Agroinfekcja
Agroinfekcja jest to naturalna zdolność gramujemnych bakterii glebowych z rodzaju
Agrobacterium do infekowania roślin w miejscach zranień i przekazywania fragmentu własnego
plazmidu, który ulega integracji z genomem komórki roślinnej.
Jednym ze sposób wprowadzania nowych genów do roślin jest ich przenoszenie za pośrednictwem
Agrobacterium.
Drobnoustroje z rodzaju Agrobacterium wspaniale opanowały sztukę „kolonizacji genetycznej” -
czyli wprowadzania własnych genów do komórek roślinnych.
Agrobacterium tumefaciens:
•
glebowa gramujemna bakteria
•
u roślin powoduje chorobę guzowatości korzeni – polega ona na wytworzeniu rakowatych
(tumorowatych) narośli w miejscach infekcji
•
jest to najlepiej poznany gatunek zakażający rośliny dwuliścienne
•
ma niezwykle szeroki zakres patogeniczności - poraża ponad 600 gatunków roślin
•
należy do rodziny Rhizobiaceae, a więc jest bliską krewniaczką bakterii brodawkowych
Charakterystyka choroby:
Atakuje głównie rośliny takie jak: winorośl, jabłoń, grusza, śliwa, czereśnia, wiśnia, rośliny z
rodziny różowatych, orzechowatych.
Do infekcji roślin dochodzi tylko poprzez uszkodzenia korzeni powstałe podczas sadzenia roślin
czy prac uprawowych, bądź podczas wzrostu korzeni (uszkodzenia spowodowane przeciskaniem
się korzeni pomiędzy składnikami gleby).
Bakteria nie wnika do korzeni, lecz wbudowuje do komórek roślinnych fragment DNA znajdujący
się w plazmidzie Ti, który jest odpowiedzialny za produkcję hormonów wzrostowych – auksyn i
cytokinin. Powoduje to szybką proliferację komórek, czego następstwem jest wzrost guza.
Naturalny system transformacji został zmodyfikowany w ten sposób, że geny indukujące guzy są
zastępowane przez inne geny i wprowadzane do komórek roślin przeznaczonych do uprawy
laboratoryjnej.
Szybkość wzrostu zrakowaciałej tkanki zależy od aktywności miazgi, największa jest najczęściej w
okresie wiosennym. Narośla, rozwijając się na korzeniach i szyjce korzeniowej, hamują
przewodzenie wody i składników pokarmowych, co ma wpływ na wzrost rośliny.
Roślina z guzami na systemie korzeniowym traci energię na budowę guza, którego wielkość może
w skrajnych przypadkach osiągać ciężar kilku kilogramów.
Wnikając przez skaleczone tkanki bakteria wprowadza do komórek rośliny fragment swojego
genomu wykorzystując w ten sposób roślinę jako bioreaktor produkujący dla niej pożywkę.
Guzy młode mają najczęściej kształt kulisty, są gładkie i miękkie, a zabarwienie ich jest
jasnokremowe. W miarę starzenia się, guzy drewnieją, zmienia się ich kształt, powierzchnia staje
się chropowata i w wyniku zamierania zewnętrznych komórek przybiera barwę ciemnobrunatną lub
czarną. Narośle na systemie korzeniowym nie są trwałe i zwykle po 2-3 latach rozpadają się,
zakażając glebę.
Odkyto, że wszystkie szczepy Agrobacterium wywołują chorobę. Porównania szczepów dokonali w
1974 roku Schell i Van Montagu wraz ze współpracownikami. Za patogenność odpowiada obecność
lub jej brak w komórce dodatkowej cząsteczki DNA (plazmidu), poza dodatkowym DNA
zawierającym informację genetyczną niezbędną do funkcjonowania komórki.
Wciąż prowadzone są prace mające na celu umożliwienie infekcji roślin jednoliściennych takich jak
jęczmień, kukurydza, pszenica, czy ryż. Istnieje również możliwość do prowadzenia transformacji
grzybów strzępkowych i drożdży.
Budowa plazmidu:
•
Plazmidem Agrobacterium tumefaciens jest plazmid Ti. Ze względu na swój rozmiar
nazywany jest megaplazmidem (ok. 200 tys. p.z.).
•
Wielkie plazmidy występują zwykle w komórce w niewielkiej liczbie kopii. Liczbę ich
cząsteczek w komórce ocenia się jako jedna do dwóch.
•
Różne szczepy A. tumefaciens przenoszą nieco odmienne plazmidy Ti, ale z reguły każdy z
nich zawiera jeden region T-DNA, u niektórych jednak szczepów plazmid Ti zawiera dwa
odrębne odcinki T-DNA: lewy (T
L
-DNA) i prawy (T
R
-DNA), albo trzy: lewy, prawy i
środkowy (T
C
-DNA), które niezależnie od siebie wnikają do komórki roślinnej.
•
W tym kolistym plazmidzie znajdują się geny odpowiedzialne za wirulencję, katabolizm i
syntezę opin charakterystycznych dla danego szczepu, syntezę określonych hormonów
roślinnych.
•
Zakres odcinka T-DNA plazmidu określany jest położeniem tzw. sekwencji granicznych,
które mają długość zaledwie ok. 25 p.z. I tworzą bezpośrednio przed i tuż za każdym
odcinkiem T-DNA.
•
Sekwencje graniczne wraz z T-DNA przenoszone są do komórki rośliny. Następnie to
właśnie ona integruje się z materiałem genetycznym gospodarza.
•
Plazmid zawiera również geny, które w roślinie indukują gromadzenie się w tkankach
porażonej rośliny nietypowych dla zdrowych roślin metabolitów, zwanych opinami (są to
pochodne aminokwasów i kwasów karboksylowych; są one nieprzyswajalne przez rośliny,
stanowią jednak doskonałą pożywkę dla bakterii).
•
Geny wywołujące tworzenie się korzeni włośnikowatych lub zrakowaceń nazywane
onkogenami. Jeżeli z plazmidu Ti usuniemy onkogeny i geny syntezy opin i zastąpi je
jakimkolwiek innym DNA, bakteria przekaże ten insert do rośliny. Ważne jest jednak
zachowanie prawej sekwencji granicznej, gdyż od niej zaczyna się proces przenoszenia
fragmentu DNA. Bakteria pozbawiona genów odpowiedzialnych za chorobotwórczość nie
powoduje jej rozwoju. Dlatego też stosuje się specjalne szczepy Agrobacterium, tzw.
rozbrojonych, czyli pozbawionych onkogenów. Geny opin są zwykle zachowywane i mogą
być wykorzystywane jako markery prawidłowej transformacji.
•
Geny biosyntezy opin i hormonów są zlokalizowane na terenie T-DNA, natomiast geny
wirulencji i katabolizmu opin występują razem poza T-DNA.
•
Geny fragmentu T są zaopatrzone w sekwencje rozpoznawane przez czynniki
transkrypcyjne roślin, takie jak TATA będące sygnałem do rozpoczęcia transkrypcji, czy
AATAAA stanowiące sygnał do terminacji i poliadenylacji.
