plik

Biotechnologia rozrodu wykład

Biotechnologia rozrodu – pojęcie, określające szereg nienaturalnych metod rozrodu ssaków
opracowanych z wykorzystaniem osiągnięć naukowych z zakresu fizjologii, embriologii i
kriobiologii gamet i zarodków oraz endokrynologii i innych dziedzin nauki

Techniki biotechnologiczne stosowane w rozrodzie zwierząt:
*techniki sterowania rozrodem
*techniki zwiększania wydajności rozrodczej samic
*techniki zwiększania wydajności rozrodczej samców
*kriokonserwacja komórek płciowych i zarodków
*manipulacje na oocytach i zarodkach
*techniki diagnostyczne w biotechnologii rozrodu

Techniki sterowania rozrodem:
*sterowanie cyklem płciowym:
-wywoływanie rui poza sezonem rozpłodowym
-synchronizacja rui
*determinacja płci zarodków
*indukcja porodu
*indukcja laktacji

Techniki zwiększania wydajności rozrodczej samic:
*zwiększenie stopnia owulacji
*wywoływanie superowulacji
*przenoszenie zarodków ET (Embryo Transfer)
*izolacja oocytów OPU (Orum pick-up)
*hodowla oocytów IVM (In Vitro Maturation)
*zapłodnienie pozaustrojowe IVF (In Vitro Fertilization)
*hodowla zarodków IVCl (In Vitro Culture)

ET:
*transfer genów

U samców:
*sztuczne unasienianie
*inseminacja domaciczna
*rozcieńczenie i konserwacja nasienia
*zapłodnienie pozaustrojowe (IVF)
*mikroiniekcja plemników

Kriokonserwacja komórek płciowych i zarodków:
*kriokonserwacja nasienia samców
*nitryfikacja zarodków i oocytów

Manipulacje na oocytach i zarodkach:
*ocena i dezynfekcja oocytów i zarodków In vitro
*dzielenie zarodków
*izolowanie blastomerów
*enukleacja oocytów i zarodków
*wytwarzanie chiner
*klonowanie
*indukcja obcych genów
Chinera – twór dwugatunkowy

Techniki diagnostyczne w biotechnologii rozrodu:
*oznaczenie liczby owulacji

*testy hormonalne
*wczesna diagnoza ciąży
*laparoskopia – pozwala ocenić stan narządów wewnętrznych
*techniki USG
*seksowanie zarodków – czy zarodek jest płci żeńskiej czy męskiej

Wywoływanie rui stadium an estrus:

Zastosowanie:
*wywoływanie rui poza sezonem rozpłodowym u samic zwierząt diestralnych i
monoestralnych (duże znaczenie przy imporcie zarodków na inną półkulę)
*wywoływanie rui u samic zwierząt poliestralnych będących w stadium an estrus (karmiące
lochy, krowy ras mięsnych długo karmiące cielęta)

Metody wywoływania rui w stadium anestrus:
*stosowanie melatoniny (u owiec)
*ograniczanie czasu ssania przez cielęta
*stosowanie PMSG (u bydła)
*stosowanie progesteronów przez 9-12 dni (u bydła)
*stosowanie GnRH lub jego analogów (u klaczy)

GnRH – neurohormon polipeptydowych stymulujący uwalnianie hormonów
gonadotropowych (LH i FSH)

Synchronizacja rui – jest techniką rozrodu umożliwiającą wywoływanie rui i owulacji w
zaplanowanym terminie

Główne korzyści:
*ułatwia tworzenie grup technologicznych
*umozliwia planowe zapłodnienie samic
*stanowi skuteczna alternatywę tradycyjnych metod wykrywania rui (waże w przypadku tzw.
„cichych rui” oraz w sezonach obniżonej aktywności płciowej)
*jest niezbędna do przeprowadzania transplantacji zarodków

