Temat 6: Metody posiewu i hodowli drobnoustrojów (1)
Literatura:
Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN
1984, str. 50-58 (Pożywki mikrobiologiczne), 86-92 (Wyosabnianie czystych kultur
drobnoustrojów), 101-103 (Hodowla kłuta, stosunek do tlenu), 135-141 (Metody hodowli
drobnoustrojów).
Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:
znać podstawowe wymagania pokarmowe mikroorganizmów auto- i heterotroficznych;
wiedzieć, w jakim celu wykonuje się poszczególne typy posiewu; znać kryteria podziału
pożywek z podaniem przykładów i krótką charakterystyką; wiedzieć, czym jest agar, agar
odżywczy, bulion i żelatyna; umieć scharakteryzować mikroorganizmy pod względem ich
wymagań wobec temperatury, odczynu, natlenienia i ciśnienia osmotycznego; znać metody
hodowli w warunkach beztlenowych; umieć scharakteryzować podstawowe typy hodowli, w
tym fazy hodowli statycznej; rozumieć różnicę między hodowlą statyczną a ciągłą;
rozumieć pojęcia: posiew, inokulum, szczep, izolacja szczepu, czystość w sensie
mikrobiologicznym, kolonia, inkubacja, autotrofy, heterotrofy, prototrofy, auksotrofy,
mikroorganizmy psychrofilne, mezofile, termofilne, tlenowce, beztlenowce, względne
beztlenowce, mikroaerofile, czas generacji, wzrost logarytmiczny, chemostat, jednostka
tworząca kolonię (jtk, cfu);
umieć wykonać podstawowe typy posiewu, w tym wyizolować czysty szczep; umieć
wykonać ciąg rozcieńczeń.
Dzięki hodowli można w warunkach laboratoryjnych (in vitro) namnażać drobnoustroje
żyjące w środowisku naturalnym. Aby założyć hodowlę drobnoustrojów należy wprowadzić
je do sterylnej pożywki, czyli posiać. Posiewane mikroorganizmy określa się mianem
inokulum lub zaszczepu. Nie zawsze znamy skład drobnoustrojów tworzących zaszczep, np.
kiedy posiewamy próbę środowiskową, w której zwykle znajduje się wiele różnorodnych
bakterii i grzybów (woda, ścieki, gleba itp.). Posiane drobnoustroje inkubuje się, czyli
przetrzymuje w pożywce określony czas (czas inkubacji), w określonej temperaturze
(temperatura inkubacji). Podczas inkubacji posiane komórki rosną i dzielą się. Trzeba jednak
wspomnieć, że są drobnoustroje, które nie rosną na żadnych pożywkach i nie można ich
hodować, np. krętek blady, wywołujący kiłę lub prątek trądu.
Różne mogą być cele posiewu, a więc i założonej hodowli:
wyizolowanie określonych drobnoustrojów z prób środowiskowych (wody, gleby), w
tym uzyskanie czystych szczepów, czyli zbiorów komórek pochodzących z jednej
komórki macierzystej, z zamiarem ich dalszych badań (m.in. identyfikacji),
namnożenie komórek już wyizolowanego i zidentyfikowanego szczepu, np. w celu
pozyskania pewnych produktów jego metabolizmu, lub zbadania jego zdolności do
rozkładu określonych zanieczyszczeń,
policzenie komórek wchodzących w skład posiewanej próby.
Pożywka, w której prowadzi się hodowlę określonych drobnoustrojów musi zaspokajać
ich wymagania odżywcze. Poza tym hodowla powinna być prowadzona w optymalnych dla
wzrostu warunkach środowiskowych, takich jak temperatura, odczyn, natlenienie, ciśnienie
osmotyczne.
Wymagania pokarmowe.
Wszystkie bakterie i grzyby potrzebują do wzrostu i rozmnażania się źródła energii,
węgla, azotu i wielu innych składników pokarmowych. Określa to łatwy do zapamiętania
skrót CHOPKNS, będący szeregiem symboli chemicznych najważniejszych pierwiastków.
Oprócz wymienionych składników, w każdej pożywce niezbędna jest również obecność
żelaza, magnezu oraz tzw. pierwiastków śladowych, koniecznych w bardzo małych stężeniach
(np. Co, Mn, Zn, Cu, Mo, Ca).
Na szczególną uwagę zasługuje zapotrzebowanie na źródło energii i węgla. W przypadku
mikroorganizmów autotroficznych źródłem energii jest promieniowanie słoneczne
(fotoautotrofy) lub energia utleniania zredukowanych związków nieorganicznych
(chemoautotrofy), źródłem węgla natomiast obecny w atmosferze CO
2
. Dlatego pożywki do
hodowli autotrofów nie muszą zawierać związków węgla.
