Wykład 7
Ekspresja genów, biosynteza białka,
metody biotechnologiczne stosowane
w gospodarce Ŝywnościowej
Wykład 7
Ekspresja genów, biosynteza białka,
metody biotechnologiczne stosowane
w gospodarce Ŝywnościowej
Ekspresja genów
2
wd_7
Definicja genu
wd_7
3
Struktura genów prokariotycznych
wd_7
4
Promotor
Sekwencja
odpowiadająca
za wiązanie
rybosomu
Właściwa sekwencja
kodująca
Terminator
(transkrypcji)
5’
3’
Miejsce
inicjacji
transkrypcji
Sygnał
START dla
translacji
Sygnał
STOP dla
translacji
DNA
Struktura genów eukariotycznych
wd_7
5
rejony kodujące
(eksony)
rejony niekodujące
(introny)
gen eukariotyczny
DNA
5’
3’
5’
3’
promotor
Miejsce
inicjacji
transkrypcji
Miejsce
terminacji
transkrypcji
kodony stop:
UAA, UGA, UAG
kodon „start” -
koduje
metioninę
:
AUG
6
wd_7
Replikacja DNA w komórkach
eukariotycznych
7
wd_7
8
wd_7
Replikacja DNA w komórkach
eukariotycznych cd
wd_7
9
W procesie
replikacji
stwierdzono wiele aktywności enzymatycznych:
Topoizomeraza
– rozplata podwójną helise DNA, umoŜliwiając
rozpoczęcie procesu;
helikaza
- rozrywają wiązania wodorowe między nićmi matrycowego
DNA, rozdzielające je;
prymaza
- syntetyzuje starter – odcinek RNA;
polimerazy DNA
– syntetyzują DNA, wytwarzają wiązania fosfodiestrowe,
zgodnie z zasadą komplementarności;
egzonukleaza
- usuwa startery RNA z nici;
ligaza DNA
- uzupełnia brakujące wiązania fosfodiestrowe w szkielecie
nowozsyntezowanej nici DNA – łączy fragmenty Okazaki;
10
wd_7
Transkrypcja u
eukariotów
11
wd_7
nić sensowna
nić antysensowna
2. elongacja
– polimeraza RNA syntetyzuje RNA w kierunku 5’→3’
uŜywając 5’-trifosforanów jako substraty Kolejne zasady dobudowywane
są na podstawie komplementarności zasad (szybkość 50-100 zasad/sek),
zamiast
tyminy występuje uracyl
!
12
wd_7
Transkrypcja u eukariotów cd
3. terminacja
– transkrypcja trwa
A
C
G U
C
C
C
C
C
C
A
A
A
A
A A
G
G
G G
G
U
U
U
RNAP
5’
wd_7
13
3. terminacja
– transkrypcja trwa
do momentu, gdy kompleks
transkrypcyjny napotka sygnał
terminacji np. palindromowy
rejon bogaty w GC w efekcie RNA
przybiera postać
struktury spinki od
włosów
innym sposobem terminacji jest
białko rho
, które rozpoznaje
miejsca terminacji i kończy
tarnskrypcję
5’
mRNA
Sekwencja
terminacyjna
RNAP
Rho
ATPaza
zatrzymanie
Dojrzewanie mRNA u eukariotów:
Synteza blokady
(kapu)
na końcu 5’ –
przyłączenie
7-metyloguanozyny (m7G),
kap zabezpiecza koniec 5’ transkryptu przed
atakiem rybonukleaz oraz pełni rolę przy
biosyntezie białka –
tylko mRNA ma kap –
rRNA i tRNA kapu nie posiadają
Poliadenylacja
końca 3’
– dołączenie nawet
Poliadenylacja
końca 3’
– dołączenie nawet
do 500 reszt A – powstaje
ogon poly(A),
sekwencja ta stabilizuje mRNA ułatwia
tworzenie kompleksu z odpowiednimi
białkami i
utrudnia atak rybonukleazom
Splicing
– usunięcie
sekwencji intronowych
i
połączenie
sekwencji eksonowych
w
funkcjonalną cząsteczkę mRNA,
katalizowanie
przez snRNA – moŜliwy
alternatywny splicing
Redagowanie RNA
-
polega na insercji lub
delecji nukleotydów oraz na deaminacji
nukleozydów (C
→
U) – nie u wszystkich
organizmów
14
wd_7
wd_7
15
Biosynteza białka u eukariotów
16
wd_7
Aminoacylo – tRNA: aktywowane związki
pośrednie w biosyntezie białka
1 etap
2 etap
Dwuetapowa synteza aminoacylo-tRNA
17
wd_7
3 etapowa biosynteza białka - powstawanie wiązania
peptydowego pomiędzy aminokwasami
P- miejsce peptydylowe, A – miejsce aminokwasowe na rybosomie
18
wd_7
19
wd_7
Biosynteza białka - podsumowanie
20
wd_7
Obróbka potranslacyjna białka
21
wd_7
Kontrola ekspresji genów
22
wd_7
Operon laktozowy
brak laktozy
laktoza
Laktoza + H
2
O
→
→
→
→ galaktoza + glukoza
enzym:
ββββ
-galaktozydaza
laktoza
23
wd_7
Metageneza, uszkodzenia i naprawa DNA
24
wd_7
Delecja
wd_7
25
Mechanizm delecji na poziomie
całego chromosomu
Insercja
wd_7
26
Mechanizm insercji na poziomie
całego chromosomu.
