Wprowadzanie grup 

funkcyjnych do białek

Wprowadzanie grupy 

sulfhydrylowej

Odczynnik Trauta (2-imidotiolan)
Rozpuszczalny w wodzie.
Reaguje z pierwszorzędowymi aminami w zakresie pH 7 -10.
Przebieg reakcji można śledzić spektrofotometrycznie.  2-

imidotiolan absorbuje światło λ

max

 = 248 nm. W wyniku 

reakcji dochodzi do spadku intensywności sygnału.

Odczynnik Trauta jest często wykorzystywany do otrzymywania 

immunotoksyn.

Białka modyfikowane odczynnikiem Trauta są bardzo podatne na 

utlenianie i mogą tworzyć disiarczki.  

Dodanie EDTA do stężenia 0.1 M znacznie obniża utlenianie zależne od 

metali.

Jest grupa związków modyfikujących, które wprowadzają tzw. 

„chronione” grupy sulfhydrylowe. Zmodyfikowane białko może być 
dzięki temu przechowywane przez dłuższy czas. 

Aktywacja grupy 

sulhydrylowej zachodzi bez udziału związków redukujących

, co 

pozwala na zachowanie nienaruszonych natywnych disiarczków w 
białku.  Jest to istotne zwłaszcza gdy disiarczki są niezbędne do 
zachowania aktywności białka (np. niektóre białkowe toksyny).

SATA (N-bursztynoimidylo S-acetylotiootan)
SATA jest często używane do konstrukcji koniugatów przeciwciało-enzym. 

Większość przeciwciał poliklonalnych może być modyfikowane SATA 
(nawet 6 cząsteczek SATA/cząsteczkę przeciwciała) bez widocznego 
spadku powinowactwa do antygenu. Niektóre przeciwciała 
monoklonalne mogą być wrażliwe na modyfikację SATA.

Często wykorzystuje się SATA do koniugacji z awidyną lub streptawidyną.

Aktywacja grup sulfhydrylowych zachodzi 
w obecności nadmiaru hydroksyloaminy

Modyfikacja grup karboksylowych cystaminą

Cystamina jest mała cząsteczką zawierającą disiarczek, 

zakończoną pierwszorzędowymi aminami.

Karbodiimid najpierw aktywuje 
grupę karboksylową

Białko wyznakowane cystaminą można połączyć z innym białkiem zawierającym grupę 
sulfhydrylową w reakcji wymiany disiarczku.

Cystamina może być także wykorzystana do połączenia 2 cząsteczek za pomocą swoich
końcowych reszt aminowych. Środkowy disiarczek jest zachowany – można rozdzielić
cząsteczki związkiem redukującym.

Wprowadzanie grup 

karboksylowych

Wiele grup funkcyjnych, np. grupy aminowe, sulfhydrylowe, reszty 

histydyny i metioniny, może ulec modyfikacji z wytworzeniem 
grupy karboksylowej.

Wprowadzenie grupy karboksylowej zmienia ładunek netto 

białka : zmiana pI; często wiąże się to nawet z utratą 
aktywności białka.

Bezwodniki kwasów organicznych
Reagują z pierwszorzędowymi aminami, a także z grupami OH 

seryny i tyrozyny, grupami SH i pierścieniem imidazolowym 
reszt His.

Jodooctan
Może reagować z wieloma grupami funkcyjnymi w białku: grupami 

SH reszt Cys, azotem pierścienia imidazolowego reszt His, 
grupą tioeterową Met i pierwszorzędowymi aminami. 

Jodooctan z reguły jest używany do blokowania grup reaktywnych.

Wprowadzanie pierwszorzędowych 

grup aminowych

W większości przypadków  białka zawierają wystarczającą ilość 

grup aminowych odpowiednich do reakcji modyfikacji lub 
sprzęgania. Zdarza się jednak, że pewne peptydy oraz białka 
mają zbyt mało wolnych grup aminowych.

Takim przykładem jest peroksydaza chrzanowa (HRP) – tylko 2 

wolne grupy aminowe.

Wprowadzenie dodatkowych grup aminowych zwiększa 

efektywność sprzęgania.

Modyfikacje grup karboksylowych diaminami
Diaminy – związki zawierające pierwszorzędowe grupy aminowe 

na obu końcach cząsteczki.  W reakcji z grupą karboksylową 
powstaje wiązanie amidowe, na końcu – wolna grupa aminowa.

Uwaga! Modyfikacja diaminami maże mieć ogromny wpływ na 

całkowity ładunek białka  i zmienia pI białka. Może mieć to 
istotny wpływ na aktywność białka.

Blokowanie grup funkcyjnych

Cele:
1.

Ukierunkowanie reakcji koniugacji względem konkretnej 
grupy funkcyjnej

2.

Zapobieganie niekontrolowanej polimeryzacji cząsteczek

3.

Zapobieganie utlenienia grup SH

4.

Zabezpieczanie grup funkcyjnych podczas reakcji sprzęgania 
bifunkcjonalnymi związkami sieciującymi

5.

Zakańczanie reakcji sprzęgania lub modyfikacji.

Blokowanie grup aminowych

Octan sulfo-NHS
Wysoka reaktywność względem grup aminowych w pH 7-9. 

prowadzi do acylacji amin; reakcja nieodwracalna.

Nie używać w buforach zawierających Tris, glicynę lub imidazol. 

Zalecane bufory fosforanowe, boranowe, węglanowe.

Bezwodnik kwasu octowego
Acetylacja grupy aminowej w białku jest relatywnie 

specyficzna jeżeli jest prowadzona w nasyconym roztworze 
octanu sodu. W nadmiarze jonów octanowych pochodne O-
acetylotyrozyny są niestabilne. Pochodne tyrozyny 
gwałtownie hydrolizują w zasadowym pH, nawet przy 
braku jonów octanowych.

Dodanie hydroksyloaminy także  powoduje rozpad 

pochodnych O-acetylotyrozyny.

Blokowanie grup sulfhydrylowych

Są dwa typy związków blokujących: odwracalne i nieodwracalne. 

Nieodwracalne prowadzą do wytworzenia wiązania tioeterowego. 
Odwracalne blokują poprzez wytworzenie wiązania S-S i mogą być 
usunięte odpowiednim związkiem redukującym.

N-etylomaleimid
Związek alkilujący reagujący z grupami SH – powstaje stabilne 

wiązanie tioeterowe.

Reaguje specyficznie z grupami SH w pH 6.5-7.5

Pochodne jodooctanowe
Jodoacetamid – wykazuje najwyższą reaktywność względem grup SH. 

Przy właściwie dobranym stosunku jodoacetamidu względem grup 
SH i w lekko zasadowym pH, zachodzi wyłącznie modyfikacja 
cystein. 

Odczynnik Ellmana
Związek odwracalnie blokujący grupy SH.

Blokowanie grup karboksylowych

Związki zawierające grupę aminową, m.in. Tris lub 

etanoloamina z udziałem karbodiimidu.