1

Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi Katedry Diagnostyki Laboratoryjnej.
Konspekt do zajęć prowadzonych w ramach przedmiotu Fizjologia stosowana dla studentów II roku Wydziału
Lekarskiego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi.
Rok akademicki 2008/2009.

Ćwiczenie 2

Mechanizmy antykoagulacyjne oraz testowanie ich sprawności

za pomocą badań diagnostycznych

Wprowadzenie

Zachwianie równowagi tendencji antykoagulacyjnych i prokoagulacyjnych w

układzie hemostazy prowadzi z jednej strony do krwawienia, z drugiej do powstawania
zakrzepów.
W celu lepszego zrozumienia mechanizmów prowadzących do powstawania zakrzepów
należy przypomnieć klasyczną triadę Virchowa, który w 1856 roku określił trzy zasadnicze
przyczyny zakrzepicy: zmiany w przepływie krwi, zmiany w ścianie naczynia oraz zmiany
w samej krwi. Tworzenie zakrzepów w żylnej części układu naczyniowego („zakrzep
czerwony”) zależy od stanu równowagi pomiędzy aktywatorami a inhibitorami krzepnięcia,
istotną rolę odgrywa zwolnienie przepływu krwi i osłabiona aktywność układu
fibrynolitycznego. O wystąpieniu zakrzepów w naczyniach tętniczych („zakrzep biały”)
decydują w głównej mierze interakcje między płytkami krwi a ścianą naczynia
krwionośnego.
Złożone mechanizmy biorące udział w równoważeniu tendencji prozakrzepowych dla
uproszczenia nazywa się układem antykoagulacyjnym.
Układ antykoagulacyjny nie jest wyodrębnionym systemem; należałoby raczej mówić o
mechanizmach

antykoagulacyjnych

funkcjonujących

w

obrębie

zwyczajowo

wyodrębnianych elementów tworzących układ hemostazy, tzn.: układu fibrynolitycznego,
układu krzepnięcia, czy ściany naczyń.
Najważniejsze składniki układu antykoagulacyjnego to:
1. układ fibrynolityczny
2. inhibitory osoczowe układu krzepnięcia
3. układ białka C
4. ściana naczyń krwionośnych

Układ fibrynolityczny
Obserwacja lizy we frakcji euglobulin

Fizjologiczne znaczenie układu fibrynolitycznego to rozpuszczanie śródnaczyniowych
złogów fibryny i utrzymanie drożności łożyska naczyniowego.

Składniki:
Plazminogen przekształcany jest przez aktywatory (ograniczona proteoliza) w plazminę –
enzym o szerokiej swoistości substratowej. Trawi: fibrynogen, fibrynę, czynniki: XIII, V,
VIII, vWf, glikoproteiny płytkowe.

Aktywatory fibrynolizy
t-PA, u-PA i β

β

β

βXIIa: powstają głównie w układzie kalikreina-kininogen-czXIIa (βXIIa)

aktywatory zewnątrzpochodne: streptokinaza (leczenie fibrynolityczne).

2

Inhibitory fibrynolizy
α

α

α

α

2

-antyplazmina – główny osoczowy inhibitor plazminy. W jego obecności wolna

plazmina jest natychmiast inaktywowana i powstają kompleksy PAP, znane jako markery
aktywacji układu fibrynolitycznego.
α

α

α

α

2

-makroglobulina inaktywuje pozostałą ilość wolnej plazminy (inhibitor rezerwowy)

PAI-1 – główny inhibitor aktywatora pazminogenu t-PA. W jego obecności t-PA także jest
błyskawiczne kompleksowany. Powstają kompleksy t-PA/PAI-1.
PAI-2 ma mniejsze znaczenie.