•
W rejonie wirulencji o długości 30-40 kpz znajdują się geny wirulencji – vir. Dwadzieścia
cztery geny ułożone są w ośmiu operonach: virA (1 gen), virB (11 genów), virC (2 geny),
virD (4geny), virE (2geny), virF (1gen), virG (1 gen), virH (2 geny).
Rola genów virA i virG:
•
aktywacja pozostałych genów vir.
Rola genów virB:
•
kodują białka błonowe tworzące struktury, przez które przedostaje się odcinek T.
VirC i virE:
•
udział w ochronie i transporcie odcinka T.
virD:
•
odpowiedzialne za wycięcie odcinka T.
VirF i virH:
•
związane z podtrzymywaniem procesu rakowacenia, m.in.: kodują białka pełniące rolę
deoksyfikatorów związków roślinnych, utrudniających rozwój tumorów.
W proces transformacji zaangażowane są geny chvA, chvB, chvE, leżace na chromosomie
bakteryjnym.
chvA, chvB – kodowane przez nie białka odpowiedzialne są za połączenie bakterii z komórką
roślinną.
ChvE – bierze udział w aktywacji genów vir.
•
Geny chv i virA są transkrybowane konstytutywnie.
•
VirG – transkrybowany konstytutywnie jak i przez indukcje.
•
Pozostałe kodowane są przez sygnały zranionej tkanki roślinnej.
Dla sygnałem do infekcji są związki fenolowe o różnym charakterze, np.: (α-hydroksy)-syringon
występujący u roślin z rodziny Solanaceae, alkohol koniferylowy, pochodne kwasu benzoesowego,
cynamonowego, lub cukry uwalniane ze zranionej tkanki.
Chemoatraktanty
związki chemiczne, które powodują ruch komórek w kierunku wzrastającego gradientu stężenia
tych związków, określany mianem chemotaksji. Aby mogło dojść do chemotaktycznej odpowiedzi
komórki, w jej błonie komórkowej muszą znajdować się receptory zdolne do wiązania
chemoatraktantów. Mogą to być związki o różnej budowie chemicznej. Zwykle chemoatraktanty są
komórkowo specyficzne, a ich wpływ jest zależny od stężenia. Bakterie wyczuwają gradient
chemoatraktantów poprzez pomiary ich stężeń w czasie. Bakteria zaczyna się poruszać w
przypadkowym kierunku i jeśli w tym czasie stężenie chmoatraktanta rośnie, to
prawdopodobieństwo koziołkowania zmniejsza się i komórka porusza się dalej mniej więcej w tym
samym kierunku. Jeśli stężenie w otoczeniu zmniejsza się, wówczas częstotliwość koziołkowania
wzrasta i bakteria sprawdza inne przypadkowe kierunki.
Chemoatraktanty wiążą się z receptorami błonowymi bakterii. Receptory te są heterodimerami, w
skład których wchodzą białka VIRA i ChvE – produkty genów virA i chvE, tworząc kompleks
aktywujący geny virG.
Heterodimery - związki chemiczne zbudowane z dwóch różnych fragmentów, posiadających
jednak pewne podobieństwo strukturalne. Jest to pojęcie często stosowane w biochemii. Typowym
przykładem heterodimerów są np. dwucukry takie jak maltoza.
Białko virG wiążę się ze specyficznymi miejscami promotorów pozostałych genów rejonu vir,
stymulując ich transkrypcję. Dwa geny operonu virD: virD1 i virD2, odpowiedzialne za wycięcie
fragmentu T, kodują białka VirD1 i VirD2 o aktywności endonukleazy.
Wycięcie rozpoczyna się w specyficznym miejscu prawej sekwencji granicznej, a następnie w
lewym. Do końca 5' wyciętego, jednoniciowego fragmentu T wiążę się kowalencyjne białko VirD2,
chroniąc go w ten sposób przed egzonukleazami. Następnie VirD2 łączy się z jednoniciowym
fragmentem T i chroni go tworząc kompleks nukleoproteinowy. W tej formie fragment T jest
transportowany do komórek roślinnych. Oba białka tworzące kompleks z fragmentem T biorą
udział w jego integracji z genomem roślinnym.
Procedura transformacji polega na:
1) wstawieniu w odpowiednie miejsce wektora właściwego fragmentu DNA,
2) wprowadzeniu wektora do Agrobacterium (tu następuje jego namnożenie),
3) inkubacji bakterii niosących wektor z fragmentem tkanki roślinnej (kokultywacja),
4) po kokultywacji z bakteriami przenoszenie fragmentów tkanki na pożywkę selekcyjno-
regeneracyjną z odpowiednim antybiotykiem,
5) indukcja podziałów komórkowych i przekształcenie uformowanej już i nie proliferowanej tkanki
w bezkształtną masę dzielących się komórek zwanych kalusem,
6) regeneracja roślin z komórek kalusa za pomocą pożywek zawierających hormony roślinne
w selekcyjnie dobranej proporcji co powstaje indukcję pędu,
7) ukorzenianie rośliny w odpowiedniej pożywce,
8) przeniesienie rośliny do ziemii.
Etapy interakcji bakteria – roślina
1. Uszkodzenie rośliny.
2. Rozpoznanie substancji wskazujących na obecność w otoczeniu bakterii uszkodzonych
tkanek roślinnych; uaktywnienie syntezy pozostałych czynników wirulencji.
3. Wytworzenie celulozowych włókien mocujących komórkę bakteryjną do ściany komórki
roślinnej.
4. Wytworzenie kanału (pilusa) umożliwiającego T-DNA pokonanie błony cytoplazmatycznej
komórki roślinne.
5. Rozpoznanie sekwencji granicznych i wycięcie T-DNA z plazmidu binarnego.
6. Opłaszczenie T-DNA co zabezpieczy je przed rozkładem w cytoplazmie roślinnej komórki i
spowoduje przetransportowanie go do jądra komórkowego.
Transformacja
Prowadzi się na dwa sposoby:
•
klasyczny: wprowadzenie do bakterii plazmidu pomocniczego z wbudowanym weń genem
mającym zostać wprowadzonym do rośliny. Następuje integracja plazmidów, a następnie
wycięcie i wprowadzeni do rośliny T-DNA.
•
System binarny.
System binarny
W tym systemie używa się szczepów A. tumefaciens zawierających dwa palzmidy.
Jeden z plazmidów jest plazmidem wektorowym zawierającym nieonkogenny T-DNA, niosący
ulegający ekspresji obcy gen, który ma być wprowadzony, wraz z odpowiednimi genami
selekcyjnymi i reporterowym.
Drugi z plazmidów, plazmid pomocniczy zawiera geny wirulencji, odpowiadające za przenoszenie
nieonkogennego T-DNA.
Większość roślin jednoliściennych (np.: trway, zboża, ryż, kukurydza) nie są podatne na
transformację za pośrednictwem Agrobacterium.
T- DNA integruje z genomem w przypadkowych miejscach.
