Biotechniki rozrodu
Hodowla zarodków in vitro, ocena
morfologiczna zarodków
Oznaczanie płci zarodków metodą PCR
Zaliczenie przedmiotu
Biotechniki rozrodu
Hodowla zarodków in vitro, ocena
morfologiczna zarodków
Oznaczanie płci zarodków metodą PCR
Zaliczenie przedmiotu
Hodowla zarodków in vitro,
ocena morfologiczna zarodków
Hodowla zarodków in vitro
Podłoża do hodowli:
SOF,
Komercyjne: G1, G2 (Medicult), Cook
Warunki hodowli:
wilgotność powietrza: 62-70%
Temperatura -38,5 C
1 zarodek /1 ul pożywki
www.gibco.co
www.gibco.co
m
m
Czynniki determinujące
Czynniki determinujące
efektywność IVM/IVF/IVC
efektywność IVM/IVF/IVC
www.sigmaaldrich.c
om
pożywki:
pożywki:
-
skład
skład
(aminokwasy)
(aminokwasy)
-
ekwilibracja,
ekwilibracja,
stałe pH i
stałe pH i
temperatura
temperatura
w kropli
w kropli
mieszanina gazów do
mieszanina gazów do
IVM/IVF/IVC – stały
IVM/IVF/IVC – stały
skład
skład
w inkubatorze
w inkubatorze
płytki
płytki
hodowlane,
hodowlane,
filtry, igły,
filtry, igły,
falkony, tipsy
falkony, tipsy
www.cryobioststem-
imv.com
olej mineralny
olej mineralny
objętości kropli
objętości kropli
hodowlanych,
hodowlanych,
sposób ich
sposób ich
wykonania
wykonania
jakość plemników - efektywność
jakość plemników - efektywność
zapłodnienia, koncentracja,
zapłodnienia, koncentracja,
przygotowanie
przygotowanie
czystość
czystość
powietrza
powietrza
w
w
laboratorium
laboratorium
jakość oocytów
jakość oocytów
częstotliwość wymiany
częstotliwość wymiany
½ kropli hodowlanej
½ kropli hodowlanej
Jakość zarodków - definicja
• Zdolność (potencjał) zarodka do rozwoju
w prawidłowy, żywy organizm – znaczenie
absolutne
• Potencjał zarodka do rozwoju do bardziej
zaawansowanych stadiów rozwoju
(blastocysta – in vitro) oraz zdolność do
implantacji w macicy i dalszego rozwoju
(samodzielny organizm - in vivo)
Podstawowe parametry oceny
zarodków
Stadium rozwoju odpowiadające wiekowi zarodka
(liczba dni od inseminacji)
Liczba przedjądrzy w zygocie (człowiek)
Liczba blastomerów, kolor i proporcje ich wielkości
Stopień degeneracji blastomerów
Stopień kompakcji w stadium moruli
Liczba blastomerów w blastocyscie, prawidłowość
procesu kawitacji
zygota
3PN
morula
(luźne
blastomer
y)
niedojrzały dojrzały
2-bl
3-4-bl
8-16-bl
morula blastocysta
oocyt (-24h) oocyt (0h) 32-36hpi 40-48hpi
56-110hpi
116-
128hpi 140-168hpi
Chronologia rozwoju
przedimplantacyjnego zarodków
bydła (0-7 dzień pi) pi= po
inseminacji
System oceny wczesnych zarodków
człowieka
A - C liczba i wzajemne proporcje wielkości blastomerów
1- 4 stopień fragmentacji blastomerów Bączkowski i wsp. 2004 Reprod
Biol
równe
blastomery
nierówne
blastomery
degeneracja
cytoplazmy
brak
fragmentacji
fragmentacja
<30%
fragmentacja 30-
50%
fragmentacja
>30%
Klasa A1
Klasa C3
Ocena morfologiczna -
przykłady
Zarodki wczesne do stadium 8bl
C
50m
E
50m
Stadium 2 kom.
Stadium 4 kom.
Stadium 8 kom.
