IZOLACJA Z GLEBY:

1. Bezpośrednia:

• pobieramy kilka próbek z różnych miejsc odległych od siebie o 5-6 metrów

• indywidualne próby umieszczamy w pojemnikach oddychających

• w laboratorium próby indywidualne łączymy w próbę zbiorczą

• dokładnie mieszamy

• izolacja jedną z następujących metod:

• wykładanie drobiny gleby na pożywkę w centrum płytki Petriego

• przemywanie próby gleby wodą i izolacja z zawiesiny komórkowej lub zarodnikowo-strzępkowej

• rozcieńczanie próby gleby i izolacja z mieszaniny rozcieńczalnika (woda, 1% agar lub olej mineralny w stosunku 1:10) i gleby (sterylny piasek kwarcowy)

Pośrednia:

• umieszczanie w glebie pułapek organicznych lub roślin pułapkowych

• izolowanie z pułapek zasiedlających je mikroorganizmów

• pułapki mogą być wprowadzane w rurkach szklanych lub metalowych z otworami bocznymi, przez które dochodzi do kolonizacji

• stosujemy w przypadku prób organicznych

IZOLACJA Z ROŚLINY

• pobieramy fragment rośliny z częścią chorą i zdrową

• przepłukujemy

• sterylizujemy 96% alkoholem

• płuczemy w wodzie destylowanej

• suszymy między warstwami wyjałowionej bibułki w ciepłym powietrzu

• dzielimy na inocula

• wykładamy na pożywkę

• inkubacja 5-10 dni

• wyhodowane kolonie przeszczepiamy na skosy

IZOLACJA Z POWIETRZA

Metoda sedymentacji Kocha - polega na wyeksponowaniu płytki Petriego z pożywką w środowisku, które chcemy zbadać. Drobnoustroje ze środowiska będą opadały na płytkę, a po odstawieniu do inkubacji wytworzą się kolonie. Minimalny czas ekspozycji to 10 min, maksymalny - 60 min. Czas ekspozycji zależy od zanieczyszczenia i intensywności ruchu powietrza.

CFU (colony forming units) - liczba kolonii na płytce w określonej ilości zawiesiny

CFU = liczba kolonii * stopień rozcieńczenia * objętość próbki

KOMORA THOMA - szklana płytka z 2 wgłębieniami (głębokość 0,1 mm) i naniesioną siatką podzieloną na 16 dużych kwadratów o powierzchni 1/400 mm². Każdy z tych kwadratów składa się z 16 małych kwadracików o boku 0,05 mm i objętości pod szkiełkiem nakrywkowym 1/4000 mm³. Komora Thoma służy do bezpośredniego liczenia drobnoustrojów pod mikroskopem.

POŻYWKA - płynne lub zestalone mieszaniny odpowiednio dobranych składników służących do hodowli drobnoustrojów w warunkach sztucznych.

DOBRA POŻYWKA CHARAKTERYZUJE SIĘ:

• odpowiednią wartością odżywczą

• optymalnym odczynem

• odpowiednim ciśnieniem osmotycznym

• klarownością

• sterylnością

POŻYWKA ZAWIERA:

• węgiel (cukry proste i złożone)

• azot (związki nieorganiczne i organiczne)

• sole mineralne (siarczany, fosforany, chlorki żelaza, magnezu potasu, sodu i in.; właściwości buforujące i regulujące ciśnienie osmotyczne)

• czynniki wzrostowe (syntetyczne lub naturalne witaminy)

• składniki wybiórcze (antybiotyki, sole kwasów żółciowych, barwniki; tylko pożywki selektywne i specjalistyczne)

• czynniki zestalające (agar, żelatyna, żel krzemionkowy, białka jaj, surowica krwi)

PODZIAŁ POŻYWEK ZE WZGLĘDU NA:

1. DOBÓR SKŁADNIKÓW ODŻYWCZYCH:

• naturalne

• półsyntetyczne

• syntetyczne

2. ZAWARTOŚĆ SKŁADNIKÓW ODŻYWCZYCH:

• podstawowe

• wzbogacone

3. CEL:

• namnażające

• namnażajaco-wybiórcze

• identyfikacyjne

4. KONSYSTENCJĘ:

• płynne

• półpłynne

• stałe

PODŁOŻA:

1. hipotoniczne - o niższym ciśnieniu osmotycznym niż w komórkach drobnoustrojów (jest przyczyną pęcznienia i pękania komórek)

2. hipertoniczne - o wyższym ciśnieniu osmotycznym niż w komórkach drobnoustrojów (powoduje kurczenie się plazmy komórkowej i zjawisko plazmolizy)

3. izotoniczne - o właściwym ciśnieniu osmotycznym

PODŁOŻE CHAPMANA - pożywka wybiórczo różnicująca. Służy do izolacji gronkowca w warunkach beztlenowych. Elementem różnicującym jest manitol. W wyniku fermentacji manitolu i zakwaszenia środowiska pożywka zmienia kolor z różowego na żółty.