Metody wprowadzania genów:
1. Kultura in vitro biorcy, wybierając dobrze regenerujące eksplantaty.
2. Bez kultury in vitro.
Ad. 1. Etapy procesu:
1. Inokulacja, zwana też kokulturą, polega na umieszczeniu eksplantatów w roztworze bakterii
2. wstępne pozbycie się nadmiaru bakterii przez wypłukanie eksplantatów w wodzie lub
pożywce i osuszenie na bibule filtracyjnej
3. umieszczenie eksplantatów w wodzie lub pożywce stymulującej regenerację pędów,
zawierającej jednocześnie antybiotyki, w celu eliminacji bakterii
4. umieszczenie eksplantatów na podłożu z odpowiednim czynnikiem selekcyjnym
5. regeneracja roślin
Często eksplantaty po okresie kokultury przenosi się na pożywkę zawierającą zarówno antybiotyk,
jak i czynnik selekcyjny. Ma to na celu skrócenie procedury zakażania i tranformacji.
Ad. 2. Etapy procesu:
Wprowadzamy inokulum do tych części rośliny w których odbywają się podziały mejotyczne lub
mitotyczne lub moczy się nasiona w hodowli bakterii. Stosowany dla A. thaliana.
1. Rośliny rosnące w doniczkach w początkowej fazie generatywnej umieszcza się w naczyniu
zwierającym pożywkę z kulturą bakteryjną tak aby zanurzone były tylko pędy
kwiatostanowe. Czynność tę przeprowadza się w eksykatorze podłączonym do pompy, pod
odpowiednim ciśnieniem.
2. Następnie zbiera się nasiona z roślin poddanych infltracji.
3. Wysiew nasion w sterylnych warunkach na odpowiednie podłoża selekcyjne.
Przy optymalnych parametrach można uzyskać w ten sposób do 95% roślin, które zawierają 0,5-4%
transgenicznych nasion.
Wady transformacji za pomocą
Agrobacterium tumefaciens:
Ograniczona do roślin dwuliściennych i nielicznych jednoliściennych z rzędu Liliales i Arales. Nie
ma wśród nich większości gatunków o zastosowaniu rolniczym, co było głównym powodem
intensywnych badań nad zwiększeniem liczby gatunków ulegających infekcji przez A. tumefaciens.
Odpowiednio dobrane warunki kokultywacji bakterii z tkanką wybranej rośliny wystarczyły do
zainfekowania m.in. mięty. Pozytywny efekt przyniosły także próby zastosowania infiltracji
próżniowej – bakterie były zasysane przez podciśnienie do przestrzeni międzykomórkowej oraz
podawanie acetosyringonu, związku fenolowego będącego induktorem genów wirulencji.
Najbardziej oporne na infekcję gatunki, np. jęczmień, słonecznik czy soję, poddawano sonikacji za
pomocą ultradźwięków oraz traktowano hiperwirulentnymi szczepami Agrobacterium (np. ALG1).
Dodatkowym ograniczeniem tej metody była niemożność transferu fragmentów DNA dłuższych niż
30 kbp, co skutecznie uniemożliwiało wprowadzanie dużych genów, całych szlaków
metabolicznych oraz tworzenie roślinnych bibliotek DNA. Problem ten został rozwiązany wraz ze
stworzeniem wektora BIBAC (binary bacterial artificial chromosome), który łączy cechy wektora
binarnego i sztucznego chromosomu bakteryjnego, pozwalając na transfer DNA o długości do 150
kbp.
PRACE BADAWCZE
Agrobacterium tumefaciens
1. Ochrona przed patogennem A. Tumefaciens
Guzowatość korzeni wywoływana przez bakterię Agrobacterium tumefaciens jest wciąż bardzo
groźną chorobą. W Polsce największe szkody wyrządza w uprawach szkółkarskich drzew
owocowych i róż. Celem badań było przebadanie skuteczności szczepu K84 A. radiobacter w
ochronie przed A. tumefaciens na kilku podkładkach drzew owocowych oraz wpływu czterech
najczęściej stosowanych w sadach herbicydów na wzrost obu gatunków bakterii w warunkach
in vitro. Jak wynika z przeprowadzonych badań tylko korzenie podkładki M-26 były całkowicie
chronione przed guzowatością korzeni przez ich zaprawianie w zawiesinie A. radiobacter K84.
Podkładka ta była jednak również w najmniejszym stopniu porażona przy braku zaprawiania
(kontrola), co sugeruje o jej pewnej odporności na A. tumefaciens. Potwierdzają to wyniki
naszych obserwacji nad podatnością kilku podkładek i odmian jabłoni na ich porażenie tym
patogenem. Zaprawianie korzeni zawiesiną A. radiobacter K84 siewek czereśni ptasiej, gruszy
kaukaskiej i ałyczy, spowodowało zmniejszenie porażenia roślin przez A. tumefaciens o 78–
98%, zależnie od traktowanego gatunku. Z przeprowadzonych doświadczeń wynika ponadto, że
po zastosowaniu bakterii A. radiobacter K84, jeśli nawet guzy wystąpiły to były zawsze
znacznie mniejsze i znajdowały się na korzeniach bocznych. U roślin nie zaprawianych guzy
były znacznie większe i rozwijały się głównie na szyjce korzeniowej i na korzeniach głównych,
a zatem w miejscach najbardziej szkodliwych dla roślin. Na roślinach o silnym porażeniu szyjki
korzeniowej i korzeni głównych obserwowano dość znaczne ograniczenie wzrostu roślin
względem kontroli, a w nielicznych przypadkach porażone rośliny zamierały.
2. Otrzymywanie roślin transgenicznych z podwyższoną zawartością taumatyny.
Taumatyna – słodkie białko obecne wyłącznie w owocach rośliny Thaumatococcus daniellii,
odkrytej przez brytyjskiego lekarza wojskowego W. F. Daniella w 1840 roku w Afryce
Zachodniej. W 1972 roku białko to zostało wyizolowane z owoców T. daniellii. Rośliny T.
daniellii uprawiane poza strefą tropikalną zawiązują owoce partenokarpiczne, ale nie posiadają
one smaku słodkiego. W styczniu 1998 r. wyrażono zgodę na wprowadzenie taumatyny do
obrotu w Polsce i stosowanie w produkcji niektórych wyrobów spożywczych (po uzyskaniu
zgody Głównego Inspektora Sanitarnego). Taumatyna w spisie substancji dodawanych do
żywności figuruje pod znakiem E 957.