TAFI - inhibitor fibrynolizy aktywowany przez trombinę. Jest jednym z modulatorów
hemostazy łączącym układ krzepnięcia z układem fibrynolizy. Jego aktywacja do formy
czynnej (TAFIa), następuje przy udziale trombiny. Kompleks trombiny z trombomoduliną
przyśpiesza tę reakcję około 1200-krotnie. Aktywny TAFI mając właściwości
prokarboksypeptydazy odszczepia z sieci fibryny C-końcowe reszty lizynowe niezbędne
do aktywacji plazminogenu przez t-PA. Ponadto TAFI zaburza proces konwersji glu-
plazminogenu do lys-plazminogenu. Powoduje to zmniejszenie tworzenia plazminy i
upośledza lizę skrzepu. Wzrost stężenia aktywnego TAFI w osoczu wywiera działanie
prozakrzepowe. Podwyższone wartości TAFIa obserwowano w zakrzepicy naczyń
żylnych, cukrzycy typu 2, otyłości, chorobie wieńcowej, zespole nerczycowym oraz u
chorych po przeszczepie nerek. Spadek stężenia TAFIa powoduje wzrost generacji
plazminy i nasila proces fibrynolizy. Obniżone wartości TAFIa obserwowano u chorych na
ostre białaczki szpikowe. Niskie wartości tego inhibitora mogą być współodpowiedzialne
za występowanie skazy krwotocznej. Ostatnie doniesienia wskazują również na udział
TAFI w procesach zapalnych.

Produkty degradacji plazminy
FDP (> 2 µ

µ

µ

µg/ml) – produkty degradacji fibrynogenu i fibryny

Dimr D (> 0,5 µ

µ

µ

µg/ml) – produkty degradacji fibryny. Duże znaczenie w praktyce klinicznej.

Niskie stężenie DD wyklucza występowanie procesów zakrzepowo-zatorowych.

Na powierzchni błony komórkowej komórek śródbłonka występuje wieloproteinowy
receptor kininogenu (cytokreatyna, receptor urokinazowy+gC1qR0).
Prekalikreina (PK) i czynnik XI krążą w osoczu związane z wielkocząsteczkowym
kininogenem (HK). Kompleks PK – HK wiąże się specyficznie do komórek śródbłonka za
pośrednictwem tego receptora w obecności Zn

2+

. Do kompleksu przyłącza się czynnik XII,

przyśpieszając aktywację PK do kalikreiny.
W obrębie tego kompleksu aktywowany jest także czynnik XI, czyli składnik układu
krzepnięcia. W warunkach fizjologicznych ma to jednak małe znaczenie. Aktywacja
zależna od czynników kontaktu nabiera znaczenia w czasie kontaktu ze sztucznymi
powierzchniami.
W opisanym kompleksie kalikreina uwalnia bradykininę a ta stymuluje uwalnianie t-PA i
syntezę prostacykliny.

Inhibitory osoczowe układu krzepnięcia

Podstawowe inhibitory
AT (antytrombina) - najlepiej poznany inhibitor krzepnięcia, uaktywniany przez wydzielaną
przez komórki tuczne heparynę (lub podawaną zewnętrznie), inaktywuje wszystkie
proteazy krzepnięcia, najsilniej czynnik X i trombinę. Powstają ważne z punktu widzenia
diagnostyki kompleksy TAT.
TFPI (inhibitor drogi krzepnięcia zależnej od TF) – inaktywacja czynnika Xa i kompleksu
TF – VIIa.

3

ZPI (inhibitor proteaz zależny od białka Z) – hamowanie czynnika Xa
HC II (kofaktor II heparyny) – inhibitor „rezerwowy”, inaktywuje głównie trombinę

Nowopoznane inhibitory
Neksyna 1, hamująca trombiny, plazminy i urokinazy
Aneksyna V – białko o wysokim powinowactwie do fosfolipidów, współzawodniczy z
czynnikami krzepnięcia o dostęp do fosfolipidów błon komórkowych.


Układ białka C

Składniki:
Trombomodulina – białko związane z powierzchnią komórek śródbłonka
Białko C – występuje w osoczu jako zymogen proteazy serynowej (zależnej od wit. K)
Białko S – glikoproteina zależna od wit. K, kofaktor białka C.

Działanie układu inicjowane jest przez trombinę przyłączoną do związanej ze
śródbłonkiem trombomoduliny. Trombomodulina - jak sama nazwa wskazuje - posiada
zdolność zmieniania funkcji trombiny. Trombina po związaniu z trombomoduliną nabywa
zdolności aktywowania białka C, a to białko z kolei, w obecności kofaktora, którym jest
białko S, degraduje i inaktywuje aktywne czynniki VIII i V. Dodatkowo, aktywne białko C
ma własności profibrynolityczne, ponieważ wiąże inhibitor fibrynolizy PAI-1.
W układzie hemostazy trombina pełni różne (paradoks trombiny), często przeciwstawne
funkcje. Z jednej strony jest odpowiedzialna za przekształcenie fibrynogenu we włóknik, z
drugiej (po połączeniu z trombomoduliną) funkcjonuje jako aktywator układu
antykoagulacyjnego.