PODŁOŻE MACCONKEYA - pożywka wybiórczo-różnicująca. Elementem różnicującym jest laktoza. Kolor wyjściowy - bezbarwny. Różnicuje bakterie gram- na fermentujące laktozę i nie fermentujące laktozy. Bakterie fermentujące laktozę (Escherichia coli, Klebsiella) zakwaszają podłoże do pH<6,8. Dochodzi do zmiany barwy kolonii z bezbarwnych na czerwono-różowe.

BARWIENIE BAKTERII

• umożliwia dokładniejszą obserwację kształtu i budowy drobnoustrojów

• BARWNIKI:

• fuksyna - zaznacza kontury komórek,

• fiolet krystaliczny - zaznacza kontury barwionych komórek,

• fiolet goryczkowy,

• safranina,

• zieleń malachitowa,

• błękit metylenowy - różnicuje wewnętrzną strukturę komórek,

• erytrozyna (barwnik kwaśny) - barwienie preparatów z gleby; uwidacznia plazmę komórek drobnoustrojów ale nie wybarwia gleby

• BARWIENIE PROSTE - jeden barwnik; obserwacja kształtów

• BARWIENIE ZŁOŻONE - dwa lub wiece barwników, różne sposoby odbarwiania i utrwalania preparatów; różnicuje komórki i ich struktury wewnętrzne

SPOSÓB PRZYGOTOWANIA PREPARATU DO BARWIENIA

• Opalamy nad palnikiem szkiełko przedmiotowe i studzimy.

• Nakładamy kroplę wody.

• Umieszczamy odrobinę materiału hodowlanego w kropli wody.

• Wykonujemy rozmaz na dużej powierzchni szkiełka.

• Wysuszamy rozmaz na powietrzu.

METODA GRAMA

• barwienie złożone

• pozwala wyróżnić gramdodatnie (fioletowe) i gramujemne (czerwone)

• polega na traktowaniu bakterii fioletem krystalicznym a następnie płynem Lugola i safraniną

• fiolet krystaliczny wybarwia bakterie gram+ i gram-

• płyn Lugola utrwala połączenie fioletu z gram+ (gram- odbarwiają się w alkoholu)

• safranina zabarwia gram- na czerwono

SPOSÓB POSTĘPOWANIA:

• Preparat utrwalamy przez trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika.

• Barwimy preparat roztworem fioletu krystalicznego.

• Tryskawką delikatnie zmywamy barwnik.

• Zalewamy preparat płynem Lugola.

• Zlewamy płyn Lugola.

• Spłukujemy preparat wodą.

• Otrząsamy z wody i zalewamy roztworem safraniny.

• Spłukujemy preparat wodą i osuszamy.

METODA SCHAFFERA-FULTONA

• barwienie złożone

• polega na traktowaniu bakterii zielenią malachitową i safraniną

• barwienie przetrwalników (Bacillus i Clostridium)

• przetrwalniki barwią się tylko na gorąco

• zieleń malachitowa barwi protoplazmę przetrwalników na zielono

• safranina wybarwia protoplazmę komórek wegetatywnych na czerwono

SPOSÓB POSTĘPOWANIA:

• Preparat utrwalamy przez trzykrotne przesunięcie nad płomieniem palnika.

• Studzimy utrwalony preparat.

• Barwimy preparat roztworem zieleni malachitowej.

• Nie zlewając barwnika, od spodu podgrzewamy preparat płomieniem palnika do trzykrotnego ukazania się pary.

• Spłukujemy preparat wodą do chwili ustania wymywania barwnika.

• Barwimy preparat roztworem safraniny.

• Spłukujemy preparat wodą i osuszamy.