Dla heterotrofów natomiast źródłem energii i węgla są związki organiczne. Pod
względem zapotrzebowania na związki organiczne mikroorganizmy dzieli się na dwie grupy:
prototrofy, wymagające do wzrostu tylko jednego rodzaju związku węgla,
auksotrofy, wymagające przynajmniej dwóch rodzajów związków węgla.
Prototrofy są wyjątkowo uzdolnione metabolicznie, gdyż potrafią wszystkie potrzebne
składniki komórkowe zsyntetyzować z często bardzo prostych, nawet jednowęglowych
związków wyjściowych, np. metanu czy mrówczanu. Są to przede wszystkim drobnoustroje
żyjące w środowisku ubogim w składniki pokarmowe (woda, gleba), ale są wśród nich
również mieszkańcy środowisk bogatych w pokarm, np. występująca powszechnie w jelicie
człowieka pałeczka okrężnicy (Escherichia coli).
Auksotrofami są często drobnoustroje żyjące w innych organizmach, np. liczne bakterie i
grzyby chorobotwórcze. Występuje wśród nich duża rozpiętość wymagań pokarmowych, od
jednego dodatkowego związku (np. pałeczka duru brzusznego Salmonella typhi wymaga
aminokwasu tryptofanu) po liczne aminokwasy, zasady purynowe, pirymidynowe i witaminy
potrzebne bakteriom fermentacji mlekowej.
W mikrobiologii stosuje się różne rodzaje pożywek, w zależności od celu badań. Ze
względu na konsystencję można je podzielić na:
płynne,
stałe,
półpłynne.
Pożywki płynne stosowane są zwykle do namnażania w celu otrzymania dużej biomasy
komórek i pozyskiwania produktów ich metabolizmu. Przykładem może być bulion
odżywczy, jedna z najczęściej używanych pożywek. Bulion jest mieszaniną peptonu
(produktu enzymatycznej hydrolizy białek), wyciągu mięsnego (ekstraktu zawierającego m.in.
zasady organiczne i witaminy) i NaCl, dodawanego dla zapewnienia odpowiedniego ciśnienia
osmotycznego. Na bulionie dobrze rosną mikroorganizmy o średnich wymaganiach
pokarmowych, jednak dla wielu drobnoustrojów żyjących w środowiskach ubogich w pokarm
(glebowych i wodnych), jest on zbyt bogatą pożywką, hamującą ich rozwój. Z kolei dla
bardzo wymagających bakterii chorobotwórczych bulion jest zbyt ubogi i musi być
wzbogacony, np. o krew lub wyciąg drożdżowy. Tego typu pożywki określa się mianem
wzbogaconych (patrz niżej).
Pożywki stałe stosuje się głównie do izolacji czystych szczepów, przechowywania ich, do
badań morfologii kolonii, oraz w badaniach ilościowych (określaniu liczby komórek w
próbie). Do zestalania pożywek płynnych używa się głównie agar, a także żelatynę. W
przypadku hodowli niektórych bakterii autotroficznych, wrażliwych na większe stężenia
związków organicznych, stosuje się żel krzemionkowy, którym zestala się pożywkę
mineralną.
Agar jest mieszaniną dwóch polisacharydów: agarozy i agaropektyny, które są polimerami
galaktozy. Jest on wytwarzany przez pewne glony morskie z grupy krasnorostów, jako
składnik ich ścian komórkowych. Produkuje się go w postaci proszku lub granulek. Po
wymieszaniu z wodą i podgrzaniu do temp. 95-98
0
C agar rozpuszcza się, a w trakcie
schładzania zachowuje swoją płynną konsystencję do temperatury ok. 45-48
0
C, kiedy
krzepnie przechodząc w galaretowaty żel. Sam agar (tzw. agar-agar) nie jest pożywką dla
większości bakterii, gdyż nie potrafią go rozkładać. Jest on używany wyłącznie do zestalania
pożywek płynnych (w ilości 1,5-2 %). Dodany do bulionu odżywczego tworzy tzw. agar
odżywczy, w skrócie MPA.
Żelatyna, czyli tzw. klej kostny, jest białkiem otrzymywanym w wyniku dłuższego
gotowania odpadków zawierających kolagen (skóra, kości). Wadą żelatyny jako podłoża
mikrobiologicznego jest to, że rozpuszcza się ona już w temp. ok. 30-35
0
C, a więc poniżej
temperatury inkubacji wielu drobnoustrojów. Niektóre bakterie i grzyby potrafią rozkładać
żelatynę upłynniając ją, co jest wykorzystywane w badaniach diagnostycznych
(identyfikacyjnych).
