mg/ml oblicza się wg wzoru podanego przez Layne’a:
C
białka
= 1,55
*
A280 – 0,76
*
A260
Zaletą zmodyfikowanej metody spektrofotometrycznej jest moŜliwość szybkiego określenia stęŜenia białka w
duŜej ilości próbek bez konieczności korzystania z odnośnika białkowego i krzywej kalibracyjnej, równieŜ przy
dokonywaniu pomiarów w małej ilości materiału w obecności duŜych stęŜeń NaCl czy (NH
4
)
2
SO
4
. Jest to metoda
wykorzystywana na przykład przy oznaczaniu stęŜenia białka we frakcjach uzyskiwanych podczas rozdziału
chromatograficznego na kolumnach. Ponadto metoda ta eliminuje wkład kwasów nukleinowych
w wartość mierzonej absorbancji, o ile ich zawartość w mieszaninie nie jest większa niŜ 20%. Niemniej jednak
metoda ta jest obarczona duŜym błędem i daje tylko przybliŜone wyniki, gdyŜ zarówno białka, jak i kwasy
nukleinowe, nie dają identycznych wartości absorbancji maksymalnych przy jednakowych stęŜeniach. Ponadto,
równieŜ inne związki małocząsteczkowe (puryny, pirymidyny, fenole) cechują się duŜa absorbancją przy 260 nm
i 280 nm.
Wykonanie
Zmierzyć wartość absorbancji próbki badanej przy długościach fal 260 i 280 nm wobec ślepej odczynnikowej tj.
roztworu/rozpuszczalnika, w którym jest rozpuszczone białko; w kuwecie kwarcowej o grubości 1 cm. Obliczyć
orientacyjną zawartość białka korzystając z podanego powyŜej wzoru. Do kuwety odpipetować po 0,5 ml
roztworów próbek badanych P1, P2, P3 i P4.
2. Oznaczanie zawartości białka metodą mikrobiuretową
Zasada oznaczania – patrz metoda biuretowa Piotrowskiego (Ćwiczenie 2).
StęŜenie [mg/ml]
Absorbancja
a
b
4
Dzięki zastosowaniu spektrofotometrycznego pomiaru absorbancji fiołkowego kompleksu powstającego na
skutek reakcji jonów miedzi w środowisku zasadowym z wiązaniami peptydowymi, przy długości fali 310 nm
uzyskuje się 50-krotny wzrost czułości oryginalnej metody biuretowej opracowanej przez Itzhaki i Gill (Itzhaki RF,
Gill DM (1964) Anal Biochem 9: 401-10). Dodatkowo, opcjonalne traktowanie oznaczanej próby 0,5 M roztworem
NaOH zamiast wody, umoŜliwia oznaczenie zawartości białka w płynach biologicznych, homogenatach
komórkowych czy frakcjach subkomórkowych. Rodzaj oznaczanego białka nie ma wpływu na wartość mierzonej
absorbancji.
Wykonanie
Przygotować próbki serii A i B wg Tabeli 1. Do kaŜdej probówki serii A dodać po 0,25 ml 0,21% roztworu
CuSO
4*
5H
2
O w 30% roztworze NaOH, a do probówek serii B – po 0,25 ml 30% roztworu NaOH. Zawartość
eppendorfów wymieszać i po upływie 5 minut zmierzyć w spektrofotometrze UV-VIS absorbancję wszystkich
próbek przy długości fali 310 nm. Absorbancję próbek serii A odczytać wobec ślepej odczynnikowej A
o
(parametr
A dla kaŜdej próbki serii A), natomiast absorbancję próbek serii B wobec ślepej odczynnikowej B
o
(parametr B).
Absorbancję właściwą wszystkich oznaczanych prób obliczyć z róŜnicy A-B. Na podstawie otrzymanych wartości
absorbancji właściwej dla wzorcowych roztworów BSA uzupełnić Tabelę 1 i wykreślić krzywą kalibracyjną
zaleŜności zmierzonych absorbancji od stęŜenia białka. Z krzywej kalibracyjnej odczytać zawartość białka
w badanych próbkach P1, P2, P3 i P4.