Czynniki decydujące o jakości metody synchronizacji rui:
*poziom reakcji zwierząt na działanie metody
*możliwość zastosowania w każdej fazie cyklu płciowego
*owulacja powinna wystąpić w typowej dla gatunku fazie rui
*synchronizowane samice winny wykazywać normalną płodność
*po synchronizacji następne ruje winny mieć normalny przebieg

Metody synchronizacji rui:
a)stymulacja funkcji ciałka żółtego
b)luteoliza ciałka żółtego

Stymulacja funkcji ciałka żółtego > podawanie progesteronów
Progestageny – związki chemiczne o działaniu zbliżonym do progesteronu:
*CAP (octan chlormanidonu)
*MAP (medroksyprogesteron)
*MGA (octan melangestrolu)
*PRID (progesterone-releasing intravagise type B)
*Norgestomet

Zasada działania:
Podawanie progesteronów przedłuża lutealną fazę cyklu płciowego uniemożliwiając
wystąpienie rui. Blokują one wydzielanie LH i hamują dojrzewanie pęcherzyków
jajnikowych. Zaprzestanie podawania progesteronów wywołuje ruję w zaplanowanym
terminie.

Sposób stosowania (podawanie progesteronów w postaci):
*

…?

Luteoliza ciałka żółtego:
Zasada działania:
Sztucznie wywołana luteoliza (proces degeneracji) ciałka żółtego przerywa lutealną fazę
cyklu płciowego. W następstwie spada poziom progesteronu, wzrastają pęcherzyki jajnikowe,
następuje ruja i owulacja.

Metody wywoływania luteoliny ciałka żółtego:
1.podawanie prostaglandyn (największe zastosowanie):
*stosowana u bydła, koni i owiec – u świń nieskuteczna
*polega na podaniu prostaglandyny F2alfa (w formie iniekcji)
*skuteczna jest tylko w lutealnej fazie cyklu płciowego (u bydła największa reakcja między 5
a 15 dniem cyklu) dlatego stado trzeba poddać działaniu prostaglandyny dwukrotnie (co 10-
12 dni)
*ruja u krów występuje po 48-72 godz. (inseminuje się po 72-96 godz.)
2.enuleakcja (usunięcie) ciałka żółtego
3.podawanie oksytocyny, estragocyny, estrogenów albo przeciwciał LH

Zwiększanie stopnia owulacji.

Ma na celu uzyskanie zwiększenia liczby owulacji do poziomu nie przekraczającego
naturalnych możliwości rozrodczych samic danego gatunku.

Zastosowanie:
*podnoszenie plenności stad (głównie owiec i świń)

Metody:
a)stosowanie umiarkowanych dawek hormonów gonadotropowych
c)immunizacja przeciw sterydom jajnikowym
d)flushing

Stosowanie umiarkowanych dawek hormonów gonadotropowych (głównie PMSG):

PMSG- gonadotropina źrebnych klaczy. Hormon gonadotropowy o działaniu zbliżonym do
gon atropin przysadkowych FSH i LH, wytwarzany jest w błonie śluzowej macicy ciężarnych
klaczy
Najlepsze efekty uzyskuje się stosując PMSG łącznie z podawaniem progestagenów
(synchronizacja rui).

Sposób podawania:
*w formie iniekcji na około 12 godz. przed usunięciem gąbek dopochwowych z
progestagenami

Wady metody:
*reakcje samic na podawane hormony nie są jednakowe
*wielokrotne podawanie PMSG powoduje immunizację samic, co prowadzi do zmniejszenia
plenności

b)stosowanie melatoniny:
melatonina- hormon wytwarzany przy szyszynkę z zachowaniem dobowego rytmu syntezy
(wydzielany przy braku światła). Ma on zastosowanie dla utrzymania dobowej rytmiczności
wielu procesów fizjologicznych, reguluje fotoperiodyczny mechanizm sezonowości rozrodu u
owiec.