Pożywki półpłynne mają konsystencję pośrednią między pożywkami płynnymi a stałymi,
i zawierają 0,15-0,2 % agaru. Służą one do badania zdolności ruchu u bakterii. Po
zaszczepieniu słupka z agarem półpłynnym, bakterie zdolne do ruchu będą się przemieszczać
i, dzięki małej gęstości agaru, zasiedlą całą objętość pożywki. W efekcie licznych podziałów,
po okresie inkubacji powstanie zmętnienie w całej objętości słupka agarowego. W przypadku
bakterii nie zdolnych do ruchu, ich podziały komórkowe spowodują jedynie wzrost wzdłuż
linii wkłucia.
Inny podział pożywek uwzględnia wymagania odżywcze drobnoustrojów:
pożywki proste,
pożywki wzbogacone,
pożywki specjalne,
pożywki wybiórcze (selektywne),
pożywki wybiórczo-namnażające,
pożywki wybiórczo-różnicujące.
Pożywki proste zaspokajają niskie i średnie wymagania pokarmowe mikroorganizmów.
Należą tu m.in. omówione wyżej bulion i agar odżywczy. Stanowią one podstawę dla innych,
bardziej złożonych pożywek.
Pożywki wzbogacone stosuje się do hodowli bardziej wymagających drobnoustrojów
chorobotwórczych (np. paciorkowców i gronkowców), przystosowanych do życia w bogatym
w substancje odżywcze środowisku wnętrza organizmu żywiciela. Czynnikiem
wzbogacającym może być odwłókniona krew (często barania), wyciągi z narządów
zwierzęcych, np. wątroby, wyciąg z drożdży, hydrolizat kazeiny – głównego białka mleka i
inne.
Pożywki specjalne służą do hodowli drobnoustrojów o szczególnych wymaganiach
odżywczych, takich jak prątki gruźlicy, dwoinki rzeżączki czy maczugowce błonicy. Używa
się w nich wysokowartościowych składników odżywczych (żółtka jaj kurzych, surowice,
witaminy).
Pożywki wybiórcze umożliwiają wzrost określonym drobnoustrojom (które chcemy
wyizolować z próby) dzięki stworzeniu im sprzyjających warunków wzrostu lub dodanie
składnika hamującego wzrost niepożądanych mikroorganizmów. Przykładem może być
pożywka umożliwiająca wyosobnienie z gleby bakterii Azotobacter, wiążącej azot
atmosferyczny. W pożywce tej nie ma związku zawierającego azot, pierwiastek niezbędny do
wzrostu wszystkim komórkom. Tylko drobnoustroje zdolne do asymilacji (przyswojenia)
azotu cząsteczkowego (N
2
) z powietrza mogą na takiej pożywce rosnąć. Poza tym, zawiera
ona mannitol, ulubione źródło węgla bakterii Azotobacter. Innym przykładem mogą być
pożywki zakwaszone, które są wybiorcze dla grzybów. Obniżony odczyn hamuje wzrost
większości bakterii, które zwykle preferują odczyn obojętny lub lekko zasadowy, natomiast
grzyby jako mikroorganizmy kwasolubne dobrze rosną i dzielą się na takich podłożach.
Pożywki wybiórczo-namnażające są często pożywkami płynnymi i umożliwiają nie tylko
wyosobnienie określonego drobnoustroju (który zwykle występuje w znikomej ilości), ale też
namnożenie go do dużej biomasy umożliwiającej dalsze badania (np. identyfikacyjne).
Przykładem może być podłoże z kwaśnym selenianem sodowym, stosowane do izolacji
pałeczek Salmonella np. z produktów żywnościowych lub gleby (selenian jest tu czynnikiem
hamującym wzrost drobnoustrojów gramdodatnich, a zwłaszcza ziarniaków).
Pożywki wybiórczo-różnicujące umożliwiają nie tylko wzrost wybranym drobnoustrojom,
ale też pozwalają je zróżnicować. Przykładem może być pożywka Endo, często stosowana w
sanitarnych badaniach środowiska. Pozwala ona rosnąć jedynie bakteriom gramujemnym,
czyli jest dla nich wybiórcza (obecność w podłożu fuksyny hamuje rozwój bakterii
gramdodatnich), ale też umożliwia zróżnicowanie wyrosłych bakterii na zdolne, i nie zdolne
do fermentacji laktozy. Podczas fermentacji tego cukru powstaje bowiem aldehyd octowy,
który daje czerwone zabarwienie po połączeniu się z fuksyną (dotąd bezbarwną, bo
zredukowaną przez siarczyn sodu, również dodawany do pożywki). Dlatego bakterie
fermentujące laktozę (jak pałeczka okrężnicy) tworzą kolonie koloru czerwonego z
metalicznym (tzw. fuksynowym) połyskiem, a nie zdolne do fermentacji – koloru różowego
lub bezbarwne.
