Igła w stogu siana
W 1961 r chmary ptaków – głównie
burzyków
szarych
zaatakowały
nadmorskie miasto Capitola w Kalifornii.
Zimą 1987 r ponad setka ludzi
rozchorowała się po zjedzeniu małży -
omułków
jadalnych
w restauracjach na wyspie Prince Edward
w Kanadzie.
Przypuszcza się, że oba te wydarzenia były
wywołane taką samą - wspólną przyczyną.
Igła w stogu siana
Igła w stogu siana
Bardzo szybko okazało się, że nie jest to zwykłe
zatrucie pokarmowe.
Wymioty, skurcze, biegunka, obezwładniający ból
głowy i następujące po nim zmieszanie połączone
z utratą pamięci, dezorientacja połączona z
napadami śpiączki były objawami poważnego
zatrucia. Niektórzy z zatrutych wykazywali
zmienność emocji przez niekontrolowany płacz
lub nadmierną agresywność. Troje starszych ludzi
zmarło.
Igła w stogu siana
Tragicznym objawem była utrata tzw.
pamięci krótkotrwałej u jednej czwartej
ofiar zatrucia (np. nie mogli zapamiętać
nic co się zdarzyło po zatruciu). Niektórzy
nie rozpoznawali otoczenia lub swoich
bliskich. Nie byli w stanie nauczyć się
czegokolwiek
nowego.
Najpoważniej
poszkodowani utracili pamięć do kilku lat
wstecz. Dla dwunastu ofiar utrata pamięci
krótkotrwałej była nieodwracalna.
Tajemnicze zdarzenie nazwano:
amnezyjnym zatruciem małżami.
Analiza toksykologiczna
Faza I
Faza II
utlenianie
redukcja
hydroliza sprzęganie
Trucizna ---------> Metabolit ------->
Metabolit
enzymy enzymy
Przemiany trucizn (toksyn) w
organizmie żywym
Analiza toksykologiczna
C OH
O
C N
O H
CH
2
C
O
OH
Kwas
benzoesowy
Kwas
hipurowy
Kwas benzoilo
glukuronowy
C OH
O
HO
C
O
O
O
C OH
O
C OH
O
C OH
O
O
O
C OH
O
O SO
3
H
Kwas
Koniugaty kwasu
hydroksybenzoesowy
hydroksybenzoesowego
Technika
Rodzaj analizowanej
próbki
Zakres
czułości
Chromatografia
gazowa: bardzo
wszechstronna i
szeroko stosowana
Ciało stałe, ciecz lub gaz
Lotne związki organiczne
lub nieorganiczne, gazy
trwałe
ppb lub ng/l
do g/l
Chromatografia
cieczowa: technika
analityczna do
rozdzielania
składników
nielotnych.
Lotne i nielotne ciecze
organiczne i nieorganiczne,
związki biologiczne,
polimery, związki chiralne,
termicznie nietrwałe
związki, małe jony
i makrocząsteczki.
ppb lub µg/l
do g/l
Elektroforeza
kapilarna: analiza
dużych
biocząsteczek
wymagających
próbki tylko w
nanolitrach.
Ciekłe związki polarne
i niepolarne, niektóre
pierwiastki, związki
organiczne jonowe
i niejonowe, nieorganiczne
kationy i aniony,
makrocząsteczki i związki
chiralne.
ppb lub µg/l
do g/l
Chromatografia gazowa
Oznaczanie poziomu temazepamu w krwi
przy pomocy chromatografii gazowej
Chromatografia gazowa
W celu oznaczenia metodą chromatografii gazowej
związków trudno lotnych najczęściej polarnych
należy je przeprowadzić w pochodne np. sililowe
przy pomocy różnych odczynników takich jak np.
TBDMSCl
tert-butylodimetylo-
chlorosilan
C
H
3
C
CH
3
Si
CH
3
CH
3
CH
3
Cl
N-metylo-N-(tert-butylodimetylosililo)
-trifluoro acetamid
C
H
3
C
CH
3
Si
CH
3
CH
3
CH
3
N
CH
3
C
O
CF
3
Metody
detekcji
Zasada
testu
radioimmu
no-
logicznego
Test
przesiewowy
Igła w stogu siana
Wstępne badania przesiewowe na znane
patogeny bakteryjne i wirusowe nie wykazały
zagrożenia.
Równie negatywny wynik dało badanie na
obecność
metali
ciężkich,
pestycydów
i
polichlorowanych bifenyli.
