Regulacja ekspresji
genów
ramka odczytu (ORF)
Regulacja ekspresji
genów
ramka odczytu (ORF)
Regulacja ekspresji beta-galaktozydazy – regulacja na poziomie
transkrypcji
start transkrypcji stop
transkrypcji
promoto
r
ramka
odczytu dla
beta-
galaktozyda
zy
bakterie wytwarzają
białko represorowe
gen kodujący
beta-
galaktozydazę
Brak laktozy: represor wiąże się do promotora,
polymeraza RNA nie może się przyłączyć do promotora,
brak transkryptu, brak biosyntezy białka beta-
galaktozydazy
wiąże
laktozę
wiąże DNA
promotora
polymeraza
RNA
brak transkrypcji
brak biosyntezy
białka
Laktoza dostępna: laktoza wiąże represor, białko
represorowe zmienia kształt i nie może wiązać się do DNA
promotora, polymeraza RNA wiąże się do promotora,
następuje transkrypcja i biosynteza białka beta-
galaktozydazy
laktoza
zmiana
kształtu
represora
promot
or
polymeraza RNA
transkrypcj
a
Film 1
NADMIAR ŻELAZA NIEDOBÓR ŻELAZA
Fur+Fe
2+
RyhB
sRNA RyhB
mRNA frn
Białko ferrytyna
ZWIĘKSZONE MAGAZYNOWANIE
ŻELAZA, ZMNIEJSZONE PRZYSWAJANIE
ŻELAZA (ZMNIEJSZONA SYNTEZA BIAŁEK
TRANSPORTUJĄCYCH ŻELAZO
DO WNĘTRZA KOMÓRKI)
ZMNIEJSZONE MAGAZYNOWANIE
ŻELAZA, ZWIĘKSZONE
PRZYSWAJANIE
ŻELAZA
(ZWIĘKSZONA SYNTEZA BIAŁEK
TRANSPORTUJĄCYCH ŻELAZO
DO
WNĘTRZA KOMÓRKI)
Nieaktywny represor
Fur
Aktywny represor
Fur
Fe
+2
TTGACAGATAATGATAATCATTATCTATAAT
-35
-10
Fe
+2
Fe
+2
TTGACAGATAATGATAATCATTATCTATAAT
-35
-10
Regulacja poziomu żelaza w komórkach bakteryjnych –
regulacja na poziomie transkrypcji
Polymeraza
RNA
Nadprodukcja białek
(ang.
overexpression)
Miejsca cięcia enzymami
restrykcyjnymi w obrębie
polilinkera
Plazmid z
genem 1
(niebieski)
Trawienie enzymami
restrykcyjnymi,
Oczyszczanie
liniowego plazmidu
Ligacja oczyszczonego plazmidu
z DNA kodującym
gen 2
(czerwony)
,
Oczyszczanie uzyskanego
kolistego plazmidu
Plazmid z nowym genem
Gen oporności
na antybiotyk
Plazmid
rekombinowany Chromosom
bakteryjny
DNA genomowy
z genem docelowym
Miejsca cięcia
enzymu(ów)
restrykcyjnego(ych)
Ligacja
Plazmi
d
Wprowadzanie obcego DNA do komórek
gospodarza
Transformacja
Bakterie gramdodatnie Bakterie
gramujemne
Wprowadzanie obcego DNA do komórek
Eukaryota
Transfekcja
fosforan
wapnia
sztuczne
liposomy
DEAE-
dekstran
Wprowadzanie obcego DNA do komórek
Eukaryota
Transfekcja
lipidy
kationowe
wiązanie
do błony
komórkow
ej
endocytoza
transfer
do
cytoplazm
y
degradacja
przez
lizosom
Oporność bakterii na antybiotyki
wykorzystana do selekcji
właściwych klonów, czyli bakterii
zawierających plazmid z
badanym genem
Antybiogram
– wykazanie
oporności
bakterii na
działanie
antybiotykó
w
Działanie
antybiotykó
w
Nadprodukcja
białek w
systemach
prokariotycznyc
h i
eukariotycznych
Transfekcja
Transformacja
(komórki ssacze) (bakterie lub
drożdże)
Detekcja i oczyszczanie białka
Transformacja – wprowadzanie
DNA do komórek bakterii, drożdży:
metoda chemiczna (działanie
solami metali dwuwartościowych,
np. CaCl
2
) lub elektroporacja
(działanie prądem elektrycznym o
wysokim napięciu)
Transfekcja – wprowadzanie DNA
do komórek ssaczych, owadzich
(elektroporacja, działanie
związkami lipidowymi)
Regulacja ekspresji beta-galaktozydazy – regulacja na poziomie
transkrypcji
start transkrypcji stop
transkrypcji
promoto
r
ramka
odczytu dla
beta-
galaktozyda
zy
bakterie wytwarzają
białko represorowe
gen kodujący
beta-
galaktozydazę
Brak laktozy: represor wiąże się do promotora,
polymeraza RNA nie może się przyłączyć do promotora,
brak transkryptu, brak biosyntezy białka beta-
galaktozydazy
wiąże
laktozę
wiąże DNA
promotora
polymeraza
RNA
brak transkrypcji
brak biosyntezy
białka
Laktoza dostępna: laktoza wiąże represor, białko
represorowe zmienia kształt i nie może wiązać się do DNA
promotora, polymeraza RNA wiąże się do promotora,
następuje transkrypcja i biosynteza białka beta-
galaktozydazy
laktoza
zmiana
kształtu
represora
promot
or
polymeraza RNA
transkrypcj
a
E. coli BL(DE3)
T7
Nadprodukcja białek w bakteriach Escherichia coli
Induktor nadprodukcji białek –
IPTG
(izopropylotiogalaktopiranozy
d)
Induktor (IPTG)
inaktywuje białko
represorowe
Wiązanie represora
blokuje transkrypcję
Represo
r Lac
Kataboliz
m laktozy
-galaktozydaza Permeaza
Transacetylaza
Promotor T7 rozpoznawany jest przez polimerazę T7 RNA
kodowaną w genomie E. coli. Ekspresja genu dla polimerazy T7
RNA kontrolowana jest przez promotor lac, który rozpoznawany
jest przez bakteryjną polimerazę RNA (jej gen znajduje się w
genomie bakteryjnym).