Pożywki dzieli się też na:
syntetyczne (o ściśle zdefiniowanym składzie ilościowym i jakościowym),
naturalne (o nie znanym dokładnie składzie, na bazie składników pochodzenia
naturalnego, np. wyciąg z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, krew, mleko itp.),
półsyntetyczne (pożywka mineralna o znanym składzie, plus składniki pochodzenia
naturalnego, o nie sprecyzowanym dokładnie składzie).
Temperatura
Drobnoustroje wykazują duże zróżnicowanie wymagań termicznych, które muszą być
uwzględnione podczas hodowli. Dla każdego mikroorganizmu można określić trzy tzw.
temperatury kardynalne:
minimalną, poniżej której wzrost komórek i podziały nie występują,
optymalną, w której komórki rosną i dzielą się najszybciej,
maksymalną, powyżej której wzrost i podziały nie zachodzą.
Temperatury niższe od minimalnych i wyższe od maksymalnych nie muszą być dla
drobnoustrojów zabójcze, zawsze jednak hamują ich rozwój. Punkty kardynalne nie zawsze
oznaczają ściśle określonej temperatury. Może to być pewien (zwykle wąski) zakres
temperatur, zależny od innych czynników, np. od odczynu podłoża. Temperatura inkubacji
hodowli zwykle pokrywa się z temperaturą optymalną dla danego drobnoustroju. Aby
zachować właściwą temperaturę podczas rozwoju hodowli, prowadzi się ją w tzw.
cieplarkach, czyli szafkach zaopatrzonych w urządzenie termostatowe umożliwiające
nastawienie odpowiedniej temperatury i utrzymanie jej.
Punkty kardynalne są podstawą do podziału mikroorganizmów na trzy podstawowe
grupy:
psychrofilne (zimnolubne), o temperaturze optymalnej ok. 20
0
C (minimum ok. -10
0
C,
maksimum ok. 30
0
C),
mezofilne (średniotemperaturowe), o optimum w 37
0
C (minimum 15
0
C, maksimum
45
0
C),
termofilne (ciepłolubne), o optimum w 55
0
C (minimum 30
0
C, maksimum 75
0
C).
Psychrofilami jest większość drobnoustrojów żyjących w środowisku wodnym i
glebowym.
Mezofilami są głównie drobnoustroje żyjące w ciele (i na ciele) zwierząt stałocieplnych
(ptaki i ssaki). Są wśród nich zarówno gatunki chorobotwórcze, jak i niechorobotwórcze
(saprofityczne) tworzące tzw. mikroflorę organizmu.
Do mikroorganizmów termofilnych należą głównie gramdodatnie laseczki i
ziarenkowce. Występują one np. w fermentujących resztkach roślinnych, np. w oborniku,
kompoście, stogach siana, w nawozie, gorących źródłach itp. Istnieje też grupa
mikroorganizmów prokariotycznych zwana archeonami (do niedawna zaliczana do bakterii),
która żyje w warunkach ekstremalnych, gdzie temperatura przekracza 100
0
C. Chodzi o tzw.
kominy termalne na dnie oceanów. Drobnoustroje żyjące w tak wysokich temperaturach
określa się mianem ekstremalnych termofili.
Odczyn
Podobnie jak w przypadku temperatury (i innych czynników środowiska), tu również
wyróżnia się dla każdego drobnoustroju wartość optymalną odczynu, jego minimum i
maksimum. Odpowiednie stężenie jonów wodorowych (którego ujemny logarytm oznacza się
jako pH) ma poważny wpływ na rozwój komórek. Większość bakterii preferuje odczyn
obojętny lub lekko zasadowy (pH ok. 7 – 7,5), grzyby natomiast lepiej rosną w środowisku
kwaśnym (pH ok. 5,2 – 5,6). W trakcie hodowli, jej odczyn dość szybko się zmienia, z
powodu powstawania produktów przemiany materii. Aby utrzymać optymalny odczyn,
pożywki przygotowuje się na bazie odpowiednich buforów
Natlenienie
Pod względem stosunku do tlenu mikroorganizmy dzieli się na:
Bezwzględne tlenowce (bezwzględne aeroby),
Bezwzględne beztlenowce (bezwzględne anaeroby),
Względne beztlenowce (względne anaeroby),
Mikroaerofile.