Taumatyna, ze względu na naturalne pochodzenie, jest unikatowa spośród stosowanych w
przemyśle spożywczym substancji intensywnie słodzących. Znajduje się na liście GRAS
(Generally Recognized As Safe) aktualizowanej corocznie przez FDA (Food and Drug
Administration) w Stanach Zjednoczonych pod nr 3732 i uważana jest jako substancja
bezpieczna dla zdrowia, nie wymagająca limitowania. Taumatyna jest od dawna stosowana w
Japonii w charakterze środka słodzącego. Używano jej na przykład do złagodzenia kwaśnego
smaku wina palmowego i napojów owocowych. Taumatyna jest jedynym białkiem jakie znajduje
się w sprzedaży jako środek słodzący. Stosuje się ją do podnoszenia walorów smakowych
różnych produktów spożywczych a także do maskowania goryczy oraz potęgowania niektórych
smaków, na przykład mięty. Taumatyna jest dopuszczona do spożycia w wielu krajach Europy
oraz w USA, Kanadzie, na Tajwanie, Japonii, Nowej Zelandii, Wietnamie, Australii i innych. Dla
celów przemysłu spożywczego taumatyna produkowane jest przez bakterie zmodyfikowane
genetycznie jak również wykorzystywany jest ekstrakt z owoców T. daniellii. Z jednego owocu
można otrzymać do 12 mg taumatyny. Smak słodki taumatyny jest o wiele intensywniejszy niż
stosowanych dotychczas w przemyśle spożywczym substancji słodzących, po spożyciu długo
pozostaje. Smak słodki taumatyny pojawia się z niewielkim opóźnieniem (ok. 15 sekund) i
zanika powoli (ok. 30 min). W stężeniu niższym niż 10-8M obniża próg rozpoznania innych
słodkich substancji. Taumatyna w roślinach transgenicznych. Przeprowadzono kilka
doświadczeń nad transformacją roślin wyższych genem taumatyny. W Katedrze Genetyki,
Hodowli i Biotechnologii Roślin SGGW transformowano rośliny Cucumis sativus L. odmiany
Borszczagowski genem taumatyny II. W wyniku transformacji ogórka genem taumatyny II
uzyskano 11 linii. Zostały one poddane analizie molekularnej, w celu potwierdzenia obecności
transgenu w genomach tych linii oraz występowanie ekspresji na poziomie RNA i białka.
Badano kolejne pokolenia uzyskanych linii i stwierdzono występowania różnic w poziomach
akumulacji mRNA taumatyny i transgenicznego białka pomiędzy liniami i w obrębie pokolenia
T2. Niektóre linie wykazały podwyższoną odporność na Pseudoperonospora cubensis.
Stosowana do produkcji i polepszania walorów smakowych takich produktów jak: tabletki
słodzące – „słodziki”, napoje typu coca cola, lody, suszone owoce, jogurty i desery, napoje
niegazowane, soki, napoje energetyzujące, suplementy diety typu „witaminy”, alkohol, napoje
alkoholowe (wina), sery, dżemy, marmolady, produkty niskotłuszczowe, farmaceutyki itd.
3. Transformacja Arabidopsis thaliana z udziałem Agrobacterium tumefaciens niosący geny
mirozynazy TGG1 lub TGG2
Mirozynazy są enzymami odpowiedzialnymi za hydrolizę glukozynolanów wtórnych występu-
jąch powszechnie u roślin z rodziny Brassicaceae. Tworzenie aktywnych biologicznie produktów
hydrolizy tych związków jest odpowiedzią rośliny na biotyczne czynniki stresowe. Przypuszcza
się również, że glukozynolany mogą stanowić dla roślin źródło S, C i N, a także być zapasową
pulą auksyn. Celem pracy było przygotowanie wektorów binarnych zawierających geny kodują-
ce mirozynazę u rzodkiewnika (TGG1 lub TGG2), wprowadzenie ich do genomu tej rośliny oraz
uzyskanie i wyselekcjonowanie transgenicznych roślin ze zmienioną aktywnością enzymu.
Transformacja rzodkiewnika i selekcja nasion: Rośliny w początkowym stadium kwitnienia
transformowano metodą infiltracji próżniowej. Nasiona zebrane z roślin transformowanych (T
0
)
poddano selekcji na pożywce MS. z kanamycyną (50 mg·dm
-3
). Po 2-3 tygodniach, siewki opor-
ne na antybiotyk przenoszono do doniczek z podłożem. Rośliny T1 w stadium kwitnienia były
osłaniane izolatorami. Z każdego osobnika zbierano nasiona. W analogicznych warunkach rosły
rośliny typu dzikiego (WT). W liściach roślin T1 przed przejściem do fazy generatywnej ozna-
czano obecność genu NPTII i produktu jego ekspresji, a także aktywność mirozynazy. Przy
udziale A. tumefaciens do genomu rzodkiewnika wprowadzano genomowe kopie jednego z czte-
rech funkcjonalnych genów kodujących mirozynazy (TGG1 lub TGG2) u tego gatunku. Po 5-7
tygodniach od infiltracji rośliny rzodkiewnika wydały nasiona, które poddano selekcji w obecno-
ści kanamycyny. Do potwierdzenia procesu transformacji i efektów wprowadzenia dodatkowych
kopii genów mirozynaz do genomu rzodkiewnika, z puli siewek opornych na zastosowany anty-
biotyk (pokolenie T1) wybrano 26 siewek. Połowa (13 osobników) była pochodną pokolenia,
które transformowano wektorem pTGG1, druga połowa (13 osobników) wyprowadzona została
z roślin transformowanych wektorem pTGG2. Spośród roślin pokolenia T1 uzyskanych po trans-
formacji wektorem pTGG1 tylko u jednej zawartość białka NPTII kształtowała się na poziomie
kontroli. U tej rośliny nie stwierdzono również obecności genu NPTII. U pozostałych roślin za-
wartość białka NPTII była zróżnicowana, lecz wyższa w porównaniu z roślinami WT. Analizą
PCR potwierdzono u nich obecność genu NPTII. U przypuszczalnych transformantów uzyska-
nych po transformacji wektorem pTGG2 zawartość białka NPTII, wyższą w porównaniu z rośli-
nami typu dzikiego oraz obecność genu NPTII stwierdzono u 10 osobników. W przypadku trans-
formanta nr 11 zamplifikowano gen NPTII, natomiast nie wykryto produktu jego ekspresji.
Wśród 11 transformantów uzyskanych po transformacji wektorem pTGG2, u sześciu osobników
(55%) aktywność enzymu była istotnie obniżona. Istotnie wyższą aktywnością mirozynazy cha-
rakteryzowały się dwie (18%) wyselekcjonowane rośliny. Wzrost ten nie był tak znaczny, jak u
roślin po transformacji wektorem zawierającym sekwencję genu TGG1. W ekstraktach pocho-
dzących z 27% roślin nie stwierdzono aktywności mirozynazy. Zarówno w fazie wegetatywnej
jak i generatywnej nie obserwowano różnic fenotypowych pomiędzy roślinami typu dzikiego, a
roślinami stransformowanymi. Wszystkie rośliny zakwitały w tym samym czasie i wydały nasio-
na. Wprowadzenie do genomu rzodkiewnika przy udziale A. tumefaciens dodatkowej kopii jed-
nego z genów mirozynaz, TGG1 lub TGG2, pod kontrolę konstytutywnego promotora P-e35S
spowodowało zmianę aktywności enzymu in planta. Na podstawie analizy 23 niezależnych
transformantów, u których stwierdzono obecnośćæ transgenu NPTII i/lub produktu jego ekspre-
sji wykazano, że wśród nich, 10 roślin (43%) charakteryzowao się istotnie wyższą, a 8 (35%)
istotnie niższą aktywnością mirozynazy w stosunku do rooelin typu dzikiego. U trzech transfor-
mantów (13%) nie stwierdzono aktywności enzymu. Otrzymano także 2 rośliny (9%) nieróżnią-
ce się istotnie aktywnością w porównaniu z roślinami WT. Mirozynaza naturalnie znajduje się w
komórkach mirozynazowych, które są rozproszone w korzeniu, łodydze, liściach, ogonkach li-
ściowych i w siewkach. W badaniach wykazano, że enzym i substraty rozdzielone są przestrzen-
nie nie tylko na poziomie subkomórkowym. Taka lokalizacja zabezpiecza rośliny przed tworze-
niem in planta toksycznych produktów hydrolizy glukozynolanów takich jak tiocyjaniany, izotio-
cyjaniany czy nitryle. Ektopowa ekspresja genów mirozynazy mogła znieść przestrzenną izolację
składników układu obronnego roślin. Zagrożenie tworzeniem się szkodliwych produktów rozkła-
du prawdopodobnie nie występowało u transgenicznych roślin z obniżoną aktywnością mirozy-
nazy, ponieważ zmiana ekspresji kodujących je genów spowodowała obniżenie ilości enzymu.