Próbki małży stanowiły niesłychanie złożony
materiał badawczy zawierały tysiące różnych
związków chemicznych. Powstało pytanie jak
można wyizolować jeden składnik z tak złożonej
mieszaniny nic nie wiedząc na temat jego
fizycznych
czy
chemicznych
właściwości.
Przypomina to poszukiwanie „igły w stogu
siana”.
Igła w stogu siana
Jak wykonać takie poszukiwanie?
Czy istnieje szansa na znalezienie odpowiedzi?
Do rozwiązania problemu powołano zespół
w skład którego wchodzili wszyscy chemicy
i biolodzy morza zatrudnieni w Atlantic
Research Laboratory (ARL) of National
Research Council in Halifax Nova Scotia oraz
kilku
naukowców
z Department of Fisheries and Oceans (DFO),
jak również personel obeznany z techniką
testów biologicznych na myszach.
Problem rozwiązano po 102 godzinach od
rozpoczęcia wspólnej pracy stosując taktykę
przedstawioną na następnym przeźroczu.
Igła w stogu siana
By uniknąć dużych statystycznych fluktuacji
związanych z niehomogennością, wszystkie
eksperymenty prowadzono na dużych porcjach
homogenizatów zarówno toksycznych jak
i kontrolnych małży. Kontrola dawki w teście
biologicznym ma ogromne znaczenie w
efektywnym śledzeniu i ustaleniu toksyczności.
Doświadczalną krzywą przedstawia następne
przeźrocze, z którego wynika, że dla
efektywnego śledzenia toksyczności wystarcza
około 0,6 g tkanek małży.
Igła w stogu siana
Krzywa zależności czasu śmierci myszy od
wielkości dawki wagowej tkanek małży.
Igła w stogu siana
Dla potrzeb analizy
wykorzystano
wprawdzie brutalny
ale bardzo pewny
test
biologiczny.
Próbki
izolowanej
substancji
wstrzykiwano
myszom.
Igła w stogu siana
Wstrzyknięcie (iniekcja) myszy małej
ilości próbki, w przypadku obecności
toksyny wywoływało bardzo wyraźną
neurologiczną
odpowiedź:
mysz
mimowolnie drapała swoje barki
tylnymi
nogami,
drżała
a w końcu padała wskutek uduszenia.
Igła w stogu siana
Zastosowano standardowe metody fizyczne
do
rozdziału
złożonej
mieszaniny
stanowiącej próbkę toksycznych małży.
Jednocześnie
te
same
procedury
zastosowano do nietoksycznej próbki
małży, pozwoliło to porównywać identyczne
frakcje obu analizowanych ciągów próbek.
Jakakolwiek różnica w widmach lub
chromatogramach między toksyczną a
kontrolną próbką mogła stanowić klucz do
znalezienia toksycznego czynnika.
Igła w stogu siana
Większość narkotyków i trucizn jest rozpuszczalnych
w tłuszczach lub w wodzie stąd logicznym było by
pierwszym
krokiem
izolacji
była
ekstrakcja
rozpuszczalnikiem. By uniknąć możliwego rozkładu
przez temperaturę bądź agresywny rozpuszczalnik,
rozdrobnione małże ekstrahowano w temperaturze
pokojowej
wodnym
roztworem
metanolu.
Wprawdzie ekstrakcja była niepełna ale zakończyła
się sukcesem, test biologiczny na myszach dawał dla
ekstraktu metanolowego identyczny rezultat jak dla
wyjściowej próbki małży. Ekstrakt zatężono przez
odparowanie. Pary okazały się nietoksyczne,
pozostałość ekstrahowano mieszaniną woda -
chlorek metylenu
Igła w stogu
siana
Procedury ekstrakcji
i frakcjonowania użyte
w badaniach toksycznych
małży.
HPLC – wysokosprawna
chromatografia cieczowa
HVPE – wysokonapięciowa
elektroforeza bibułowa
Igła w stogu siana
Kolumna XAD-2 - kolumna z syntetyczną żywicą
polistyrenową typu „Amberlit” lecz bez grup
jonowych, działa wyłącznie na zasadzie adsorpcji.
Zmieniając równowagę hydrofobowo/hydrofilową
zaadsorbowanych cząsteczek dokonujemy ich
rozdziału. Np. wolne kwasy tłuszczowe silniej się
adsorbują niż ich sole sodowe zatem będą
eluowane z kolumny przez roztwór wodorotlenku
sodowego.