Bezwzględne tlenowce, jak sugeruje ich nazwa, wymagają warunków tlenowych w
stężeniu atmosferycznym (20%). W hodowli nie napowietrzanej na pożywce płynnej (np.
bulionie), rosną tylko na powierzchni, w postaci kożuszka, pozostawiając pożywkę
przezroczystą (np. laseczki z rodzaju Bacillus i wiele grzybów). W głębi pożywki mogą one
rosnąć jedynie w warunkach napowietrzania.
Bezwzględne beztlenowce nie tolerują tlenu, ponieważ w jego obecności powstaje w
procesach metabolizmu nadtlenek wodoru (H
2
O
2
), związek silnie utleniający, a drobnoustroje
te nie wykazują aktywności katalazowej (katalaza jest enzymem rozkładającym H
2
O
2
).
Przykładem bezwzględnych beztlenowców są niektóre laseczki z rodzaju Clostridium, np.
laseczka tężca (C. tetani). Hodowla takich bakterii wymaga usunięcia tlenu z pożywki, co
można osiągnąć różnymi metodami (patrz niżej).
Względne beztlenowce mogą rozwijać się zarówno w warunkach tlenowych, jak i
beztlenowych. Przykładem może być pałeczka okrężnicy (Escherichia coli), pospolity
mieszkaniec jelita grubego człowieka. W nie napowietrzanej hodowli bulionowej rośnie ona
w całej objętości pożywki (a więc w miejscach o różnym stopniu natlenienia) tworząc
jednolite zmętnienie. Ten typ wzrostu określa się jako dyfuzyjny.
Mikroaerofile to drobnoustroje wymagające do wzrostu tlenu, ale w niewielkim stężeniu,
dlatego w nie napowietrzanej hodowli na pożywce płynnej tworzą zmętnienie tylko na pewnej
głębokości pożywki, gdzie stężenie tlenu jest odpowiednio niskie. Przykładem mogą być
bakterie fermentacji mlekowej z rodzaju Lactobacillus.
Aby zapewnić dobre natlenienie hodowli, stosuje się wytrząsanie (w hodowlach
płynnych), doprowadzanie powietrza za pomocą pompki membranowej (w każdym typie
hodowli) oraz zapewnienie możliwie dużych powierzchni wymiany gazów (szczególnie w
przypadku hodowli na podłożach stałych).
Warunki beztlenowe w hodowli można osiągnąć różnymi metodami, m.in. przez:
zagotowanie pożywki bezpośrednio przed posiewem,
wprowadzenie na powierzchnię pożywki płynnej warstwy sterylnej parafiny,
posiew wgłębny w podłożu zestalonym,
dodanie do pożywki związków redukujących, które obniżają potencjał oksydacyjno-
redukcyjny (kwas askorbinowy, tioglikolan sodu),
hodowlę w jednym naczyniu hodowlanym (szczelnie zamkniętym) tlenowców i
beztlenowców (tlenowce zużywają tlen i stwarzają warunki beztlenowe),
hodowlę w tzw. anerostatach, w których powietrze jest usuwane np. pompką wodną, a
w jego miejsce wprowadzany gaz obojętny, np. azot,
Ciśnienie osmotyczne
Większość drobnoustrojów może rosnąć tylko przy określonym stężeniu soli, w roztworze
izotonicznym (stężenie soli na zewnątrz i wewnątrz komórki są sobie równe). Komórki w
roztworze hipotonicznym, gdy stężenie soli na zewnątrz komórki jest mniejsze i woda ma
tendencje do wnikania do wnętrza, mogą ulec pęknięciu (dzięki ścianie komórkowej udaje im
się jednak wytrzymać określony napór wody). Z tego powodu do rozcieńczania prób w
mikrobiologii nie stosuje się wody destylowanej, lecz roztwór fizjologiczny będący 0,85%
roztworem NaCl. W roztworach hipertonicznych (stężenie na zewnątrz jest większe)
przeżywalność komórek zależy od zdolności do przeciwstawiania się wypływowi wody i
wysuszeniu. Drobnoustroje zdolne do wytrzymywania większych stężeń soli (do ok. 15%)
określane są mianem osmotolerancyjnych (np. gronkowce), natomiast te, które wytrzymują
jeszcze wyższe stężenia to tzw. osmofile lub halofile (niektóre archeony).
Rodzaje hodowli.
Hodowle dzieli się zwykle na:
statyczne (okresowe),
ciągłe,
zsynchronizowane.
W hodowli statycznej mikroorganizmy posiane do pożywki rosną i rozmnażają się do
czasu wyczerpania się składników pokarmowych lub (i) nagromadzenia się toksycznych
produktów przemiany materii. W tego typu hodowli rozwój populacji bakterii przebiega w
kilku charakterystycznych fazach, które można zobrazować na wykresie w postaci tzw.
krzywej wzrostu:
faza zastoju,
faza wzrostu logarytmicznego (wykładniczego),
faza stacjonarna,
faza zamierania.
