OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCH
OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCH
TOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI
TOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
SPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREM
SPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREM
MASOWYM (HPLC-MS)
MASOWYM (HPLC-MS)
Dr inż.Agata Kot-Wasik
Katedra Chemii Analitycznej,
Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska
ul. G.Narutowicza11/12,
80-952 Gdańsk, Poland
agata@chem.pg.gda.pl
Dr Hanna Mazur-Marzec
Instytut Oceanografii, Uniwersytet Gdański,
Al. Marszałka Piłsudskiego 46,
81-378 Gdynia, Poland
biohm@univ.gda.pl
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
ANALIZĘ TOKSYN:
ANALIZĘ TOKSYN:
TESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNE
TESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNE
–
–
ELISA (
ELISA (
ang
ang
.
.
E
E
nzyme
nzyme
-
-
L
L
inked
inked
I
I
mmuno
mmuno
s
s
orbent
orbent
A
A
ssay
ssay
)
)
pozwala na oszacowanie obecności toksyn,
np. wydzielanych przez glony z rodzaju Microcystis,
na poziomie kilku µgL
-1
bez przygotowania próbki,
lecz nie pozwala na ich identyfikację.
–
–
PPI
PPI
(
(
ang
ang
.
.
P
P
rotein
rotein
P
P
hospatase
hospatase
I
I
nhibition assay
nhibition assay
)
)
metody wysoce selektywne, czułe i szybkie
J. Rapala, K. Erkomaaa, J. Kukkonen, K. Sivonen, K. Lahti, Analytica Chimica Acta 466 (2002) 213-231
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
ANALIZĘ TOKSYN:
ANALIZĘ TOKSYN:
METODY CHROMATOGRAFICZNE
METODY CHROMATOGRAFICZNE
–
GC–MS
GC–MS
- zapewnia wysoką selektywność
(specyficzność) oznaczenia, lecz wymaga
derywatyzacji analitów, a poza tym nie może
być zastosowana do analizy nielotnych toksyn
wysokocząsteczkowych.
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
ANALIZĘ TOKSYN:
ANALIZĘ TOKSYN:
–
–
HPLC-UV
HPLC-UV
lub
HPLC-DAD
HPLC-DAD
- jedna z
najczęściej
najczęściej
stosowanych technik, jednakże nie zapewnia
ona wystarczającej jakości uzyskiwanych
wyników bez zastosowania żmudnych i
długotrwałych procedur przygotowania próbki.
–
–
HPLC-fluorescencja
HPLC-fluorescencja
- rzadziej stosowana
technika, gdyż wymaga derywatyzacji analitów;
ale znacznie czulsza niż HPLC-UV.
HPLC–DAD
HPLC–DAD
analiza ekstraktu
analiza ekstraktu
Nodularii
Nodularii
HPLC-DAD
238 nm
254 nm
HPLC–DAD
HPLC–DAD
analiza ekstraktu
analiza ekstraktu
Nodularii
Nodularii
Analiza widma DAD
Wniosek: niezbędny jest wzorzec
celem potwierdzenia czasu
retencji i porównania widma UV
238 nm
254 nm
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
ANALIZĘ TOKSYN:
ANALIZĘ TOKSYN:
–
–
HPLC-UV
HPLC-UV lub
HPLC-DAD
HPLC-DAD
Pozwala na uzyskanie informacji o
masie cząsteczkowej oznaczanych
toksyn, a nawet ich identyfikację.
HPLC–DAD-MS
HPLC–DAD-MS
HPLC-MS
HPLC-MS
TAK, ALE ...
problem połączenia LC i MS !
Przepływ fazy ruchomej w LC wymusza problemy związane z
uzyskaniem wysokiej próżni. Podczas analizy GC (faza ruchoma:
gaz) przepływ gazu u wlotu do MS wynosi około 0.5-2ml/min.
Podczas kiedy w HPLC faza ruchoma w postaci ciekłej daje przepływ
gazu u wlotu MS rzędu 350ml/min w przypadku metanolu i aż
1000 ml/min w przypadku wody!