Natomiast toksyczne związki mogły się tworzyć w komórkach roślin z podwyższoną aktywno-
ścią enzymu. Nie wiadomo, w jaki sposób w roślinie zachodzi detoksykacja produktów rozkładu
glukozynolanów. Przypuszcza się, że uczestniczą w tym nitrylazy i metylotransferazy katalizują-
ce in vivo odpowiednio nitryle i tiocyjaniany. Wprowadzenie do genomu rzodkiewnika dodatko-
wych kopii genu TGG1 i TGG2 spowodowało zmiany aktywności mirozynazy in planta. Takie
rośliny mogą zostać wykorzystane w dalszych badaniach wyjaśniających rolę glukozynolanów w
odporności na czynniki chorobotwórcze oraz znaczenia układu mirozynaza-glukozynolany we
wzroście i rozwoju.
4. Transgeniczna papaja odporna na wirusa pierścieniowej plamistości papai (PRSV).
Bije rekordy popularności w USA. Na Hawajach gdzie jest podstawową rośliną uprawną
transgeniczne odmiany tej rośliny to aż 80% wszystkich upraw.
5. Otrzymanie transgenicznego kabaczka odpornego na wszystkie choroby wirusowe.
Nie jest to aż tak ważna roślina uprawna nadal jednak stanowi istotne znaczenie dla przemysłu i
dalszego rozwoju gospodarczego. Uzyskanie takiej rośliny wciąż zachęca kolejnych badaczy do
ciągłego doskonalenia innych roślin, które okazałyby się „super roślinami” odpornymi na
jakiekolwiek choroby.
6. Polepszenie innych właściwości użytkowych roślin.
Modyfikacja procesów fizjologicznych związanych z dojrzewaniem owoców może przedłużyć
ich trwałość oraz ułatwić składowanie. Zmodyfikowanie genetyczne pomidora poprzez
wprowadzenie genu kodującego PG (poligalakuronazę), enzymu odpowiedzialnego za rozkład
pektyn w ścianach komórkowych (pośrednio odpowiedzialnego za mięknięcie owoców) w
pozycji antysensownej spowodowało jego inaktywację i przedłużyło znacznie trwałość
pomidora. W transgenicznych pomidorach po transkrypcji powstało sensowne i antysensowne
mRNA, które jako komplementarne hybrydyzowało ze sobą, uniemożliwiając syntezę białka.
7. Genetycznie zmodyfi kowane ziemniaki odporne na wirusa Y i wirusa liściozwoju (PLRV),
śliwy odporne na wirusa ospowatości śliw (PPV, szarka),oraz dynie odporne na wirusa
drobnej plamistości cukinii (ZYMV) i wirusa mozaiki kawona (WMV) jednocześnie.
8. Żółte truskawki
Na półki brytyjskich supermarketów trafiły właśnie nowe, nieco dziwne owoce – żółtawe tru-
skawki o smaku ananasów! Te zaskakujące twory to dzieło holenderskich farmerów, którzy sie-
dem lat temu zaczęli uprawiać na swoich polach zagrożony wyginięciem gatunek z Ameryki
Południowej. Nowopowstały owoc został ochrzczony nazwą „pineberry” i można go kupić w
każdym z 45 sklepów sieci Waitrose. Niestety są dużo droższe od tradycyjnych truskawek –
mały 125-gramowy koszyczek (zawierający zaledwie kilkanaście sztuk) kosztuje aż 4 funty,
czyli około 20 złotych! Przedstawiciele sklepów zachwalają jednak swój towar: "Białe truskaw-
ki pozwolą naszym klientom dodać nowy owoc do ich diety, a ich niespotykany wygląd może
być ciekawym dodatkiem do wiosennych deserów”.
9. WITAMINA A i Fe
Prace nad żywnością GMO były prowadzone przez japońskich naukowców oraz w ramach mię-
dzynarodowego programu naukowego finansowanego przez Unię Europejską pod nazwą „Caro-
tene plus” . Zgodnie z danymi WHO około 140250 milionów dzieci na całym świecie cierpi z
powodu braku witaminy A. Dostarczenie tylko tego jednego składnika mogłoby zmniejszyć
śmiertelność wśród dzieci o ok. 25%. Niedobór żelaza w organizmie to kolejna przyczyna pro-
blemów zdrowotnych w ponad 118 krajach świata. Jednocześnie ok. 30% ludności Azji cierpi
na brak żelaza. W tych krajach, gdzie występuje niedobór witaminy A i żelaza podstawowym
składnikiem wyżywienia jest ryż. Dotyczy to prawie 2 miliardów ludzi.
Ryż nie zawiera łatwo bioprzyswajalnego żelaza ani witaminy A. Postanowiono przenieść geny
odpowiedzialne za syntezę prowitaminy A oraz związków zdolnych do wiązania żelaza z takich
organizmów, w których te procesy zachodzą samoistnie. W przypadku żelaza dokonano tego w
sposób następujący: białko o nazwie ferrytyna, które występuje we wszystkich organizmach (ale
w minimalnych ilościach w ryżu), jest odpowiedzialne za gospodarkę żelazem.
Białko to zdolne jest do związania nawet do 6000 tysięcy atomów żelaza dwuwartościowego (a
zatem tego aktywnego biologicznie, uczestniczącego w procesie przenoszenia tlenu) w jednej
cząsteczce białka. Gen ferrytyny został wyizolowany przez japońskich naukowców z liści soi.
Za pomocą Agrobacterium tumefaciens gen ten został wprowadzony do genomu ryżu. Bakterie
Agrobacterium tumefaciens charakteryzuje zdolność kolonizacji systemu genetycznego roślin.