Mutageny
Metyzacja guanidyny w DNA
przez dichlorfos (substancja
czynna insektycydów
fosforoorganicznych):
27
wd_7
28
wd_7
Naprawa DNA
29
wd_7
Elementy inŜynierii molekularnej
30
wd_7
Enzymatyczny rozkład kwasów
nukleinowych.
Działanie DNAazy II na cząsteczkę DNA
31
wd_7
5’ GGTACCAATTCAAAGCTTATG 3’
3’ CCATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’
Enzymy restrykcyjne – rozcinanie DNA w
specyficznych miejscach
Alu I
Hind III
A
↓↓↓↓
AGCTT
TTCGA
↑↑↑↑
A
5’ GGTACCAATTCA
A
3’
3’ CCATGGTTAAGT
TTCGA
5’
5’
AGCTT
ATG 3’
3’
A
TAC 5’
Alu I
AG
↓↓↓↓
CT
TC
↑↑↑↑
GA
5’
CT
TATG 3’
3’
GA
ATAC 5’
5’ GGTACCAATTCAA
AG
3’
3’ CCATGGTTAAGTT
TC
5’
tępe końce
lepkie/wystające końce
32
wd_7
5’ GGTACCAATTCA
A
||||||||||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGT
TTCGA
AGCTT
ATG 3’
|
A
TAC 5’
5’ GGTACCAATTCA
A
||||||||||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGT
TTCGA
AGCTT
ATG 3’
|
A
TAC 5’
Hind III
A
↓↓↓↓
AGCTT
TTCGA
↑↑↑↑
A
Hind III
5’ GGTACCAATTCA
A
3’
5’
AGCTT
ATG 3’
5’ GGTACCAATTCA
A
3’
|||||||||||||
5’
AGCTT
ATG 3’
|||
Enzymy restrykcyjne – zastosowanie
5’ GGTACCAATTCA
A
|||||||||||||
||||
|||
3’ CCATGGTTAAGT
TTCGA
AGCTT
ATG 3’
|
A
TAC 5’
|||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGT
TTCGA
5’
5’
AGCTT
ATG 3’
|||
3’
A
TAC 5’
|||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGT
TTCGA
5’
|||
3’
A
TAC 5’
ligaza
33
wd_7
5’ GGTACCCGGGCAA
||||||||||||||||||||
3’ CCATGGGCCCGTTTCGA
AGCTTATG 3’
|
ATAC 5’
5’ GGTACCAATTCAA
||||||||||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGTTGGCC
CCGGTATG 3’
|
ATAC 5’
Xma I
A
↓↓↓↓
CCGGT
TGGCC
↑↑↑↑
A
Age I
C
↓↓↓↓
CCGGG
GGGCC
↑↑↑↑
C
5’ GGTACCAATTCAA 3’
5’CCGGTATG 3’
5’ GGTAC 3’
Enzymy restrykcyjne – zastosowanie
ligaza
5’ GGTACCAATTCAA 3’
|||||||||||||
3’ CCATGGTTAAGTTGGCC 5’
5’CCGGTATG 3’
||||
3’ATAC 5’
5’ GGTAC
CCGG
T
ATG
|||||||||||||
3’ CCATG
GGCC
A
TAC
3’
5’
C
↓↓↓↓
CCGGG
GGGCC
↑↑↑↑
C
A
↓↓↓↓
CCGGT
TGGCC
↑↑↑↑
A
Xma I
Age I
5’ GGTAC 3’
|||||
3’ CCATGGGCC 5’
5’CCGGGCAAAGCTTATG 3’
||||||||||||
3’CGTTTCGAATAC 5’
34
wd_7
Cykl syntezy DNA w reakcji PCR
35
wd_7
Reakcja PCR - mieszanina reakcyjna
dwuniciowa
matryca DNA
sekwencja docelowa
bufor
dNTP
starter1
starter2
polimeraza Taq
36
wd_7
94°C
15s
94°C
3 min
te
m
p
er
at
u
ra
15x
1x
1x
94°C
15s
94°C
3 min
te
m
p
er
at
u
ra
15x
1x
1x
Profil termiczny reakcji PCR
65°C
15s
72°C
30s
czas
72°C
30s
4°C
±∞
65°C
15s
72°C
30s
czas
72°C
30s
4°C
±∞
cykl
podstawowy
cykle dodatkowe
37
wd_7
Zastosowanie metody PCR
38
wd_7
wektor
trawienie enzymem restrykcyjnym
DNA zawierający
wstawkę,
którą chcemy
przeklonować
trawienie
enzymem
restrykcyjnym
wstawka
Klonowanie DNA
ligacja wektora
ze wstawką
plazmid ze wstawką gotowy
do wprowadzenia do bakterii
39
wd_7
Pozytywne aspekty GMO
40
wd_7