Glomeromycota - GRZYBY MIKORYZOWE

• obligatoryjne symbionty

• arbuskule w komórkach korzeni

• grzybnia niepodzielna ścianami poprzecznymi

• zarodniki (chlamydospory):

• duże grubościenne

• tworzą się wewnątrz lub na zewnątrz korzenia

• pojedyncze, w skupieniach lub owocnikach

• od setek do kilku tysięcy jąder

• brak rozmnażania płciowego

Chytridiomycota - SKOCZKOWCE

• ameboidalna, holokarpiczna, jednokomórkowa plecha bez rizoidów

• rozmnażanie płciowe: gametogamia

• zarodniki płciowe: diploidalne, przetrwalnikowe zygoty

• zarodniki bezpłciowe: zoospory

• zmiana fazy jądrowej: haploidalno-diploidalna

Zygomycota - SPRĘŻENIOWCE

• Grzybnia pozbawiona ścian poprzecznych, wielojądrowa

• Przegrody poprzeczne często w sporangioforach

• Rozmnażanie płciowe na drodze gametangiogamii

• Zarodniki płciowe - zygospory; bezpłciowe - sporangialne lub konidia; przetrwalnikowe - chlamydospory

• Zmiana faz jądrowych: haploidalno-diploidalna lub haploidalno-dikariotyczno-diploidalna

• Saprotrofy

• Rozkładają wiele podłoży organicznych

• Rosną i rozwijają się niezwykle szybko

• Powszechne w glebie

• Niektóre są kaprofilami

• Część znalazła zastosowanie w przemyśle fermentacyjnym

• Mogą być przyczyną dużych strat w przechowalnictwie płodów rolnych

Ascomycota - WORKOWCE

• grzybnia komórkowa ze ścianami poprzecznymi

• Rozmnażanie płciowe: gametangiogamia (rzadko somatogamia)

• Zarodniki płciowe: zarodniki workowe w workach

• Worki bezpośrednio w splotach grzybni lub w owocnikach (miseczka, otocznia zamknięta, otocznia otwarta, podkładka workowa)

• Owocniki u workowców:

• APOTHECIUM (MISECZKA) - wklęsłe wnętrze miseczki wyścielone jest hymenium

• CLEISTOTHECIUM (OTOCZNIA ZAMKNIĘTA) - kulistego kształtu, z workami zamkniętymi wewnątrz owocnika.

• PERITHECIUM (OTOCZNIA OTWARTA) - kształt kulisty z workami wewnątrz owocnika. Na jego powierzchni obecne są otwory, przez które wydostają się zarodniki

• PSEUDOTHECIUM (PODKŁADKA WORKOWA) -podobny do perithecium jednak zarodniki nie tworzą regularnej warstwy zarodnionośnej, i są pokryte podwójną ścianą.

• Zarodniki bezpłciowe: konidia

• Zmiana faz jądrowych: haploidalno-dikariotyczno-diploidalna

• Ok. 30% znanych gatunków grzybów patogenicznych i saprotroficznych

Basidiomycota - PODSTAWCZAKI

• grzybnia komórkowa ze ścianami poprzecznymi

• sprzążki (umożliwiają przemieszczanie się jąder potomnych przy podziale komórki)

• Rozmnażanie płciowe: somatogamia

• Zarodniki płciowe: zarodniki podstawkowe na podstawkach

• Podstawki w owocnikach

• Zarodniki bezpłciowe: oidia, konidia lub brak

• Zmiana faz jądrowych: haploidalno-dikariotyczno-diploidalna

• Długa dikariofaza

• Ważne patogeny roślin i huby

• Grzyby kapeluszowate, jadalne i niejadalne

• Tworzą mikoryzy z roślinami (drzewami)

GRZYBY MITOSPOROWE

• grzybnia komórkowa ze ścianami poprzecznymi

• brak rozmnażania płciowego

• zarodniki bezpłciowe: konidia; przetrwalnikowe: chlamydospory lub brak

• brak zmian faz jądrowych

• wszystkie stadia niedoskonałe grzybów i gatunki, u których nie jest znane stadium doskonałe

• patogeny roślin

• saprotrofy aktywnie rozkładające materię organiczna w glebie, wodzie, na roślinach

• doprowadzają do dużych strat

• wykorzystywane w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym

PLAZMOGAMIA - łączenie się plazmatycznej treści organów płciowych.