Transformowane rośliny zawierały od jednej do kilku kopii genu ferrytyny. Cecha ta była stabil-
na (czyli przekazywana na kolejne generacje ryżu), jak również ulegała ekspresji, a zatem
biosyntetyzowane było białko – ferrytyna, odpowiedzialne za przyswajanie żelaza. Cechy te po-
twierdzono poprzez immunodetekcję (czyli wykrywanie produktu ekspresji przez przeciwciała)
na żelu poliakryloamidowym, w którym dokonywano rozdziału i wydzielenia produktów bio-
syntezy białka. Wykryto w ten sposób, że najwyższe stężenie ferrytyny jest w bielmie nasion. W
doświadczeniach polowych stwierdzono, że nasiona transgenicznego ryżu zawierają co najmniej
trzykrotnie wyższy poziom żelaza, aniżeli „ klasyczne” . Badania prowadzone były przez grupę
prof. Goto. Witamina A Grupa europejskich uczonych pod kierunkiem profesorów Petera Bey-
era (z Uniwersytetu we Freiburgu, Niemcy) i Ingo Potrykusa
(z Wyższej Szkoły Technicznej w Zurychu) we współpracy z międzynarodowym zespołem
(Włochy, Francja, Anglia, Hiszpanii i Holandii) w ramach programu badawczego „Carotene
plus” podjęła prace nad przeniesieniem trzech genów odpowiedzialnych za biosyntezę prowita-
miny A (czyli betakarotenu) z żonkila (dwóch) oraz jednego z bakterii. Badania były finansowa-
ne przez Komisję Europejską w ramach programu badawczego FAIR w latach 19941998. Beta-
karoten jest w organizmie ludzkim przekształcany w witaminę A. Enzymy niezbędne do biosyn-
tezy prowitaminy były dobrane w ten sposób, aby ich wbudowanie do genomu było proste, a
jednocześnie gwarantowało sukces, czyli biosyntezę właściwego związku.
10. Podniesienie zawartości odżywczych i smakowych roślin.
Wprowadzenie genów kodujących określone białka może wyeliminować niektóre choroby
związane z niedoborem mikroelementów lub witamin. Stworzono np. transgeniczny ryż (wyko-
rzystując geny żonkila), który wykazuje zwiększoną produkcję beta-karotenu, prekursora wita-
miny A, co powoduje żółte zabarwienie nasion. Trwają prace nad uzyskaniem ryżu o 2 - 4 krot-
nie zwiększonym stężeniu żelaza (dzięki genom kodującym białka odpowiedzialne za wiąznie
tego pierwiastka). Dzięki modyfikacji genetycznej można ponadto uzyskać żywność o lepszych
walorach smakowych czy zapachowych np. kawę o obniżonej zawartości kofeiny i lepszym aro-
macie.
Agrobacterium rhizogenes
Oprócz A. tumefaciens w glebie znajduje się również inny rodzaj gram ujemnych, wolno żyjących,
fitopatogenicznych bakterii, które atakują rośliny, wnikając do nich przez zranione tkanki. -
A.
rhizogenes. Są to pałeczki, które nie wiążą azotu atmosferycznego, wykazujące zdolność ruchu
dzięki posiadaniu od 1 do 4 rzęsek. Optimum wzrostu osiągają w temp. wynoszącej 26°C. Bakterie
z gatunku A. rhizogenes infekują rośliny dwuliścienne, wywołując w miejscu infekcji powstawanie
korzeni włośnikowych. W wyniku infekcji, fragment plazmidu Ri A. rhizogenes jest przenoszony
do komórek roślinnych i w efekcie następują zmiany w metabolizmie zainfekowanych komórek.
Rozwój procesu chorobowego wywoływanego przez te bakterie może prowadzić także do
zniesienia efektu dominacji wierzchołkowej, skracania międzywęźli, zwiększenia liczby kwiatów,
redukcji produkcji pyłku, a w rezultacie zaburzenia procesu wytwarzania nasion.
Budowa plazmidu:
1. Plazmidem A. rhizogenes jest plazmid Ri, nazywany również megaplazmidem, a jego wielkość
to ok. 200 kpz. Zasadniczym elementem budowy plazmidu Ri jest region wirulencji, obejmujący
operony vir oraz sekwencja T-DNA.
Sekwencja T-DNA obejmuje dwie klasy genów:
•
geny syntezy opin (ops) – pochodne aminokwasów, kodujące syntezę kukumopin,
mannopin, agropin – oraz geny związane z ich sekrecją (ocs).
Opiny są wykorzystywane
jako podstawowe źródło węgla i azotu przez bakterie z rodzaju A. rhizogenes
zasiedlające przestrzenie międzykomórkowe zainfekowanych tkanek roślinnych. Ze
względu na rodzaj produkowanych przez bakterie opin, podzielono je na typy (np.
szczepy produkujące agropinę należą do typu agropinowego).
•
onkogeny
2. W szczepach atropinowych znajdują się dwa fragmenty T: T
L
i T
R
, które mogą być przekazywane
komórkom roślinnym niezależnie, w dwóch pozostałych rodzajach szczepów występuje jeden
fragment T, który wykazuje wysoką homologię do T
L
szczepów agropinowych.
•
We fragmencie T
R
szczepów agropinowych zidentyfikowano sześć onkogenów, w tym dwa
geny: aux1 i aux2. Jeżeli tylko ten odcinek zostanie zintegrowany z genomem roślinnym,
objawy chorobowe są bardzo słabe i występują wyłącznie w częściach apikalnych, w
których syntetyzowane są auksyny.
•
We fragmencie T
L
szczepów agropinowych i T dwóch pozostałych zlokalizowane są geny
rol, a rola poszczególnych z nich nie jest do końca poznana. Jest wiele hipotez
przedstawiających rzekomą rolę owych genów, a niektóre z nich to m.in: rolA (bierze udział
w metabolizmie giberelin), rolB (który w przypadku transformacji tytoniu,
jak się okazuje,
jest czynnikiem istotnym w inicjacji tworzenia korzeni, poprzez zwiększenie stężenia
auksyny IAA
), rolC (
właśiwości cytokinino-zależnych, wykazuje działanie podobne do
auksyn. Oprócz regeneracji pędów i zmniejszonej dominacji wierzchołkowej, stymuluje
również intensywny rozrost korzeni, przy czym poziom endogennych auksyn nie ulega
zmianie, mimo zwiększonej ryzogenezy. Gen rolC wpływa prawdopodobnie na metabolizm
endogennych regulatorów wzrostu, bądź uwrażliwia rośliny na ich działanie
) i rolD
(któremu przypisuje się inicjację ryzogenezy). Uważa się, że współdziałanie wszystkich
czterech genów warunkuje pełne symptomy choroby, a ich ekspresja jest niezbędna do
formowania korzeni włośnikowatych.
3. W plazmidzie Ri, poza T-DNA, znajdują się geny kodujące enzymy katabolizmu opin (opc).
Porównanie plazmidów A. rhizogenes i A. tumefaciens
Plazmidy Ri i Ti wykazują znaczne podobieństwo między sobą, które dotyczy przede wszystkim
niemal identycznej organizacji regionu vir. Jedyną różnicą jest brak w plazmidzie Ri (jak i w całym
genomie bakteryjnym) u A. rhizogenes sekwencji kodującej białka virE1 i virE2. W przypadku
niektórych szczepół funkcję wymienionych białek przejmują produkty ekspresji genów GALLS
zlokalizowanych na wirulentnym plazmidzie.
Proces infekcyjny
W procesie transformacji roślin przez bakterie z rodzaju Agrobacterium uczestniczą trzy regiony
DNA, dwa zlokalizowane w plazmidzie: odcinek T-DNA i region wirulencji z genami vir (virA, B,
D, G, które niezbędne są w procesie transformacji oraz operony virC i virE, których ekspresja
znacznie podnosi wydajnooeć tego procesu) oraz trzeci zlokalizowany w chromosomie bakteryjnym
zawierający geny chv, których ekspresja umożliwia absorbcję bakterii na powierzchni rośliny.