( J.Abian "The coupling of Gas and Liquid Chromatography with Mass Spectrometry ")
HPLC, 1 ml/min, 100-250 bar
MS, próżnia
HPLC-MS
HPLC-MS
Kwadrupol
Kwadrupol
Kolumna
Kolumna
HPLC
HPLC
Ciśnienie
Ciśnienie
atmosferyczne
atmosferyczne
Próżnia
Próżnia
Wysokie ciśnienie
Wysokie ciśnienie
+HV
+HV
Elektrorozpylanie
Elektrorozpylanie
(
(
electrospray
electrospray
)
)
ODPAROWANIE
ROZPUSZCZALNIKA
ROZPYLENIE
ROZSZCZEPIENIE
I POWSTANIE JONÓW
[M+
[M+
nH
nH
]
]
n+
n+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
++
++
+
++
+
+
++
+
+
++
++
+
++
+
+
++
+
+
++
++
+
++
+
+
+
+ +
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
HPLC–MS
HPLC–MS
analiza ekstraktu
analiza ekstraktu
Nodularii
Nodularii
HPLC-MS
SCAN
SIM
HPLC–MS
HPLC–MS
analiza ekstraktu
analiza ekstraktu
Nodularii
Nodularii
Widmo MS
SCAN
HPLC–MS
HPLC–MS
analiza ekstraktu
analiza ekstraktu
Nodularii
Nodularii
Analiza widma MS
Wniosek: wzorzec może potwierdzić
hipotezę o obecności nodularyny w
ekstrakcie, ale nie jest niezbędny.
[M+H]
[M+H]
+
+
= 825.4
= 825.4
M=824.4
M=824.4
NH
H
H
H
H
H
OMe
H
N
H
O
H
N
H
COOH
O
CH
3
H
NH
O
O
N
H
NH
NH
2
N
H
O
CH
3
H
H
COOH
H
CH
3
HPLC–MS
HPLC–MS
analiza ekstraktu
analiza ekstraktu
Nodularii
Nodularii
Widmo MS
SCAN
HPLC–MS
HPLC–MS
analiza ekstraktu
analiza ekstraktu
Nodularii
Nodularii
HPLC-MS
NH
H
H
H
H
H
OMe
H
N
H
O
H
N
H
COOH
O
CH
3
H
NH
O
O
N
H
NH
NH
2
N
H
O
CH
3
H
H
COOH
H
CH
3
[M+H]
[M+H]
+
+
= 811.3
= 811.3
M=810.3
M=810.3
dm-Nod
HPLC–DAD-MS
HPLC–DAD-MS
analiza ekstraktu:
analiza ekstraktu:
jezioro Karczemne
jezioro Karczemne
HPLC-DAD
HPLC-MS
MS-SCAN
MS-SIM
DAD
MS-SCAN
MS-SCAN
analiza ekstraktu: jezioro Karczemne
analiza ekstraktu: jezioro Karczemne
[M+H]
[M+H]
+
+
NH
2
+ O
Anatoksyna A
NH
CH
3
H
H
C
H
3
H
CH
3
H
H
H
O
N
H
O
C
H
3
H
N
O
OH
H
NH
CH
2
O
CH
3
A
H
C
H
3
O
N
H
H
NH
O
N
H
OH
R1
H
H
NH
2
N
H
MC RR
[M+2H]
[M+2H]
2+
2+
MS-SIM
MS-SIM
analiza ekstraktu: jezioro Karczemne
analiza ekstraktu: jezioro Karczemne
Jon monitorowany:
166 (Anatoksyna-a)
Jon monitorowany:
995 (MC-LR)
Jon monitorowany:
520 (MC-RR)
Jon monitorowany:
825 (Nod)
1046 (MC-YR)
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
ANALIZĘ TOKSYN:
ANALIZĘ TOKSYN:
–
HPLC–MS
HPLC–MS
- technika ta
pozwala na
uzyskiwanie informacji o masie cząsteczkowej
oznaczanych toksyn.
Widmo masowe - “odcisk palca” substancji
pozwala na jej identyfikację. Technika HPLC-DAD-MS
zaczyna być coraz powszechniej stosowana do analizy
toksyn ze względu na jej zalety oraz fakt, iż dzisiaj
systemy HPLC-MS stają się niezawodne, oferuje je coraz
większa liczba producentów, a ich ceny zbliżają się do
poziomu akceptowalnego przez większość laboratoriów.
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
ANALIZĘ TOKSYN:
ANALIZĘ TOKSYN:
–
HPLC–MS
HPLC–MS
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJĄCE
ANALIZĘ TOKSYN:
ANALIZĘ TOKSYN:
niezwykle użytecznym rozwinięciem techniki HPLC-MS
jest
LC-MS-MS
LC-MS-MS
–
–
HPLC-MS-MS
HPLC-MS-MS
- dzięki zastosowaniu
dodatkowego detektora masowego możliwa jest
identyfikacja nieznanych substancji jedynie na
podstawie ich widma masowego
(nawet bez
konieczności posiadania wzorców)
.
WNIOSKI KOŃCOWE:
WNIOSKI KOŃCOWE:
Technika
HPLC–MS
HPLC–MS
zaczyna być coraz
powszechniej stosowana w laboratoriach
analitycznych ze względu na jej zalety.
Wkrótce technika LC-MS stanie się techniką
rutynowych analiz.