Przykład metody FRAP= Fluorescence Recovery After 

Photobleaching  :

Figure 1. Monitoring the 

fluorescence before photobleaching

Figure 2. Monitoring the 

fluorescence after photobleaching

Figure 3. Monitoring the recovery 

of fluorescence after 

photobleaching

Figure 4. Graphical presentation of data collected 
during a FRAP experiment. A baseline of 
fluorescence is collected (1) before the 
photobleaching occurs (arrow) so that the amount of 
fluorescence is reduced significantly (2). Over time, 
the amount of fluorescence in the photobleached 
area increases as unbleached molecules diffuse into 
this area (3). Later, there is a stabilization of the 
amount of fluorescence recovery (4) and a flat line is 
obtained. The percent recovery uses the formula: (Y/ 
X) x 100 = % recovery. In the diagram, the 
percentage of fluorescence lost due to 
photobleaching is X and the amount of fluorescence 
that returned to the bleached area is Y. In practice, 
the percent recovery almost never reaches 100%. 
The lateral mobility is determined by the slope of the 
curve (3). The steeper the curve, the faster the 
recovery and therefore, the more mobile the 
molecules.

Metoda FRAP

Wyniki analizy dynamiki pol II metodą FRAP :

Kinetyka pol – GFP 

metoda FLIP

 :

Przemieszczanie białek GFP-SMN między jądrem 

a cytoplazmą

     Zaobserwowano 

spadek intensywności 
sygnału GFP-SMN w 
jądrze, w ciałach Cajala

Badanie dynamiki GFP-pol II metoodą iFRAP :

 

 

FRET – 

FRET – F

F

luorescencyjny 

luorescencyjny E

E

nergii 

nergii T

T

ransfer 

ransfer 

Potrafimy już wykrywać białka w żywej komórce.

Jak obserwować DNA czy RNA w żywej komórce?

 

Metody pośrednie:

np. histonowe białka fuzyjne, fuzyjne białka SSB 

Wklonowywanie fragmentów markerowych DNA

 w określone miejsca w genomie

przykład: represor-laktozowy 

Obecnie  dostępne  technologie  do  detekcji  genów  w 
komórkach, 

              takie jak in situ hybrydyzacja czy in situ PCR

                      nie pozwalają na detekcje in vivo

         ponieważ linearne sondy używane w tych próbach

                 muszą być odpłukane po hybrydyzacji

           aby zmiejszyć różnice miedzy sygnałem a tłem.

FISH:  od in situ do in vivo - Nowe perspektywy  

Aby można to zrobić sonda musi rozpoznawać cel

(szukany gen lub transkrypt) z dużą wydajnością,

a następnie po hybrydyzacji stać się wykrywalna,

wykazywać dużą różnicę miedzy tłem a sygnałem

pozwalając rozróżnić pozytywne i fałszywie pozytywne 
wyniki.

Próba musi również wnikać do komórek z dużą 
wydajnością.

Pomiędzy obecnie dostępnymi technologiami do 
detekcji 

kwasów nukleinowych w żywch komórkach 
najbardziej 

obiecująca wydaje się technologia  

Molecular 

Beacons.

Lighting

 the WA

Y

•MBs  są  nowymi  sondami  o  kształcie  główki  od 
szpilki 

które emitują fluorescencje kiedy zhybrydyzują z 

komplementarnym do nich DNA/RNA.
 

•Molecular beacons zostały niedawno odkryte

przez  Tyagi  i  Kramera  z    Public  Health  Research 
Institute, 

New York, USA 

Budowa Molecular Beacon

 

Perlette andTan 2001

specyficzna dlamRNA -actyny,

fluorescencyjne obrazy co 3-min  

Actin mRNA

Tyagi and Alsmadi 2004

Tyagi and Alsmadi 2004

Nie do każdego fragmentu szukanego RNA należy konstruować sondę
typu MB 

Wavelength-shifting molecular beacons

System 2x Molecular Beacon

Santangelo et al. 2004

Jak wprowadza się sondy typu Molecular beacon

do wnętrza komórki ?

1. Mikroiniekcja

2. Hybrydowe sondy MB

Ostatnie  badania  pozwoliły  zidentyfikować 
małe 

regiony 

w 

niektórych 

białkach 

(9±16 

aminokwasów) 

nazwanych  protein  transduction  domains 
(PTDs) lub 

cell penetrating peptides (CPPs) które które 

powodują,  że  białka  je  posiadające  mają 
zdolność do 

łatwego przenikania przez memnrany

Sondy typu PNA – Peptide Nucleic Acid

Trzy rodzaje sond typu PNA 
posadających 

różny 

sposób 

przyłączenia 

peptydu  do  sondy  typu 
molecular beacon. 

Konstructy PNA molecular beacon wnikają do wnętrza żywej 
komórki  w ciągu 30 min z prawie 100% wydajnością.

Nitin N. at al. 2004

Problem 1: hybrydy RNA/DNA

 są potencjalnym celem dla 

   komórkowych RNAz

Rozwiązanie :
Sondy MB typu 2`-o-methyl RNA

Jakieś inne problemy?