Proces patogenezy polega na przeniesieniu więc fragmentu T-DNA z plazmidu bakteryjnego do
jądra komórki roślinnej, a następnie integracji do genomu komórki roślinnej. W efekcie następują
zmiany programu genetycznego zainfekowanej komórki. Cały proces infekcyjny związany jest z
ekspresją genów vir i genów chv.
•
Geny chv warunkują wytwarzanie białek i glikoprotein istotnych w procesie absorbcji
bakterii na powierzchni organów roślinnych.
•
Ekspresja genów vir (w szczególności białka sensorycznego virA) jest indukowana przez
związki fenolowe, wydzielane przez zranioną mechanicznie tkankę roślinną np.
acetosyringon i alfahydroksy-acetosyringon. Ekspresja operonu virD prowadzi do syntezy
enzymu wycinającego fragment T-DNA z plazmidu. Kolejnym składnikiem kaskady
sygnałowej jest białko virG, które po ufosforylowaniu wiąże się z elementami
promotorowymi „vir” i aktywuje transkrypcję genów wirulencji oraz genów
chromosomalnych odpowiedzialnych za adhezję bakterii do infekowanej komórki roślinnej.
Odcinki T-DNA są otoczone sekwencjami granicznymi rozpoznawanymi przez białko
virD2, które podobnie jak endonukleazy, nacina DNA i pozostaje związane kowalencyjnie z
jednym końcem 5' ssT-DNA chroniąc je przed degradacją przez egzonukleazy typu 5' → 3'.
Dodatkowo ssT-DNA opłaszczane jest przez białka virE2 i do jądra komórki roślinnej
przenoszony zostaje kompleks składający się z ssT-DNA i białek: virD2 i virE2. Kanał
umożliwiający przetransportowanie kompleksu przez błonę komórkową i ścianę komórkową
zbudowany jest z białek virB i virD4 Wewnątrz komórki roślinnej kompleks DNA
przenoszony jest poprzez błonę jądrową do jądra komórkowego, gdzie T-DNA ulega
integracji do genomu roślinnego. W ostatnim etapie następuje dobudowanie nici
komplementarnej do ssT-DNA. W efekcie wbudowania T-DNA do genomu roślinnego
następuje ekspresja znajdujących się w obrębie T-DNA genów warunkujących biosyntezę
auksyn i cytokinin – tzw. onkogenów.
Wykorzystanie transformacji A. rhizogenes
Niewątpliwe jest, że transformacja z udziałem A. rhizogenes zyskuje coraz więcej zwolenników, a
korzenie transformowane wykazują wiele cech różniących je od naturalnie występujących korzeni.
Ich fenotyp charakteryzuje się :
•
szybim, niezależnym od fitohormonów wzrostem - zdolność do wzrostu w pożywce nie
zawierającej regulatorów wzrostu oraz wykazano, że w kulturach korzeni
transformowanych można uzyskać znacznie wyższy poziom metabolitów wtórnych -
Znaczna częoeć metabolitów wytwarzanych w korzeniachwłooenikowatych to
niezwykle cenne związki, mające zastosowanie w medycynie. Szczególnie
wartooeciowe są substancje wykorzystywane jako leki przeciwnowotworowe. Należy do
nich np. kamptotecyna,
•
brakiem geotropizmu
•
plagotropizmem - jest cechą korzystną, gdyż przyczynia się do zwiększenia ich
napowietrzenia w płynnej pożywce, a przez to również do szybkiej i wydajnej
akumulacji biomasy korzeni
•
stabilnością genetyczną - wykazano, że stabilne genetycznie kultury korzeni
włośnikowatych można prowadzić nawet przez ponad 8 lat, co więcej rośliny takie
uzyskuje się spontanicznie, bezpośrednio z korzeni, pomijając formowanie kalusa.
•
krótkim czasem podwajania biomasy
•
oraz łatwością utrzymania.
Poza tym do zalet A. rhizogenes zalicza się (oprócz właściwości samych korzeni) łatwość i
prostotę techniki transformacji oraz stosunkowo krótki okres otrzymywania transgenicznych
korzeni. Korzenie włośnikowate mogą syntetyzować więcej niż jeden metabolit, co sprawia, że za
tego rodzaju transformacją przejawiają również względy ekonomiczne. Co więcej – każda wiązka
korzeni pojawiająca się w miejscu infekcji stanowi niezależny transformant, z jednego eksplantatu
można wyprowadzić dużą liczbę niezależnych linii transgenicznych
Wykorzystanie
Agrobacterium rhizogenes z powodzeniem może być wykorzystywana nie tylko do badań nad
biologią korzeni czy interakcji roślina – fitopatogen, ale także do:
•
genetycznych manipulacji roślin do produkcji metabolitów wtórnych, fitoremediacji
•
funkcjonalnej charakterystyki genów i ich promotorów
•
produkcji przeciwciał czy zrekombinowanych białek, stanowiących nośnik plazmidów
binarnych z sekwencją pożądanych transgenów.
Transformacja w warunkach in vitro i czynniki wpływające na jej efektywność
Na powodzenie prowadzonego w laboratorium za pomocą A. rhizogenes procesu transformacji i jej
efektywność składa się wiele czynników, m.in.:
•
genotyp A. rhizogenes (poziomu wirulencji),
•
interakcji zachodzącej pomiędzy komórkami bakteryjnymi a roślinnymi,
•
gęstości inokulum,
•
genotypu transformowanej rośliny,
•
typu i sposobu przygotowania eksplantatów oraz jego zdolności do regeneracji po
transformacji
Bardzo istotne znaczenie ma zastosowanie odpowiedniego szczepu A. rhizogenes, ze względu na
fakt, że określone szczepy bakterii wykazują specyficzność w stosunku do określonych gatunków
rośin. Tak na przykład Boulton i in. wykazali, że szczepy agropinowe i mannopinowe A. rhizogenes
wywołują infekcję kukurydzy, a z kolei szczepy kukumopinowe nie są wirulentne w stosunku do tej
rośliny.
W przypadku transformacji tkanek roślinnych bakteriami z gatunku A. rhizogenes, często
nieodzownym warunkiem powodzenia transformacji jest dodatek do pożywki stosowanej do
wzrostu bakterii, związków fenolowych, które odgrywają rolę w procesach chemotaksji i indukcji
wirulencji A. rhizogenes. W naturalnych warunkach obecność związków fenolowych, wydzielanych
przez zranioną tkankę roślinną, wpływa na aktywację plazmidowych genów vir, których ekspresja
jest niezbędna w procesie transformacji – najbardziej efektywnym jest acetosyringon, który dodany
do pożywki, na którym rosły kultury owych bakterii, podwyższał ponad 5-krotnie efektywność
transformacji Alhagi pseudoalhagi. Kolejnymi ważnymi induktorami transformacji są takie
monocukry jak: glukoza, galaktoza, arabinoza, fukoza i ksyloza. Cukry działają nie tylko jako
czynniki chemotaktyczne, ale również jako induktory wirulencji.