Oporność bakterii na antybiotyki
wykorzystana do selekcji
właściwych klonów, czyli bakterii
zawierających plazmid z
badanym genem
Antybiogram
– wykazanie
oporności
bakterii na
działanie
antybiotykó
w
Działanie
antybiotykó
w
Wektory
Plazmidy i wirusy stosowane jako nośniki obcych
genów
Wprowadzają obce geny do komórki gospodarza
Mają zdolność do autonomicznej replikacji w
komórkach docelowych
Plazmidy
Koliste cząsteczki DNA obecne w komórkach
bakteryjnych
Replikują się niezależnie od chromosomu
bakteryjnego
Wirusy
Pochodne wirusa krowianki, bakulowirusów,
adenowirusów, retrowirusów
Wprowadzanie obcego DNA do komórki
Metoda chemiczna - działanie solami metali
dwuwartościowych, np. chlorkiem wapnia,
chlorkiem magnezu, chlorkiem litu
Elektroporacja – krótkotrwałe działanie prądem
elektrycznym o wysokim napięciu
Metody transformacji czyli wprowadzania
obcego DNA do komórek
Bakterie i drożdże
Wprowadzanie obcego DNA do komórek
gospodarza
Transformacja
Bakterie gramdodatnie Bakterie
gramujemne
oczyszczone
białko
*
plazmid
DNA
kodujący
insulinę
bakterie
plazmi
d
DNA
dawca
DNA
bakteri
a
insulin
a
transkrypcja i
translacja
Produkcja białek w
bakteriach
rekombinowa
ny
produkcja białka
Wprowadzanie obcego DNA do komórek
Eukaryota
Transfekcja
fosforan
wapnia
sztuczne
liposomy
DEAE-
dekstran
Wprowadzanie obcego DNA do komórek
Eukaryota
Transfekcja
lipidy
kationowe
wiązanie
do błony
komórkow
ej
endocytoza
transfer
do
cytoplazm
y
degradacja
przez
lizosom
Rekombinacja – wymiana fragmentów
DNA
plazmid
plazmi
d
czynnik
transfekcyj
ny
Ekspresja wprowadzonych genów:
1. Bezpośrednio z plazmidu
2. Po wbudowaniu genu
do chromosomu
Plazmidy Ti z Agrobacterium tumefaciens kodują geny
odpowiedzialne za syntezę pochodnych aminokwasów, tzw.
opin , które bakterie wykorzystują jako źródło węgla. Na
plazmidzie są również kodowane geny sterujące
katabolizmem opin, warunkujące transfer plazmidu i jego
replikację.
Część tego plazmidu, tzw. T-DNA, po zakażeniu ulega
integracji z genomem rośliny. W ten region można
wprowadzić obcy DNA, a uzyskany konstrukt wprowadzić do
komórki roślinnej. Na obu jego końcach leżą krótkie
powtórzenia (24-25 par zasad) niezbędne do integracji z
genomem. W procesie przenoszenia T-DNA do komórki
roślinnej uczestniczą także geny plazmidowego regionu vir i
pewne geny zlokalizowane na chromosomie bakterii.
Wprowadzanie DNA do komórek
roślinnych za pomocą wektora
Tworzenie roślin
transgenicznych z udziałem
Agrobacterium
Agrobacteri
um
plazmid
przecięcie
plazmidu
wycięcie genu z
chromosomu
połączenie
genu z
plazmidem
transgeniczn
y rzepak
Bawełna transgeniczna z
wprowadzonym genem
insektycydu
Ryż (Golden
Rice) z
wprowadzonym
i genami
syntezy
prowitaminy A
Rośliny
transgeniczne