W fazie zastoju w zaszczepionych komórkach (inokulum) zachodzą procesy adaptacji
polegające na syntezie potrzebnych enzymów, replikacji DNA, syntezie białek i w efekcie
komórki zwiększają swoje rozmiary. Długość tej fazy zależy od podobieństwa warunków
hodowli poprzedniej (z której pochodzi inokulum) do warunków panujących w nowej
hodowli. Im jest ono większe, tym faza jest krótsza.
W fazie wzrostu logarytmicznego komórki zaczynają się dzielić. Sygnałem do podziałów
jest osiągnięcie przez komórki odpowiedniej długości. Każda komórka dzieli się na dwie. Po
określonym czasie wzrostu powstałe komórki znowu dzielą się na dwie, stąd liczbę
powstałych komórek (czyli wzrost populacji) określa wzór 2
n
, gdzie n – to liczba podziałów,
która jest równoznaczna z liczbą pokoleń. Czas między dwoma kolejnymi podziałami, to tzw.
czas generacji lub wiek osobniczy. Zależy on od warunków hodowli i od cech gatunkowych
drobnoustroju. W konkretnej hodowli jest on więc stały. Jeśli liczba komórek w inokulum
wynosi N
0
, to powstała liczba komórek N po n pokoleniach wyniesie N = N
0
x 2
n
. Liczba
bakterii podwaja się co każdy okres generacji, rośnie więc wykładniczo z upływem czasu. Do
czasu hodowli proporcjonalny jest więc logarytm liczby bakterii, a nie sama ich liczba. Stąd
nazwa – faza logarytmiczna.
W fazie stacjonarnej obserwuje się spadek przyrostu liczby bakterii, w wyniku
zamierania części komórek z powodu wyczerpywania się składników pokarmowych, tlenu i
wytwarzania produktów przemiany materii. Zamieranie to jest w pewnej równowadze z
dzieleniem się innych komórek
Z czasem komórek zamierających jest więcej i dochodzi do spadku ogólnej liczby
komórek – hodowla się przerzedza i z czasem zamiera.
Jednak opisana sekwencja zdarzeń w hodowli może być inna. Jeśli tylko zapewni się
usuwanie zużytego podłoża i zastępowanie go świeżym, to możliwe jest utrzymywanie fazy
wzrostu logarytmicznego praktycznie w nieskończoność. Na tym właśnie polega hodowla
ciągła. Jest więc ona, w przeciwieństwie do hodowli statycznej, układem otwartym, z ciągłym
przepływem pożywki (zużytej i świeżej). Prowadzi się ją w tzw. chemostatach,
umożliwiających kontrolowanie wzrostu komórek za pomocą dozowania odpowiednich ilości
pożywki i regulowania szybkości przepływu. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie stanu
równowagi, w którym zagęszczenie komórek jest stałe. Ma to duże znaczenie w badaniach
procesów fizjologicznych drobnoustrojów, kiedy niezbędne są warunki stabilne. Hodowle
ciągłe są wykorzystywane m.in. w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym, do produkcji
określonych substancji (np. kwasu octowego, antybiotyków) i biomasy (np. drożdży).
Hodowle w procesach produkcyjnych prowadzi się w bioreaktorach (fermentorach).
Rodzajem hodowli ciągłej jest również biologiczna oczyszczalnia ścieków, w której hoduje
się bakterie (jako tzw. osad czynny) na bazie pożywki, jaką stanowią ciągle dopływające
ścieki.
Hodowla zsynchronizowana to hodowla, w której komórki dzielą się równocześnie (czyli
synchronicznie), w przeciwieństwie do innych hodowli, gdzie podziały komórek są
nieskoordynowane. Dzięki jednoczesności podziałów, zmiany w hodowli synchronicznej są
odzwierciedleniem (zwielokrotnieniem) zmian w pojedynczej komórce. Umożliwia to
badanie przemian zachodzących w cyklu życiowym komórki, zwykle nieuchwytnych ze
względu na zbyt małą czułość metod badawczych. Zsynchronizowanie podziałów można
osiągnąć wieloma metodami, m.in. przez szok wywołany niską temperaturą. Bakterie
przenosi się na ok. 15 – 60 min. do temperatury dużo niższej od optymalnej. W tych
warunkach dochodzi do zrównania stanu fizjologicznego komórek, które przeniesione do
temperatury optymalnej, równocześnie zaczynają podziały komórkowe. Osiągnięta
synchronizacja nie jest trwała i, jeśli nie jest utrzymywana, szybko spontanicznie zanika.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
:
Zadanie 1. Posiew izolacyjny na podłoże stałe (agar odżywczy)
Celem tego posiewu jest wyizolowanie czystych szczepów drobnoustrojów w postaci
kolonii. Czysty szczep to zbiór komórek pochodzących od jednej komórki macierzystej.