Istotny jest także dobór materiału do transformacji, konkretna tkanka lub organ rośiny i jej stadium
rozwojowe. Eksplantaty stosowane do transformacji mogą być różne: liście, młode siewki lub ich
fragmenty, pędy, fragmenty korzeni, protoplasty. Zazwyczaj najbardziej wydajne jest
transformowanie młodych tkanek, np. infekowanie liści z młodych pięciotygodniowych roślin. W
nielicznych przypadkach tylko określony fragment rośliny stanowi dobry materiał do transformacji.
Przykładem jest A. majus, w którym jedynie transformacja pierwszego węzła łodygi pozwala na
uzyskanie kultur korzeni włośnikowatych. Wiąże się to najprawdopodobniej z faktem, że ta część
rośliny ma najwyższą zdolność do regeneracji. Rośliny jednoliściecienne (trawy, zboża, rośliny
cebulowe) są ogólnie uznawane za słabo podatne na transformację przy użyciu Agrobacterium.
Nawet w przypadku udanego transferu genów T-DNA z A. rhizogenes nie następuje rozrost korzeni
włośnikowatych. Trudności w transformacji wynikają z braku produkcji substancji
chemotaktycznych pobudzających bakterie, bądź z zakłóceń w samym procesie transferu T-DNA.
Potwierdzenie procesu transformacji
Oprócz obserwowanych efektów fenotypowych w postaci szybko rosnących korzeni
włośnikowatych, istotne jest potwierdzenie procesu transformacji na poziomie molekularnym. W
celu potwierdzenia transformacji tkanki roślinnej przez bakterie z gatunku A. rhizogenes stosuje się
reakcję PCR ze starterami komplementarnymi do sekwencji DNA genów rolB i rolC
zlokalizowanych w regionie TL-DNA plazmidu Ri A. rhizogenes. Przeprowadzenie testów PCR z
zastosowaniem wymienionych starterów oraz DNA izolowanego z korzeni włośnikowatych jako
matrycy, pozwala na wykazanie obecności sekwencji komplementarnych do genów rolB i rolC A.
rhizogenes w transformowanych tkankach roślinnych
Podsumowanie
A. rhizogenes jest cennym narzędziem w biotechnologii roślin. Technika transformacji za
pośrednictwem owych bakterii wykorzystywanie jest zarówno do badań podstawowych jak i
aplikacyjnych. Korzenie transformowane wykorzystywane są w genomice funkcjonalnej oraz
opracowywaniu nowych technologii na potrzeby fitoremediacji oraz produkcji metabolitów
wtórnych i rekombinowanych białek o właściwościach biofarmaceutyków, enzymów
diagnostycznych i przemysłowych.
Surowiec - produkt
Efekt doskonalenia
Truskawki
•
wyższa słodkość owoców,
•
spowolnienie dojrzewania przez kontrolę poziomu etylenu
•
odporność na mróz.
Winogrona
•
odmiany bezpestkowe
Pomidory
•
polepszony kolor, smak i zapach
•
odporność na zakażenia wirusowe
•
przedłużony okres dojrzewania i mięknięcia
Pszenica
•
odporność na hrbicydy
Słonecznik
•
zmniejszona zawartość tłuszczy nasyconych
Jabłka
•
odporność na choroby wirusowe
Soja
•
odporność na środki ochrony roślin – hrebicydy
•
odporność na wirusy, herbicydy, szkodniki
•
obniżona zawartość kwasu palmitynowego.
Ryż
•
zwiększona produkcja beta-karotenu, prekursora witaminy A - wszczepione zo-
stał geny pochodzące z żonkila, modyfikacja w zamierzeniu miała rozwiązać
problem braku witaminy A u dzieci w Azji Wschodniej.
Sałata
•
produkująca szczepionkę na zapalenie wątroby typu B - można się szczepić je-
dząc sałatę - została ona opracowana przez naukowców z Instytutu Chemii
Bioorganicznej PAN w Poznaniu pod kierownictwem prof. Legockiego.
Ziemniaki
•
wzrost zawartości skrobi, ponadto odmiany składające się wyłącznie z amylo-
pektyny - u odmian tradycyjnych 20% skrobi to amyloza, którą usuwa się z
ziemniaków przemysłowych co podnosi koszty,
•
odporność na herbicydy, stonkę ziemniaczaną, wirusy,
•
"słodkie ziemniaki" - wprowadzenie genu odpowiedzialnego za wytwarzanie
słodkiego białka - taumatyny,
•
odporność na ciemnienie pouderzeniowe - większa trwałość,
•
mała zawartość glikoalkaloidów - substancji szkodliwych na człowieka, wystę-
pujących w surowych ziemniakach.
Kukurydza
•
odporność na owady - wszczepiony został gen odpowiedzialny za wytwarzanie
białka, które zjadane przez owada niszczy jego przewód pokarmowy co dopro-
wadza do śmierci. Białko to "działa" tylko w organizmach niektórych, ściśle
określonych gatunków owadów-szkodników, nie jest aktywne np. u człowieka.
•
wytwarzanie substancji używanych do wyrobu leków lub szczepionek,
Piśmiennictwo:
1. Dados M., Metody in vitro wprowadzania biomolekuł do komórek. Praca inżynierska
wykonana na kierunku Technologia Żywności i Żywienie Człowieka 2010; 18-20.
2. Hnatuszko-Kona K., Łuchniak P., Wiktorek-Smagur A., Gerszberg A., Kowalczyk T.,
Kononowicz A.K., Transformacja roślin za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes, 2009,
Postępy biologii komórki, 25, 189-200.
3. Kiliańczyk-Szwałowska b., Technologia uzyskiwania roślin transgenicznych niezdolnych do
rozmnażania; Praca magisterska wykonano w Pracowni Biologii Molekularnej Roślin
Uniwersytetu Warszawskiego pod kierunkiem prof. dr hab. Andrzeja Jerzmanowskieg 2000.
4. Kućmierz J, Kozik R., Z BADAŃ NAD GUZOWATOŚCIĄ KORZENI
(AGROBACTERIUM TUMEFACIENS) DRZEW OWOCOWYCH. Progress in Plant
Protection / Postępy w Ochronie Roślin, 2007; 47(4): 1-5.
5. Malepszy S., Biotechnologia roślin; Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2004.
6. Wasilewska A, Królicka A., Otrzymywanie i charakterystyka kultur korzeni
włośnikowatych. Prace przeglądowe biotechnologia 2005; 4: 173-178.
7. Troczyńska J, Drozdowska L., transformacja Arabidopsis thaliana z udziałem
Agrobacterium tumefaciens niosący gen mirozynazy TGG1 lub TGG2, Prace
eksperymentalne biotechnologia 2007: 4 (79) ;170-179.
8.
http://www.samartex.com.gh/AgroForestry/NTFP---Thaumatin.aspx
9.
http://www.biotechnolog.pl/news-389.htm
10. Artykuły naukowe ze strony:
www.biotechnolog.pl
11.
http://www.papilot.pl/kuchnia-nowosci/8263/Powstaly-nowe-owoce-ANANASOWE-
TRUSKAWKI/2.html
12.
http://www.wbp.olsztyn.pl/~krist/skrypt/index.php?co=5_2