Kaseta z negatywami

Głowica 

z preparatem

Działo elektronowe

Ekran fluorecencyjny

Kamera 

Apertura

Apertura

Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) 

UTRWALANIE

DEHYDRATACJA

PRZESYCANIE ŻYWICĄ

ZATOPIENIE W ŻYWICY

KROJENIE ULTRACIENKICH SKRAWKÓW

KONTRASTOWANIE

M

M

M

M

szary

srebrny

złoty

purpurowy

niebieski

60

nm

90

150

190

240

nm

nm

nm

nm

skrawki używane do mikroskopu 
elektronowego

Rys.  Zależność pomiędzy grubością skrawka a jego barwą interferencyjną 

SEM of a Flower Spike

Note the great depth of field

Same stereocilia as in previous slide viewed using 
Nomarski optics (B) and TEM (C ).

In situ metody pozwalające lokalizować kwasy 
nukleinowe.

In situ

 i in vivo

 detekcja  of DNA

i RNA: 

Fluorescencyjna

 in situ hybrydyzacja

 (FISH)

Fluorescencyjne

 barwniki takie jak: DAPI, 

IP, TOTO

GFP konstrukty białek

 związanych z chromatyną

takich jak histony. 

In situ i in vivo

 eksperymenty z  użyciem

BrdU

In situ wykrywanie

 transkrypcji z użyciem

BrUTP, Cy3-UTP.. 

Fluorescencyjna

 in vivo hybrydyzacja

 (FIVH)

Inne metody in situ

takie jak np.

 in situ nick translacja

In situ PCR

i in situ RT PCR 

In situ

 i in vivo

 detekcja  of DNA

i RNA: 

Fluorescencyjne

 barwniki takie jak: DAPI, 

IP, TOTO

In situ

 i in vivo

 detekcja  of DNA

i RNA: 

Fluorescencyjne

 barwniki takie jak: DAPI, 

IP, TOTO

Cięcie optyczne

z

x

y

Nucleoli 

Mitochondria &
        plastids

In situ

 i in vivo

 detekcja  of DNA

i RNA: 

In situ i in vivo

 eksperymenty z  użyciem

BrdU

In situ wykrywanie

 transkrypcji z użyciem

BrUTP, Cy3-UTP.. 

In situ lokalizacja transkrypcji
inkubacja z 

Br UTP 

- Lupinus luteus

In situ localization of transcription

Br UTP 

incubation - Lupinus luteus

In situ localization of transcription

Br UTP 

incubation - Lupinus luteus

In situ localization of transcription

Br UTP 

incubation - Lupinus luteus

In situ localization of transcription

Br UTP 

incubation - Lupinus luteus

Solovei et al.. 2001

In situ

 i in vivo

 detekcja  of DNA

i RNA: 

GFP konstrukty białek

 związanych z chromatyną

takich jak histony. 

In situ

 i in vivo

 detekcja  of DNA

i RNA: 

Fluorescencyjna

 in situ hybrydyzacja

 (FISH)

A whole-mount in situ hybrydyzacja (WISH)

i in situ hybridization w całych komórkach.

In situ hybridization półcienkie skrawki. 

Przygotowanie materiału

Półcienkie skrawki

W  komórkach  roślinnych  i  zwierzęcych  błona  komórkowa  a  w 
komórkach roślinnych ściana komórkowa są barierami, które nie 
pozwalają  na  swobodną  penetracje  przeciwciał  do  wnętrza 
komórki gdzie znajdują się poszukiwane antygeny.

Najczęściej stosowany sposób – uzyskanie półcienkich 
skrawków.

Zalety:
*Idealny do badań tkankowych – zachowany układ komórek w 
tkance.

Wady:
*Obserwacja tylko fragmentu komórki.
*Pracochłonna technika.
*Możliwość utraty lub zablokowania części antygenów podczas  
preparatyki materiału.

Szukana sekwencja
  DNA lub RNA

Bufor hybrydyzacyjny

Znakowane sondy

półcienki skrawek
0.1 



m – 0.1 mm

Szkiełko podstawowe

Błona komórkowa

Półcienkie skrawki 

Półcienkie skrawki

 

Skrawki paraffinowe

Inne usuwalne

 żywice:  BMM, PEG, 

Technovit.....

Cryo-skrawki

Vibroskrawki

Vibratom:

Skrawki - aż do 100 m (0.1 

mm)
Przez kilka minut materiał 
„żywy” 

a

b

c

wz

ch

n

m

p

m

ł

p

o2

o1

Ovary

Jak dotrzeć do wnętrza komórki: microiniekcja

Kontrast fazowy: 
obraz komórki

Podczas iniekcji 
przeciwciał. 

Permeabilizacja błon komórkowych, izolacja protoplastów:

Permeabelizacja

 :

-Detergent (Triton X 100)

-Electroporacja
-Streptolysin O 
-Scrape-loading
-Wielokrotne zamrażanie 
-Peptidemediated
membrane transfer

Enzymatyczne lub chemiczne trawienie
Ściany komórek roślinnych:
pektynaza,  celulaza maceroenzym....

-Żywe komórki pH 5.4-5.8, temp. ~23

O

C

-Komórki utrwalone pH 4.6-4.8, temp. 37

O

C

Hipertonic solution

Plasmolysis of intact plant cells can be
 used to facilitate the passage of DNA 

Electroporation can then be used to transfer
 the macromolecules into plant cells. 

Fang-Sheng   et al. 2001