Ściana naczyń krwionośnych

Znaczenie w regulacji mechanizmów hemostazy mają kolejne składniki ściany naczyń:
warstwa mięśni gładkich (skurcz naczyń), warstwa podśródbłonkowa (aktywacja układu
hemostazy po uszkodzeniu śródbłonka) oraz śródbłonek.
Śródbłonek jest źródłem substancji o działaniu mitogennym: PDGF, FGF i EDGF, o
działaniu prozakrzepowym: PAI-1, vWF, a przede wszystkim substancji o działaniu
przeciwakrzepowym. Oprócz wymienionej zdolności do ekspresji trombomoduliny, jest
źródłem t-PA, NO, prostacyklin, enzymów degradujących ADP. Śródbłonek pokryty
dodatkowo antyzakrzepowym glikokaliksem jest podstawowym składnikiem układu
antykoagulacyjnego w tętniczej części układu naczyniowego.

4

Zakrzepica to zjawisko powstawania skrzeplin w nieuszkodzonych naczyniach
krwionośnych na skutek zachwiania równowagi układu hemostazy. Może ona
dotyczyć:

• naczyń tętniczych (zakrzepica tętnicza),
• naczyń żylnych (zakrzepica żylna), i/lub
• naczyń włosowatych i przedwłosowatych (rozsiane krzepnięcie śródnaczyniowe,

DIC).

Trzy zasadnicze przyczyny warunkujące rozwój zakrzepicy, zwane potocznie triadą
Virchowa, to:
• zmiany w przepływie krwi (zmiany reologiczne),
• zmiany dotyczące ściany naczyniowej,
• zmiany składu krwi.

O różnicach w etiopatogenezie zakrzepicy żylnej i tętniczej decydują odmienności dwóch
składników triady Virchowa:

a) parametrów przepływu krwi (reologii krwi) w naczyniach żylnych i tętniczych, oraz
b) roli ściany naczyniowej, wynikającej z jej odmiennej budowy w naczyniach żylnych
i tętniczych.

Powszechnie wyróżnia się dwie grupy czynników ryzyka choroby zakrzepowo-zatorowej:
wrodzone (genetycznie uwarunkowane) oraz nabyte, jakkolwiek przynależność niektórych
uznanych czynników ryzyka do jednej z tych dwóch grup pozostaje nadal dyskusyjna.

Zaburzenia prozakrzepowe układu hemostazy towarzyszące różnym zespołom
chorobowym

DIC - rozsiane krzepnięcie wewnątrznaczyniowe to niekontrolowana aktywacja układu
hemostazy, występująca jako powikłanie wielu chorób. Następuje zużycie wszystkich
czynników hemostazy, wielonarządowa niewydolność i krwawienie.
Choroby wątroby .
Większość nowotworów, a szczególnie dotyczących przewodu pokarmowego, płuc, układu
rozrodczego, związana jest z nadpłytkowością a tym samym ze zwiększonym ryzykiem
zakrzepicy.
Zakrzepy i zatory są także częstym powikłaniem chorób nerek (kłębuszkowe zapalenie
nerek, zespółnerczycowy), choroby niedokrwiennej serca i cukrzycy.
Zwiększona gotowość zakrzepowa
Okres ciąży i połogu.
Ekstremalny wysiłek fizyczny.
Długotrwałe unieruchomienie.
Stosowanie doustnych środków antykoncepcyjnych i hormonalna terapia zastępcza.
Otyłość, żylaki, podeszły wiek.
Choroby autoimmunologiczne i często z nimi związany zespół antyfosfolipidowy.
Zastoinowa niewydolność serca, zawał, migotanie przedsionków.
Rozległe złamania i urazy.
Duże zabiegi chirurgiczne.
Nowotwory złośliwe, czerwienica prawdziwa, nadpłytkowość.
Choroby zapalne jelit, zespół nerczycowy.