Sposób podawania:
*w formie implantów podskórnych
*szklane lub silikonowe wkłady

Preparaty:
*Requlin

c)immunizacja przeciw sterydom jajnikowym:

Preparaty:
*Fecundin

d)flushing:

Naturalna metoda zwiększania stopnia owulacji polegająca na zastosowaniu bodźcowego
żywienia w okresie poprzedzającym ruję i podczas rui. Zwiększa się wtedy intensywność
żywienia samic, stosując dawki pokarmowe o podniesionej koncentracji energii.

Zastosowanie:
Metoda powszechnie stosowana u loch odsadzonych od prosiąt i maciorek owiec w okresie
stanówki.

Transplantacja zarodków:
Technika umożliwiająca rozwój zarodków pochodzących od jednej samicy (dawczyni) w
łonie innej samicy (biorczymi). Pozwala ona uzyskać ponad-naturalna liczbę potomstwa od
jednej samicy o bardzo zbliżonych genotypach.

Historia rozwoju metody:
*1890- Walter Heap (Anglia) dokonał pierwszego zabiegu przeniesienia zarodków (na
królikach)
*1932- pierwsze transplantacje zarodków kozy
*1951- pierwsza udana transplantologia u bydła
*1974- wykorzystanie transplantologii w imporcie materiału hodowlanego bydła mięsnego
*1976- wdrożenie metody bezkrwawego pozyskiwania zarodków bydła

Zastosowanie:
*pozyskiwanie dużej liczby pełnego rodzeństwa lub półrodzeństwa (materiał do testowania
wartości hodowlanej rozpłodników, nowych pasz, leków itp.)
*zwielokrotnienie potomstwa wybitnej matki lub udanego kojarzenia (od jednej krowy
dawczyni można pozyskać ponad 100 cieląt rocznie)
*import materiału hodowlanego (zamiast zwierząt zarodki, mniejsze koszty i ryzyko,
niepotrzebna kwarantanna)
*uruchamianie rezerw genetycznych
*wykorzystanie w programach hodowlanych (programy MOET- zastosowanie pozwala
zwiększyć dokładność szacowania wartości hodowlanej i ostrość selekcji oraz zmniejszyć
odstęp między pokoleniami, a przez to znacznie zwiększyć postęp hodowlany)

Czynniki ograniczające stosowanie transplantacji zarodków:
*relatywnie wysoki koszt
*niedostateczna skuteczność stosowanych technologii
*ryzyko wystąpienia skutków ubocznych

Elementy procesu transplantacji zarodków:
1.wybór dawczyń i biorczyń
2.wywoływanie superowulacji (u dawczyń)
3.inseminacja (dawczyń)
4.pozyskiwanie zarodków
5.manipulacja i konserwacja zarodków

6.synchronizacja biorczyń
7.transplantacja zarodków zsynchronizowanym biorczyniom

Ad.1. Wybór dawczyń i biorczyń:

Kryteria wyboru dawczyń:
*cel transplantacji (eksport zarodków, program MOET, czy pozyskiwanie bliźniąt do testów)
*wartość hodowlana (na dawczynie wybiera się osobniki wybrane)
*stan zdrowia (dobre zdrowie ogólne, prawidłowość procesów rozrodczych)

Ad.2. Wywoływanie superowulacji (u dawczyń):

Superowulacji- owulacja dużej liczby pęcherzyków jajnikowych w czasie jednej rui.
Wywołując superowulacji uzyskuje się zdolne do zapłodnienia komórki jajowe w ilościach
zwykle przekraczających fizjologiczne możliwości rozrodcze samic danego gatunku

Czynniki wywołujące superowulacji:

*

Podawanie w formie:
*iniekcji
*implantów podskórnych
*gąbek dopochwowych następujących hormonów:
-FSH- hormon wzrostu i dojrzewania pęcherzyków jajnikowych (gonadotropina
przysadkowa)
-GnRH- hormon stymulujący uwalnianie gonadotropin przysadkowych (FSH i LH)
-HCG- gonadotropina z moczu ciężarnych kobiet
-PMSG- gonadotropina z surowicy źrebnej klaczy
-progestageny (Synchron-Mate B, CIDR, PRID)- preparaty progestagenowe stosuje się
zwykle wtedy gdy dawczyni nie wykazuje normalnego cyklu płciowego
-somatotropina (hormon wzrostu)- podawana łącznie z FSH może dwukrotnie zwiększyć
liczbę owulacji

Czynnikiem decydującym o odpowiedzi superowulacji jest stan jajnika dawczyni w
momencie podawania hormonów. Hormony wywołujące superowulację podaje się w połowie
lutealnej fazy cyklu płciowego – u bydła między 9 a 13 dniem cyklu.