Posiew izolacyjny, zwany też redukcyjnym, polega na rozprowadzaniu zawiesiny komórek za
pomocą ezy, po powierzchni pożywki agarowej. W miarę przeciągania ezy po pożywce,
liczba drobnoustrojów przenoszonych na powierzchnię podłoża będzie coraz mniejsza, aż w
końcu na oczku ezy pozostaną nieliczne komórki, które będą się pojedynczo przyklejać do
pożywki. Każda z tych oddzielonych od siebie komórek zacznie się dzielić i utworzy odrębną
kolonię – wyizolowany czysty szczep.
W celu wykonania posiewu, należy:
1. Wyżarzyć i schłodzić ezę
2. Pobrać ezą zawiesinę bakterii i delikatnie rozprowadzić ją po powierzchni agaru
stosując jedną z wybranych technik
3. Po posiewie ponownie wyżarzyć ezę
4. Posiane hodowle inkubować w temperaturze pokojowej przez kilka dni
5. Po inkubacji ocenić, czy udało się wyizolować czyste szczepy i ile różnych szczepów
znajdowało się w posiewanej zawiesinie.
Zadanie 2. Posiew ezą na skos agarowy
Hodowle na skosie agarowym stosuje się głównie do przechowywania szczepów.
W celu wykonania posiewu, należy:
1. Wyżarzyć i schłodzić ezę
2. Pobrać ezą zawiesinę określonego szczepu bakterii i delikatnie rozprowadzić ją po
powierzchni skosu agarowego zaczynając od dołu i prowadząc ezę zygzakiem ku górze
skosu
6. Po posiewie ponownie wyżarzyć ezę
7. Posianą hodowlę inkubować w temperaturze pokojowej przez kilka dni
Po inkubacji opisać efekty posiewu (intensywność wzrostu, kolor, połyskliwość itp.)
Zadanie 3. Posiew na podłoże płynne (bulion odżywczy).
Posiew stosuje się w celu określenia stosunku do tlenu danej bakterii (czy jest ona
tlenowcem czy względnym beztlenowcem).
1. Pobrać ezą zawiesinę określonego szczepu bakterii i przenieść do probówki z bulionem
odżywczym lekko wstrząsając ezą po włożeniu do bulionu
2. Posianą hodowlę inkubować w temperaturze pokojowej przez kilka dni.
Po inkubacji, na podstawie obserwowanego typu wzrostu hodowli określić, czy posiany
szczep jest tlenowcem czy względnym beztlenowcem.
Zadanie 4. Posiew na podłoże płynne fermentacyjne
Posiew ten służy do badania zdolności danego szczepu do fermentacji określonego cukru,
co przejawia się zmianą zabarwienia pożywki i wytworzeniem gazu zbieranego w rurce
Durhama.
1. Pobrać ezą zawiesinę określonego szczepu bakterii i przenieść do probówki z pożywką
2. Posianą hodowlę inkubować w odpowiedniej temperaturze.
Po inkubacji określić zdolność posianego szczepu do fermentacji cukru zawartego w
pożywce.
Zadanie 5. Posiew metodą kłutą na słupek agarowy z TTC
Posiew ten stosuje się do zbadania zdolności bakterii do ruchu (nie wszystkie bakterie
potrafią się czynnie przemieszczać). Jeśli badany szczep wykazuje zdolność poruszania się, to
zostawia po sobie ślad koloru czerwonego, jako efekt enzymatycznego przekształcenia
obecnego w pożywce bezbarwnego związku TTC w czerwony TF. Reakcję tę katalizuje
enzym dehydrogenaza, aktywny w procesach energetycznych.
1. Pobrać igłą mikrobiologiczną (eza bez oczka) zawiesinę określonego szczepu
bakterii poprzez zwykłe zanurzenie jej w zawiesinie.
2. Zaszczepić słupek agarowy przez wkłucie igły aż do dna słupka (można to wykonać
trzymając probówkę ze słupkiem dnem do góry i wkłuwając się od dołu)
Po tygodniowej inkubacji ocenić zdolność posianego szczepu do aktywnego ruchu na
podstawie stwierdzenia zaczerwienienia pożywki poza miejscem wkłucia.
Zadanie 6. Posiew metodą kłutą na słupek żelatynowy
Posiew stosuje się do badania zdolności danego szczepu do hydrolizy białka, czyli
proteolizy (żelatyna to białko kostne) co przejawia się upłynnieniem żelatyny.