5

TROMBOFILIA

Trombofilia to wrodzone lub nabyte zaburzenia mechanizmu hemostazy, które
usposabiają do powstawania zakrzepów.
Termin ”wrodzona trombofilia” oznacza obecnie dziedzicznie uwarunkowaną skłonność do
zakrzepicy żylnej
Z wieloletnich doświadczeń wynika, że diagnostyka i wykrywanie trombofilii dotyczy
głównie badania sprawności układu białka C.

Najczęściej opisywane zaburzenia tego rodzaju to (dane średnie dla ludności
indoeuropejskiej):





mutacja cz V Leiden (hetero) -

1 – 15 5 – 8 x 40 - 50

mutacja 20210A protrombiny (hetero)-

1 – 6.5 2 – 4 x 18 - 24

niedobór białka S -

< 1

10 x

1 - 13

niedobór białka C -

0.2 – 0.4 10 x 1 - 9

niedobór AT -

0.02 10 x 1 - 7

zwiększone stężenie cz. krzepnięcia – bd 2 – 3 x 15 – 25
zespół antyfosfolipidowy –

3 – 5 10 x 5 - 15

hiperhomocysteinemia -

0.3 – 1 2 x 15 - 20

Prezentowane zestawienie pomija rzadziej występujące, lecz także bardzo istotne
przyczyny rozwoju trombofilii, zachwianie równowagi t-PA/PAI, niedobór plazminogenu.
Ponadto, zestawienie to dotyczy tylko niedoborów, bez uwzględnienia zaburzeń funkcji
poszczególnych inhibitorów. Analizując przedstawione wyniki widzimy duże różnice w
częstości występowania niedoborów.
Przedstawione dysfunkcje, oczywiście znacznie częściej, występują u pacjentów z
rozpoznaną żylną lub tętniczą chorobą zakrzepową.

Szerszego omówienia wymaga najczęściej występująca dysfunkcja - oporność na aktywne
białko C (APCR, Activated Protein C Resistance). Powodem oporności na białko C jest
punktowa mutacja genu dla osoczowego czynnika V. Mutacja ta polega na zamianie
pojedynczego aminokwasu argininy na glutaminę w pozycji 506. Podstawienie to istotnie
utrudnia hydrolizę czynnika V przez aktywne białko C. Wówczas aktywne białko C inaktywuje
czynnik VIII, lecz nie może sprawnie i wydajnie unieczynniać czynnika V. W wielu
przypadkach jest to powodem pojawiania się incydentów zakrzepowych już w młodym wieku.
Zaburzenia zakrzepowe wywołane przez omówione defekty układu antykoagulacyjnego
ujawniają się najczęściej po zabiegach chirurgicznych, w czasie ciąży, połogu, w czasie
długotrwałego unieruchomienia czy stosowania środków antykoncepcyjnych. Jak w ponad
30% przypadków nawet osobom homozygotycznym pod względem tej mutacji udaje się
ustrzec incydentów zakrzepowych.

Ogólna

populacja

%

Ryzyko

względne

śChZZ

częstość

u pacjentów z

śChZZ

6

Oddzielnego omówienia wymaga tzw. nabyta trombofilia, której przykładami są zespół
antyfosfolipidowy i hiperhomocysteinemia.

Przeciwciała antyfosfolipidowe antykoagulanta tocznia (Lupus anticoagulant antibodies,
LA) obejmują różne klasy immunoglobulin osocza krwi, a ich podwyższone miano może
interferować w testach diagnostycznych opartych na wykrzepianiu zależnym od
składników fosfolipidowych płytek krwi. W przeciwieństwie do innych inhibitorów układu
krzepnięcia, LA nie hamują aktywności większości specyficznych czynników osoczowych
krzepnięcia. Autoprzeciwciała skierowane są przeciwko istotnym w regulacji hemostazy
ujemnie naładowanym fosfolipidom (fosfatydyloseryna-β2-GPI).
Przeciwciała LA mogą występować u około 10% pacjentów z ogólnoustrojowym toczniem
rumieniowatym (SLE), jak również mogą towarzyszyć wszelkim innym chorobom
autoimmunologicznym, takim jak np. zakażenie wirusem HIV (około 50% pacjentów) czy
choroba Castlemana (choroba żołądka). U pacjentów z toczniem rumieniowatym (SLE) i
antykoagulantem tocznia (LA) ryzyko wystąpienia choroby zakrzepowej szacuje się na
około 40%, podczas gdy u osób charakteryzujących się jedynie podwyższonym mianem
LA ryzyko to jest o około 10% niższe. Zjawisko spontanicznych krwawień na skutek
podwyższonego miana LA odnotowuje się rzadziej niż u 1% pacjentów. U około 40%
pacjentów stwierdza się małopłytkowość.
Dokładny mechanizm działania przeciwciał antyfosfolipidowych (aPL) nie został do końca
poznany. Uważa się, że charakteryzują się one silnym powinowactwem do fosfolipidów
niezbędnych w kluczowych reakcjach układu antykoagulacyjnego, prawdopodobnie
blokują działanie układu białka C.