Zarodki hybrydowe bydło domowe x żubr, 3 dzień po inseminacji
(pi)
A) stadium 3-4-blastomerowe
B) stadium 5-6-blastomerowe (
widoczna wakuolizacja
cytoplazmy
)
100µm
A
B
Zarodki hybrydowe bydło x żubr, 5 dzień pi
ok. 15-20 blastomerów, komórki luźno ułożone, brak kompakcji,
blastomer wcześniej zahamowany w rozwoju
100µm
Stadium moruli (5 dzień
pi)
przed kompakcją
w czasie kompakcji
Stadium moruli – zarodki o
obniżonej jakości
niewiele blastomerów
(<16) brak kompakcji
Prawidłowa kompakcja,
luźne blastomery w
przestrzeni okołożółtkowej
Stadium późnej moruli / wczesnej
blastocysty (
początek formowania jamy –
blastocel)
System oceny
morfologii
blastocyst
człowieka
1 wczesna
blastocysta
(jama mniejsza
niż ½ zarodka
2
blastocysta
(jama
większa niż
½ zarodka
3
blastocysta
(jama
wypełnia
zarodek)
4
ekspandujaca
blastocysta
(duży zarodek,
cienka zona)
ICM (węzeł
zarodkowy)
TE
(trofoblast)
A
liczne i
ściśle
upakowane
komórki
B
mniej
komórek luźno
upakowanych
C
niewiele
komórek
A
liczne
komórki w
formie
nabłonka
B
mniej
komórek w
formie luźnego
nabłonka
C
nieliczne luźne
komórki
Stadium wczesnej blastocysty
Stadium ekspandującej
blastocysty (dzień 8 pi)
Stadium wylęgającej się
blastocysty
Stadium wylęgłej blastocysty
Ocena morfologiczna –
przykłady
Zarodki nieprawidłowe
obkurczona blastocysta
wewnątrz zp - zaburzenie
wylęgania się
morula – pełna
degeneracja luźnych
blastomerów
Zdegenerowane oocyty
Jakość zarodków – liczba
blastomerów w
ICM
i
TE
(barwienie
różnicujące – DS)
Komórki
węzła
zarodkoweg
o – ang. ICM
Komórki
trofoblastu
– ang. TE
Jakość zarodków – występowanie
apoptotycznych blastomerów
(technika Tunel)
Sygnał
apoptotyczn
y –śmierć
komórki
Wybarwione
jądro
komórkowe
blastomeru
Oznaczanie płci zarodków
metodą PCR
PCR – jedna z technik
molekularnego oznaczania płci
zarodków
Do przeprowadzenia
PCR wymagane
są:
DNA badanego
zarodka
Wolne nukleotydy
Enzym polimeraza
termostabilna Taq
Odpowiedni bufor z
jonami magnezu
Startery dla
badanego
fragmentu DNA
Izolacja DNA z zarodków
Inkubacja komórek zarodka z proteinazą
K
w 37C przez 30 min
zarodek (1 komórka)
Bufor do PCR
Proteinaza K
dNTP
H
2
O
Inaktywacja proteinazy K – 5 min w 95C
Mieszanina reakcyjna PCR
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
do PCR
Lizat – 5ul
dNTP – 0,5 ul (2mM/ul)
Primer F – 1,5 ul (5uM/ul)
Primer R – 1,5 ul (5uM/ul)
Bufor dla polimerazy – 2,5 ul (10x/ul)
Polimeraza – 0,4ul (5U/ul)
H2O – do 25 ul
Polimorfizm genu
amelogeniny
U człowieka i bydła wykryto gen amelogeniny (AMGL),
który ma swoje locus na obu chromosomach płci X i Y
Na chromosomie Y stwierdzono delecję w sekwencji
tego genu – efektem tego jest polimorfizm
U samca gen AMGL występuje na chromosomach X i Y
w dwóch różnych formach, u samicy obecna jest tylko
sekwencja charakterystyczna dla chromosomu X
Warunki amplifikacji DNA dla
starterów AMGL – temperatura
przyłączenia
Sekwencja AMGL:
5’ CAG CCA AAC CTC CCT CTG C
3’ CCC GCT TGG TCT TGT CTG TTG C
Wzór na ustalenie teoretycznej temperatury
przyłączania starterów
:
Tp = 4(G + C) + 2(A + T)
Polimorfizm genu
amelogeniny
Osobniki referencyjne
Osobniki referencyjne
samica
samica
samiec
samiec
Produkt PCR z ½ blastocysty
Produkt PCR z ½ blastocysty
Program reakcji PCR dla
AMGL
Denaturacja wstępna DNA – 97ºC 1 min
Denaturacja DNA – 97ºC 3 min
Przyłączanie starterów – 1 min
Elongacja nici DNA - 72 ºC 1 min
Elongacja końcowa - 72 ºC 10 min
Liczba
cykli 40
PCR multipleks
PCR z wykorzystaniem dwóch par starterów:
dla sekwencji na chromosomie Y
dla dowolnej sekwencji autosomalnej
(marker obecności DNA w probówce)
Dziękuję za uwagę…