Uwaga: wszystkie oznaczenia wykonywać w trzech równoległych powtórzeniach.
3. Oznaczanie zawartości białka metodą Bradforda
Bradford MM (1976) Anal Biochem 72: 248-54.
W metodzie Bradforda wykorzystywana jest zdolność wiązania się barwnika zwanego błekitem
kumazyny (ang. Coomassie Brilliant Blue G-250) z białkiem za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych.
Z barwnikiem reagują głównie reszty argininy, a w minimalnym stopniu reszty histydyny, lizyny, proliny, tryptofanu
i tyrozyny. W środowisku kwaśnym (w roztworze kwasu H
3
PO
4
) błękit kumazyny przyjmuje zabarwienie brunatne.
Dodanie błękitu kumazyny do roztworu białka powoduje powstawanie kompleksu o intensywnie niebieskim
zabarwieniu i przesunięcie maksimum absorbancji barwnika z 465 nm do 595 nm. Efekt ten jest konsekwencją
występowania barwnika w dwóch róŜnych formach – brunatnej i niebieskiej. Forma brunatna ulega konwersji do
niebieskiej po związaniu się barwnika z białkiem. Wiązanie to jest procesem bardzo szybkim (poniŜej 2 minut), a
kompleks barwnik-białko pozostaje trwały i nie agreguje w roztworze przez stosunkowo długi czas (do 60 minut).
NatęŜenie barwy niebieskiej jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze. Optymalny czas pomiaru
wynosi od 5 do 20 minut od dodania odczynnika Bradforda do próbki. Zaletami metody są prostota
i szybkość wykonania, oraz jej czułość (białko moŜe być wykryte przy jego stęŜeniu w granicach 2-8
µ
g/ml).
Oznaczenie moŜna wykonywać w obecności powszechnie stosowanych buforów, wersenianu sodu (EDTA),
jonów magnezu, sacharozy, glikolu i związków tiolowych. Wadą metody jest róŜne wiązanie barwnika przez róŜne
białka, a ponadto fakt, Ŝe aceton, siarczan dodecylu sodu (SDS) i Triton X-100 dają w połączeniu
z barwnikiem dodatkowy interferujący kolor, co zwiększa natęŜenie barwy niebieskiej i przeszkadza w uzyskaniu
wiarygodnych wyników.
Wykonanie
Przygotować ślepą odczynnikową, wzorce oraz próbki badane wg Tabeli 2. Do kaŜdej próbki dodać po 250
µ
l 5-
krotnie rozcieńczonego odczynnika Bradforda. Po upływie minimum 5 minut (a przed upływem 20 minut) od
momentu dodania odczynnika Bradforda, zmierzyć w czytniku do płytek titracyjnych wartości OD wszystkich
próbek przy długości fali 595 nm. Na podstawie otrzymanych wartości OD
595
uzupełnić Tabelę 2. Od wartości
OD
595
dla wzorców i próbek badanych odjąć wartość OD
595
ślepej odczynnikowej. Wykreślić krzywą kalibracyjną
zaleŜności zmierzonych OD
595
od stęŜenia białka. Z krzywej kalibracyjnej odczytać zawartość białka w badanych
próbkach P1, P2, P3 i P4.
Uwaga: wszystkie oznaczenia wykonywać w trzech równoległych powtórzeniach.
Odczynniki
wzorcowe roztwory BSA o stęŜeniu 1mg/ml i 0,5 mg/ml; roztwory badanych próbek P1, P2, P3 i P4;
30% roztwór NaOH ; 0,21% roztwór CuSO
4*
5H
2
O w 30% NaOH; odczynnik Bradforda: 0,01% (w/v) błękit
kumazyny, 4,7% (w/v) etanol, 8,5% (w/v) kwas ortofosforowy