Homocysteina jest aminokwasem powstającym podczas metabolizmu metioniny. W
ostatnich latach postrzegana jako czynnik cytotoksyczny dla komórek śródbłonka,
przyczyniający się do powstawania blaszki miażdżycowej. Sugeruje się udział
homocysteiny w przyspieszonym złuszczaniu komórek śródbłonka i utlenianiu LDL. Sądzi
się, że hiperhomocysteinemia (na przykład jako wynik niedoboru reduktazy
metylenotetrahydrofolianu (polimorfizm 677CT MTHFR) może wpływać na obniżoną
aktywność trombomoduliny, nasiloną ekspresję czynnika tkankowego i czynnika V, oraz
obniżoną aktywność fibrynolityczną.

W podsumowaniu przedstawionych informacji można stwierdzić, że opisywane i
dyskutowane tutaj zaburzenia odnoszą się jedynie do wycinka możliwych defektów układu
antykoagulacyjnego. Wykrywane są zależnie od rejonu geograficznego np. u 20-60% osób z
powikłaniami zakrzepowymi. Konieczny jest w z związku z tym rozwój metod wczesnego
wykrywania trombofilii

Powszechnie uznane czynniki ryzyka zakrzepicy żylnej:

• Wcześniej przebyte incydenty zakrzepowo-zatorowe
• Okres ciąży i połogu
• Długotrwałe unieruchomienie
• Stosowanie doustnych środków antykoncepcyjnych i hormonalna terapia zastępcza
• śylaki, podeszły wiek
• Zespół antyfosfolipidowy
• Rozległe złamania i urazy, duże zabiegi chirurgiczne
• Nowotwory złośliwe, czerwienica prawdziwa, nadpłytkowość
• Homocysteinemia
• Podwyższone stężenie czynników VIII, IX, XI
• Trombofilia

7

Dodatkowe czynniki ryzyka zakrzepicy żylnej:

• Długotrwałe unieruchomienie w czasie podróży
• Brak aktywności fizycznej
• Otyłość
• Choroby autoimmunologiczne
• Zastoinowa niewydolność serca, zawał, migotanie przedsionków
• Choroby zapalne jelit, zespół nerczycowy

Ogólne czynniki ryzyka zakrzepicy tętniczej:

• Nadciśnienie tętnicze
• Cukrzyca, otyłość
• Zwiększone stężenie cholesterolu we frakcji LDL
• Brak aktywności fizycznej
• Palenie nikotyny
• Hiperhomocysteinemia

Hemostatyczne czynniki ryzyka zakrzepicy tętniczej:

• Dysfunkcja komórek śródbłonka,
• Hiperfibynogenemia (polim. G/

A

nukleotydu 455, polim. C/

T

nukleotydu 148),

• Zahamowanie fibrynolizy (polim. PAI-1

4G

/5G),

• Wzrost aktywności cz VII,
• Wzrost aktywności/stężenia cz VIII i von Willebranda,
• Wzrost reaktywności płytek krwi.

Diagnostyka stanów związanych z nadkrzepliwością

W warunkach prawidłowej hemostazy czop hemostatyczny nie powinien powstawać
wewnątrz szczelnych, nieuszkodzonych naczyń krwionośnych, a jeżeli w nich powstaje,
mamy do czynienia z zakrzepicą. W zależności od rodzaju naczyń objętych zakrzepicą
określamy ja jako zakrzepicę żylną lub tętniczą.
W niektórych stanach fizjologicznych i chorobowych mamy do czynienia ze zwiększona
gotowością pokoagulacyjną, stan ten określa się także jako nadkrzepliwość i w pewnych
warunkach może rozwinąć się w zakrzepicę.