Fluorescencyjnie znakowane 2`-o-methyl 
RNA

Molenaar  et al. 2001 

Kiedy oligonukleotydowe sondy są wstrzykiwane do komórek
żeby pokazać rozkład RNA, są one szybko transportowane
i zatrzymywane na terenie jądra. 

Rezultat trudno wykrywać mRNA w cytoplazmie żywych komórek.

Rozwiązanie – e.g. tRNA molecular beacons

Znakowane tRNAs, po wniknięciu do jądra
są następnie eksportowane do cytoplazmy.
 

Mhlanga M. et al. 2005

Fig c – obraz złożony pokazujący komórki po 30 min
of inkubacji. Czerwona fluorescencja - tRNA-MB
zielona fluorescencja zwykłych MB.

Mhlanga M. et al. 2006

Jak hybrydyzować do DNA w żywej komórce?

Główny problem denaturacja dwunicowego DNA 

Hybrydizacja DNA i PNA Molecular Beacon do
jedno i dwuniciowego DNA

1. PNA otwieracze tworzą tripletowe struktury na 

flankach szukanej sekwencji 

2. Kiedy dsDNA jest otwarty sondy typu MB mogą 

hybrydyzować do drugiej nici.

PNA denaturacja i Molecular Beacon`s in vivo fluorescencenccja
hybrydizacja do chromosomalnych telomerowych powtórzonych
sekwencji w żywej komórce

Tanke et al. 2006

Molecular Beacon: 

nowe zastosowanie do detekcji białek w żywych 
komórkach

Sekwencje przyłączające
się do białek SSB 

Nowe spojrzenie na regulacje 

ekspresji genetycznej

Reinicjacja transkrypcji

Transkrypcja  jest  procesem  powtarzalnym,  podczas  którego 
następuje  synteza  wielu  identycznych  kopii  RNA  z  tego 
samego genu

W ujęciu klasycznym w skrócie proces ten odbywa się w czterech etapach:
* rozpoznanie promotora genu, etapy *inicjacji, *elongacji i *terminacji transkrypcji

Pytania: 
1. Kiedy gen zostanie już raz uruchomiony, czy następne cykle 
transkrypcyjne przebiegają w ten sam sposób czy następuje 
„przetarcie szlaku”?
2. Czy istnieją mechanizmy zatrzymujące przy genie maszynerię 
transkrypcyjną po każdym cyklu?
3. Czy sam gen i jego otoczenie ulegają w takim przypadku 
„imprintingowi transkrypcyjnemu” 

Tworzenie PIK*

Mechanizm zależnej od matrycy reinicjacji transkrypcji

*PIK - 

P

renic

j

acyjny 

k

ompleks

Przyłączenie 

polimerazy

RNA 

Inicjacja, elongacja
i terminacja syntezy  
RNA

(a)
Reinicjacja podstawowa

(b)
Reinicjacja typu PIK

(c)
Szybka reinicjacja

Oddysocjowanie 
RNA

(b) W PIK reinicjacji podczas pierwszego 
cyklu    matryca  jest  modyfikowana. 
Powstaje  stabilny  kompleks  DNA-białka. 
Zawiera  on  wszystkie  lub  tylko  niektóre 
czynniki  transkrypcyjne  (TF)  niezbędne 
do następnego cyklu transkrypcji.
Charakterystyczna dla wszystkich trzech 
polimeraz eukariotycznych

(a) 

Podstawowy 

szlak 

reinicjacji 

transkrypcji.  Wszystkie  procesy  i  etapy 
które  odbywają  się  w  pierwszej  rundzie 
transkrypcyjnej 

muszą 

zostać 

powtórzone  w  każdym  kolejnym  cyklu.   
Charakterystyczny 

dla 

polimeraz 

bakteryjnych.

(c)  W  szybkiej  reinicjacji  polimeraza 
może 

prowadzić 

wiele 

cykli 

transkrypcyjnych  na  tym  samym  genie 
bez oddysocjowania przy każdym cyklu.
Występuje tylko dla polimerazy III

Mechanizm zależnej od białek reinicjacji transkrypcji

(model uproszczony nie zawiera czynników elongacyjnych i terminacyjnych)

Matryca DNA

Białkowe składniki

transkrypcyjne

Regeneracja  

Transkrypcja  

DNA, RNA 

DNA, RNA 

DNA, RNA 

Modyfikacje
odwracalne

Inaktywacja 

nieodwracalna

Bezpośrednia

reaktywacja 

100 aktywnych genów 5S rDNA produkuje ~ 2000 kopii 5S 
rRNA w ciągu minuty. Jeden cykl zachodzi co 3 sekundy. 

Wydajność transkrypcji ~ 40 nukleotydów/sekunde.

Długość 5S rRNA ~ 120 nukleotydów.

Czas na reinicjacje pozostaje mniej niż pół sekundy!!!

5’ sekwencje flankujące  A-blok        B-blok       Terminacja

Pol III          

TFIIIC          

TFIIIB      

Transkrypcja      

Szybka reinicjacja

Eukariotyczna polimeraza III