Przykład wywoływania superowulacji u krów:

Dzień

Metoda I

Metoda II

Metoda III

Pora dnia

0 ruja

2500 j.m.

5 mg FSH-P

rano

PMSG

5 mg FSH-P

wieczorem

4 mg FSH-P

5 mg FSH-P

rano

4 mg FSH-P

5 mg FSH-P

wieczorem

PGF2alfa

3 mg FSH-P

5 mg FSH-P

rano

PGF2alfa

rano

3 mg FSH-P

5 mg FSH-P

wieczorem

2 mg FSH-P

5 mg FSH-P

rano

2 mg FSH-P

5 mg FSH-P

wieczorem

14 ruja

unasienienie unasienienie

unasienienie

Skutki uboczne superowulacji:
*zmiany profilu hormonalnego, wywołujące niekorzystne zmiany środowiska jajowodów i
macicy (zmniejszenie skuteczności zapłodnień i przeżywalności zarodków)
*zaburzenia w rozwoju pęcherzyków jajnikowych (wytwarzanie oocytów niezdolnych do
zapłodnienia)

Ad.3. Inseminacja:

Uzyskanie w wyniku superowulacji komórki jajowe winny być zapłodnione, zwykle poprzez
inseminację. W tym przypadku inseminacja musi spełniać następujące warunki:
*gwarancja zapłodnienia dużej liczby komórek jajowych:
-nasienie o sprawdzonej zdolności zapładniającej
-zwiększona liczba plemników w dawce inseminacyjnej
-podwójny zabieg inseminacyjny (reiseminacja)
*wysoka wartość hodowlana dawcy nasienia

Ad.4. Pozyskiwanie zarodków:

Metody:
1.niechirurgiczna
2.chirurgiczna
3.poubojowa

1.m. niechirurgiczna:
Opis:
Do wybranego rogu macicy wprowadza się cewnik poprzez pochwę i szyjkę macicy. Po
osiągnięciu ok. połowy długości rogu macicy do balonika kateru wstrzykuje się płyn lub
powietrze, uszczelniając światło rogu macicy. Do wnętrza rogu macicy wprowadzany jest
specjalny płyn (medium), który następnie zbierany jest z powrotem z wypłukanymi
zarodkami.

Płyn do płukania zarodków (medium):
Jest mieszaniną soli i elektrolitów z dodatkiem glukozy, antybiotyków, środków
przeciwgrzybicznych. Zapewnia on równowagę osmotyczną i tworzy środowisko bezpiecznej
egzystencji zarodków.

Zalety:
*nie powoduje trwałych uszkodzeń narządów rozrodczych
*możliwość wielokrotnego pobierania zarodków od tej samej dawczyni

Ograniczenia:
*pozyskiwanie zarodków możliwe jest tylko z macicy i samic, których szyjka macicy
umożliwia wprowadzenie kateteru
*wymaga dobrego przygotowania teoretycznego i praktycznego oraz dużej sprawności
manualnej

2.m.chirurgiczna:
Opis:
Polega na chirurgicznym otwarciu jamy ciała i bezpośrednim płukaniu jajowodu lub rogu
macicy specjalnym płynem. Płyn wprowadzany jest do górnego odcinka jajowodu (lub rogu
macicy), a odzyskiwany za pośrednictwem kaniszki umieszczonej w rogu macicy. Wraz z
płynem pozyskuje się zarodki.