Diagnostyka zakrzepicy zależy od lokalizacji zmian zakrzepowych, ale jak miało to miejsce
w diagnostyce skaz krwotocznych, w pierwszej kolejności przeprowadzane jest badanie
podmiotowe (wywiad: np. występowanie zakrzepicy w rodzinie) oraz badanie
przedmiotowe. Dalsza diagnostyka uzależniona jest od umiejscowienia zakrzepu i
obejmuje zestaw technik diagnostycznych takich jak ultrasonografia, diagnostyka
laboratoryjna ma w tym przypadku znaczenie pomocnicze.
W diagnostyce powikłań zakrzepowo-zatorowych znaczenie ma oznaczanie stężenia D-
dimerów, a w diagnostyce DIC dodatkowo miano płytek krwi i aktywność anytrombiny (AT)
w osoczu.
W przypadku zakrzepicy wzrasta stężenie dimeru D, ale biorąc pod uwagę małą swoistość
tego badania możemy je wykorzystywać jedynie do wykluczania zakrzepicy.
W czasie rozpoznawania i monitorowania DIC, oprócz dimeru D, które w zespole ostrym
wielokrotnie przekraczają zakresy referencyjne, obserwujemy spadek aktywności/stężenia
inhibitorów krzepnięcia oraz miana płytek krwi.

8

Diagnostyka laboratoryjna trombofilii

Badanie defektów układu antykoagulacyjnego w pierwszym etapie sprowadza się do
wykonania oznaczeń funkcjonalnych AT, białka C, białka S i APCR, do rutynowych oznaczeń
w laboratoryjnej diagnostyce trombofilii należy badanie w kierunku obecności przeciwciał
antyfosfolipidowych.

Przykładowy zestaw badań laboratoryjnych wykonywanych w diagnostyce
trombofilii

Antytrombina (badanie funkcjonalne)
Białko C (badanie funkcjonalne)
Białko S (stężenie: białko wolne i związane)
Oporność na aktywne białko C (APC-R) (badanie funkcjonalne)
APC-R w kierunku mutacji Leiden (potwierdzające badanie genetyczne)
Mutacja 20210 genu protrombiny (badanie genetyczne)
Zespół antyfosfolipidowy (APTT LA)
Przeciwciała antykardiolipinowe
Stężenie homocysteiny

Na podstawie: P.M. Mannucci, Laboratory Detection of Inherited Thrombophilia. Sem
Thromb. Hemost 31(1) 2005.


Przypuszczalne kierunki rozwoju diagnostyki układu antykoagulacyjnego

• Wprowadzanie nowych, przesiewowych badań funkcjonalnych
• Doskonalenie metod ilościowych oznaczania poszczególnych składników
• Wprowadzanie zestawów do jednoczesnego oznaczania wielu genów (chipy

wielogenowe)

9

Instrukcja wykonania ćwiczenia

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest analiza mechanizmów układu hemostazy ograniczających tendencje
prozakrzepowe i zabezpieczających przed niekontrolowanym rozwojem czopu
hemostatycznego, utrudniającym właściwy przepływ krwi w naczyniach.

Czas fibrynolizy w euglobulinach

Badanie przygotowane wcześniej przez prowadzącego ćwiczenia służy do zobrazowania
działania układu fibrynolitycznego.
Wykonanie: z osocza wytrącana jest frakcja euglobulin (fibrynogen, aktywatory i inhibitory
układu fibrynolitycznego). Osad zawieszany jest w buforze boranowym i wykrzepiany
poprzez dodanie CaCl

2

. Oznaczamy czas rozpuszczenia skrzepu.

Demonstracja wykonania oznaczenia

Sposób przedstawiania wyników: czas wyrażony w minutach

Wartości prawidłowe: 120 min. - 240 min.

Badanie aktywności antytrombiny

Metoda kolorymetryczna z substratem chromogennym
Zasada pomiaru: Do roztworu trombiny dodajemy osocze badane i substrat chromogenny
dla trombiny. Dodana wraz z osoczem antytrombina inaktywuje trombinę. Im większa
aktywność AT tym mniej intensywne zabarwienie roztworu.
Wykonanie: Do dwóch probówek dodajemy roztwór trombiny, do jednej osocze a do
drugiej NaCl. Po inkubacji dodajemy substrat chromogenny dla trombiny.

Demonstracja wykonania oznaczenia

Wartości prawidłowe: 75% - 125%