Wykonać posiew jak w zadaniu 5.
Po tygodniowej inkubacji w temperaturze pokojowej ocenić zdolność szczepu do
upłynniania żelatyny.
Zadanie 7. Posiew metodą wgłębną na płytki Petriego
Ten typ posiewu jest często stosowany w badaniach ilościowych (do określenia liczby
komórek w badanym materiale). Przed posiewem należy próbę rozcieńczyć.
Wykonanie rozcieńczenia (schemat):
1. Ustawić w statywie szeregowo 6 probówek zawierających każda po 9 cm
3
roztworu
fizjologicznego (liczba probówek jest proporcjonalna do spodziewanego zagęszczenia
drobnoustrojów w próbie wyjściowej)
2. Do pierwszej probówki wprowadzić pipetą 1cm
3
wyjściowej zawiesiny
drobnoustrojów i wymieszać na mikrowytrząsarce. Uzyska się w ten sposób 10-krotne
rozcieńczenie próby
3. Zmienić końcówkę pipety, pobrać 1cm
3
10-krotnego rozcieńczenia i przenieść do
następnej probówki z roztworem fizjologicznym, a następnie wymieszać w celu
otrzymania rozcieńczenia 100x
4. Postępując podobnie, wykonać kolejne rozcieńczenia: 10
3
x, 10
4
x , 10
5
x i 10
6
x.
Wykonanie posiewu:
1. Przygotować 6 sterylnych szalek Petriego, przeznaczając każdą na inne rozcieńczenie,
i odpowiednio opisać
2. Zaczynając od największego rozcieńczenia (10
6
x), pobrać pipetą (używając jednej
końcówki) po 1cm
3
z każdego rozcieńczenia i wlać do odpowiednich szalek Petriego
3. Do wszystkich szalek wlać płynny agar (schłodzony do temp. ok. 45
0
C) i wymieszać z
wprowadzonymi uprzednio rozcieńczeniami. Pozostawić do zastygnięcia
4. Inkubować przez kilka dni w temp. pokojowej
Po inkubacji określić liczbę komórek drobnoustrojów w 1cm
3
próby wyjściowej. W
tym celu policzyć wszystkie wyrosłe kolonie z płytek, na których jest ich od 30 do 300
(zwrócić uwagę na dwa typy kolonii: wgłębne i powierzchniowe) Uwzględnić
rozcieńczenie posianej próby oraz jej objętość, i ostatecznie wyrazić liczebność w
jednostkach tworzących kolonię na cm
3
badanej zawiesiny (jtk/cm
3
lub cfu/cm
3
; skrót cfu
oznacza właśnie „jednostkę tworzącą kolonię”, z ang. „colony forming unit”). Porównać z
wynikami uzyskanymi metodą posiewu powierzchniowego (Zad.8).
.
Zadanie 8. Posiew metodą powierzchniową głaszczką na podłoże stałe.
Ten typ posiewu, podobnie jak poprzedni, jest często stosowany w badaniach
ilościowych. Ma on jednak tę przewagę nad posiewem wgłębnym, że nie dochodzi tu do
szoku temperaturowego powodowanego wylewaniem gorącego agaru. Poza tym, metoda ta
lepiej nadaje się do hodowli mikroorganizmów tlenowych, np. grzybów.
Przed posiewem wykonać rozcieńczenie próby, podobnie jak w Zad.7.
Posiew wykonać na płytki Petriego z już wylanym, zastygłym agarem odżywczym.
Wykonanie posiewu:
1. Przygotować 6 płytek Petriego z agarem odżywczym, przeznaczając każdą na inne
rozcieńczenie, i odpowiednio opisać.
2. Jedną pipetą pobrać po 0,1 cm
3
z każdego rozcieńczenia, zaczynając od
największego, i wylać na powierzchnię agaru odpowiedniej płytki.
3. Wysterylizować głaszczkę w płomieniu palnika i odczekać aż ostygnie.
4. Wylaną zawiesinę rozprowadzić równomiernie sterylną głaszczką po całej
powierzchni agaru. Odłożyć głaszczkę do zlewki z alkoholem.
5. Posiane płytki inkubować przez tydzień w temp. pokojowej.
Po inkubacji określić liczbę komórek drobnoustrojów w 1cm
3
próby wyjściowej. W
tym celu policzyć wyrosłe kolonie z płytek, na których jest ich od 30 do 300. Uwzględnić
rozcieńczenie posianej próby oraz jej objętość, i wyrazić liczebność w jtk/cm
3
(lub
cfu/cm
3
). Porównać z wynikami uzyskanymi metodą posiewu wgłębnego (Zad.7).