KARIOGAMIA - łączenie się jąder

OWOCNIKI - twory służące do rozrodu płciowego i wytwarzania zarodników, mające kształty kojarzące się z potocznym pojmowaniem wizerunku grzyba. Występują u podstawczaków i workowców.

ZARODNIKI - komórki lub zespoły komórek, które wyrastają w nowe osobniki po odłączeniu się od osobników macierzystych. Umożliwiają rozprzestrzenianie gatunku oraz przetrwanie niekorzystnych warunków.

SYMBIONTY OBLIGATORYJNE - grzyby tworzące mikoryzy arbuskularne z wieloma gatunkami roślin zielnych i drzew tropikalnych.

ANTHERIDIUM - haploidalny organ rozmnażania, w którym wytwarzane są plemniki.

SPRZĄŻKA - boczne uwypuklenie w miejscu występowania przegrody poprzecznej, umożliwiające przemieszczanie się jąder potomnych przy podziale komórki

PRZETRWALNIKI - formy spoczynkowe umożliwiające organizmom przetrwanie niekorzystnych dla nich warunków (Bacillus, Clostridium)

KOPROFAGI - organizmy odżywiające się odchodami innych organizmów

ZYGOSPORA - wielojądrowa struktura przetrwalnikowa wytwarzana u grzybów podczas gametangiogamii. Otoczona jest grubą ścianą komórkową.

ZOOSPORA - ruchliwe komórki rozrodcze (wegetatywne lub generatywne). Pływki zaopatrzone są w wici umożliwiające im poruszanie się w wodzie. Powstają w zarodniach zwanych zoosporangiami.

SPORANGIUM - organ rozmnażania bezpłciowego, wytwarzany głównie na sporoficie i tworzący zarodniki.

SUBSTANCJE ZESTALAJĄCE - służą do zestalania pożywki.

AGAR:

• wielocukier otrzymywany z krasnorostów

• pęcznieje w wodzie

• temp. upłynniania: ok. 100^oC

• temp. zestalania: ok. 40-42^oC

• dodaje się 1,5-2%

• niewykorzystywany przez bakterie

• nieliczne gatunki mogą go rozkładać

ŻELATYNA

• substancja białkowa otrzymywana w wyniku hydrolizy kolagenu

• pęcznieje w wodzie

• temp. upłynniania: ok. 30^oC

• temp. zestalania: ok. 20^oC

• dodaje się 12-15%

• zużywana przez drobnoustroje zawierające enzymy proteolityczne

• ogrzewana kilkakrotnie do 100^oC traci właściwości zestalające

ANTYBIOTYKI - ograniczają rozwój bakterii, w tym chorobotwórczych.

ROZCIEŃCZANIE KOLONII

Do rozcieńczenia zawiesiny glebowej możemy użyć piasku kwarcowego (1g:50g-1g:2000g; dla gleb leśnych 1g:149g). 1g gleby delikatnie rozdrabniamy w moździerzu. Mieszamy z odrobina piasku i rozkruszamy gruzełki, następnie dosypujemy do reszty piasku i przez 3 minuty toczymy. Mikroczerpakiem pobieramy 27mm³ próbki, kładziemy do pustej płytki Petriego, dodajemy płynną pożywkę i otrzymujemy kolonie. Następnie przenosimy kolonie na skos.

Micrococcus - bakterie kuliste, tlenowe, liczne gatunki są ciepłooporne. Są one niepożądane w mleczarstwie, powodują też psucie się kwaszonek warzywnych. Niektóre biorą udział w dojrzewaniu serów.

Cladosporium - powodują mikozy, alergeny (produkują wiele związków lotnych), rozkładają skrobię, białka, pektyny, celulozę i hemicelulozę.

Bacillus - laseczki tlenowe, przetrwalnikujące. Mają właściwości gnilne. Niektóre są chorobotwórcze.

Alternaria - zarodniki wielokomórkowe o kształcie maczugowatym, szorstkie ściany komórkowe. Rozkładają białka, skrobię, pektyny, hemicelulozę i celulozę.

Penicylium - grzyby toksynotwórcze, kancerogenne. Gatunek można zidentyfikować na podstawie kształtu rozgałęzienia. Szorstkie ściany komórkowe.

Aspergilius - kropidlak, nabrzmienie na konidioforze, 2 piętra zarodników, zarodniki okrągłe, szorstkie, grubościenne.