Igła w stogu
siana
Ogólna zasada strategii
opartej na próbach
biologicznych.
Pełne kółka oznaczają
dodatni wynik testu
biologicznego.
Igła w stogu siana
Ekstrakt w chlorku metylenu z toksycznych małży
zawierał szereg barwnych substancji nieobecnych
w próbce kontrolnej. Widmo absorpcyjne światła
widzialnego wykazywało kształt charakterystyczny
dla
widma
absorpcyjnego
pigmentów
fitoplanktonu. Dodatkowe badanie toksycznych
małży ujawniło, że ich układy trawienne są
wypełnione zielonym planktonem, podczas gdy w
próbce kontrolnej nie. Jednakże same pigmenty
okazały się nie toksyczne. Frakcja chlorku
metylenu dawała negatywny wynik w teście
biologicznym. Warstwa wodna zawierała toksynę
wskazując, że jest to polarna jonizująca się
substancja.
Igła w stogu siana
Otrzymany wynik pozwolił na odrzucenie bardzo
złożonej
mieszaniny
zawartej
w
chlorku
metylenu pozostawiając do badań znacznie
prostszy roztwór wodny.
Do rozdzielenia próbki na prostsze frakcje użyto
chromatografii kolumnowej. Rozdział wykonano
na kolumnie wypełnionej żywicą XAD-2, która
wychwytuje niepolarne związki pozwalając
przepływać jonom. Z wielu otrzymanych frakcji
tylko jedna była toksyczna. Dla dodatkowego
oczyszczenia toksyczną frakcję rozdzielono na
HPLC z odwróconą fazą. Otrzymano pojedynczą
dobrze oczyszczoną frakcję, która wykazywała
toksyczność identyczną z oryginalną próbka
małży.
Igła w stogu siana
By upewnić się, że wyizolowana przez HPLC frakcja
jest rzeczywiście wyizolowaną toksyną Ponownie
rozdzielono wodną frakcję z kolumny XAD-2 stosując
zupełnie inną technikę rozdziału. Tym razem użyto
wysoko napięciowej elektroforezy bibułowej (HVPE).
W toksycznej frakcji zaobserwowano pasmo bardzo
blisko pasma kwasu glutaminowego, jednocześnie
w próbce kontrolnej brak było tego pasma.
Substancja wydzielona z pasma podana na HPLC
miała identyczny czas retencji jak substancja
toksyczna
wyizolowana
pierwotnie.
Jak
też
wykazywała taką samą toksyczność.
Igła w stogu siana
Profil
HPLC-DAD
odpowiednic
h frakcji
z kolumny
XAD-2
z
toksycznych
i kontrolnej
próbki małży
Igła w stogu siana
Analizy profilowe tak HPLC jak i HVPE dały
znaczące wyniki. Uderzającym przykładem
był
profil
analityczny
HPLC-DAD
porównujący
frakcje
toksycznego
i
porównawczego
ekstraktu
małży
przedstawiony na poprzednim przeźroczu.
Pełne trójwymiarowe dane z HPLC-DAD
pokazują pik z maksimum absorpcji przy
242 nm (sugerujący sprzężony układ wiązań
typu
C=C-C=C).
Igła w stogu siana
Fragment MS/MS widma jonu m/z 312 w widmie
masowym dodatnich jonów FAB toksycznej frakcji z
kolumny XAD-2.
Igła w stogu siana
Widmo FT-IR cienkiego filmu wyizolowanej toksyny
na okienku CaF
2
.
Igła w stogu siana
300 MHz
Protonowe
widmo
NMR
oczyszczon
ej toksyny
rozpuszczo
nej w D
2
O
Igła w stogu siana
OH
O
H
3
C
H
OH
O
CH
3
N
H
HO
O
H
H
Glutamic acid in acidic
solution
Domoic acid in acidic solution
OH
HO
O
H
2
N
O
OH
O
H
3
C
H
OH
O
CH
3
N
H
HO
O
Glutamic acid in acidic
solution
Domoic acid in acidic solution
OH
HO
O
H
2
N
O
Igła w stogu siana
J. L. C. Wright, at al.. Can. J. Chem., 67, 481-
90, (1989)
M. A. Quillian, J. L. C. Wright, Anal. Chem.,
61, 1053A-1059A, (1989)
http://antoine.fsu.umd.edu/chem/senese/101/f
eatures.shtml (przeglądana: 2003. 11. 23.)
http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/101
/features/domoic.shtml (przeglądana 2004.
04. 05)