Zalety:
*możliwość pozyskiwania zarodków bezpośrednio z jajowodu (w początkowym stadium
rozwoju)
*skuteczna u wielu gatunków zwierząt

Ograniczenia:
*konieczność wykonania zabiegu chirurgicznego (ryzyko operacyjne)
*ograniczona liczba pobrań zarodków od jednej samicy (3 pobrania- tworzą się zrosty
pooperacyjne)
*wymaga specjalistycznego zaplecza chirurgicznego oraz wykonania znieczulenia dawczyni

3.m.poubojowa:
*stosowana w przypadku cennych zwierząt wybrakowanych oraz w badaniach naukowych
*skuteczność metody zależy od upływu czasu między ubojem a płukaniem zarodków
(najlepiej do 15 min)

Regulacja hormonalna cyklu rujowego u klaczy.

Cykl płciowy:
*dojrzałość płciową klacze uzyskują między 12 a 24 m-cem życia (średnio w wieku 1.5 roku)
*cykl płciowy trwa zwykle 19-20 dni. Jest to okres od pierwszego dnia rui do ostatniego dnia
przed następną rują. Jest to czas upływający między jedną owulacją a drugą. U klaczy w tym
okresie zachodzą zmiany w zachowaniu jak i wewnętrznych i zewnętrznych częściach
narządów płciowych. Cykle powtarzają się

…?

wielokrotnie

*konie są zwierzętami poliestralnymi

Hormonalne sterowanie aktywnością płciową:

Czynnikiem pobudzającym coroczny rozwój funkcji płciowych u klaczy jest wydłużający się
dzień. Określona ilość światła działa na receptory światła w oku. Impulsy docierają do
szyszynki a stamtąd do podwzgórza, gdzie uruchamiana jest produkcja GnRH.

GnRH- hormon ten kontroluje wydzielanie gonadotropin przysadkowych. Jest u klaczy
uwalniany w sposób pulsacyjny, jako krótkie „serie” i wnika do naczyń krwionośnych przez
splot naczyń włosowatych w wyniosłości przyśrodkowej mózgowia. Następnie jest
transportowane żyłami wrotnymi długimi do gruczołowej części przysadki, gdzie stymuluje
uwalnianie hormonów FSH i LH.

Hormony przysadki LH, FSH i prolaktyna:
FSH- jest hormonem pobudzającym rozwój pęcherzyków jajnikowych
LH- jest hormonem, któremu się przypisuje działanie prowadzące do dojrzewania, a następnie
pękania pęcherzyków

Po owulacji rozpoczyna się druga część gry hormonalnej, której przebieg

…?

Hormon luteinizujący u klaczy jest odpowiedzialny za owulację i uwalnianie dojrzałego
oocytu, a także utworzenie w miejscu pękniętego pęcherzyka ciałka żółtego. Współpracuje
również z FSH, aż do osiągnięcia ostatecznej dojrzałości pęcherzyka do owulacji. Falowe
wydzielenie LH rozpoczyna się po obniżeniu poziomu progesteronu. Jego najniższy poziom
występuje u klaczy od 6 do 15 dnia cyklu. Stężenie LH zaczyna wzrastać na początku rui, tj.
w 17 dniu.

LH:
Szczyt stężenia LH występuje 2 dni po owulacji, a następnie stopniowo maleje. Jego okres
półtrwania jest b. krótki. Podstawowe stężenie osiąga o 5-6 dni po owulacji. Czas uwalniania
LH u klaczy i związana z tym fala owulacyjna są znacznie dłuższe niż u większości zwierząt.

FSH:
Podczas sezonu rozrodczego szczyt stężenia FSH występuje dwukrotnie w odstępach 10-12
dniowych. Pierwszy szczyt FSH pojawia się pod koniec rui. Rozpoczyna rozwój małych
pęcherzyków jajnikowych o średnicy 10-30 mm.

Na początku rui mogą występować 3-4 pęcherzyki o wielkości 25-35 mm. Tylko jeden z nich
staje się dominujący i owuluje a pozostałe ulegają atrezji. Receptory dla FSH można znaleźć
w komórkach granulozy pęcherzyków jajnikowych. Pobudza komórki granulozy do
wydzielania plazminogenowego aktywatora tkanki, który jest protezą i osłabia napięcie
ścianek pęcherzyka. FSH może mieć wpływ na unaczynienie pęcherzyka jajnikowego i na
owulację.

Prolaktyna:
Jest wydzielana przez komórki mamotropwe przedniego płatka przysadki mózgowej.
Wydzielanie prolaktyny jest regulowane przez ujemne sprzężenie zwrotne. W regulacji
obwodowej syntezy i sekrecji prolaktyna istotną rolę odgrywają esriadiol i hormony tarczycy.
Estradiol stymuluje hipertrofię komórek laktotropowych przysadki i wzrost syntezy
prolaktyny przez aktywację transkrypcji genu. U klaczy zaobserwowano tendencje wzrostowe
prolaktyny przez ruję. Wzrost ten może być spowodowany przez sekrecję prostaglandyny
F2alfa podczas luteinazy. Stężenie prolaktyny we krwi i przysadce wzrasta podczas sezonu
rujowego.

Najwyższe stężenie prolaktyny w surowicy krwi klaczy przypada na okres od maja do
sierpnia, a najniższe od września do lutego.
Prolaktynie przypisuje się wyzwalanie instynktu macierzyńskiego. W miarę wzrostu oseska i
wprowadzania

…?

Hormony jajnikowe – progesteron:
W 1-2 dniu owulacji młoda struktura, nie przypominająca ciałka żółtego, zaczyna
produkować progesteron. Poziom progesteronu systematycznie i gwałtownie wzrasta,
osiągając szczyt w 6 dniu i pozostaje przez kilka dni na tym samym poziomie. Dojrzałe ciałko
żółte produkuje progesteron, w b. wysokim stężeniu (8-10 ng/ml). Ok. 14-15 dnia cyklu
rozpoczyna się stopniowo luteoliza, która jest wynikiem uwalniania PGF2alfa
(prostaglandyna) z błony śluzowej macicy klaczy. W pierwszych dniach rui poziom
progesteronu obniża się gwałtownie, osiągając wartość ok. 1 ng/ml.

Progesteron zmienia zachowanie płciowe klaczy i powoduje zmiany wewnętrzne w jej
organizmie. Szyjka maciczna pod wpływem progesteronu kurczy się i szczelnie zamyka, traci
obrzęk i zmienia kolor. Liczne małe gruczoły wydzielnicze pod wpływem progesteronu
zmieniają strukturę i funkcję.

Prostaglandyna PGF2alfa:
Jest uwalniana z błony śluzowej macicy klaczy przez naczynia limfatyczne i krwionośne
krezki jajnika dociera do ciałka żółtego. PGF2alfa poziom podczas cyklu rujowego u klaczy
wzrasta między 14 a 16 dniem. Czas uwalniania wynosi od 1 do 4 dni, z pierwszym
mniejszym szczytem, który rozpoczyna właściwą luteolizę. Obecność prostaglandyny
powoduje luteolizę ciałka żółtego i natychmiastowy spadek poziomu progesteronu we krwi co
prowadzi do rui. Czas

…?

Uwalniane PGF2alfa wymaga wcześniejszego, długotrwałego działania progesteronu, który
stymuluje działanie

…?

Sezonowość aktywności rozrodczej klaczy:
Głównym czynnikiem regulującym sezonowość rozrodczą u klaczy jest światło. Wydłużenie
dnia świetlnego i zmniejszenie stężenia melatoniny powoduje rozpoczęcie sezonu
rozrodczego. Światło działa na siatkówkę

…?

Egzogenna melatonina zmniejsza ilość uwalniającego GnRH z podwzgórza klaczy. Z
nadejściem wiosny, wydłużeniem dnia świetlnego, wzrostem temp.

…?