Metody posiewu i hodowli drobnoustrojów

Hodowla drobnoustrojów

Aby zało

hodowl

drobnoustrojów nale

y wprowadzi

je do

sterylnej

ywki, czyli posia

Posiewane mikroorganizmy okre

la si

mianem

inokulum
Nie zawsze znamy skład drobnoustrojów tworz

cych

inokulum, np. kiedy posiewamy prób

ę ś

rodowiskow

, w

której zwykle znajduje si

wiele ró

norodnych bakterii

(woda,

cieki, gleba itp.).

Posiane drobnoustroje inkubuje si

, czyli przetrzymuje w

ywce okre

lony czas (czas inkubacji), w okre

lonej

temperaturze (temperatura inkubacji).
Podczas inkubacji posiane komórki rosn

i dziel

Hodowla drobnoustrojów

Trzeba jednak wspomnie

e s

drobnoustroje, które nie rosn

adnych

ywkach i nie mo

na ich hodowa

, np.

tek blady, wywołuj

cy kił

lub pr

tek

du.

Ró

ne mog

cele posiewu, a

c i zało

onej hodowli:

wyizolowanie okre

lonych drobnoustrojów z

prób

rodowiskowych (wody, gleby), w tym

uzyskanie czystych szczepów, czyli zbiorów
komórek pochodz

cych z jednej komórki

macierzystej, z zamiarem ich dalszych bada

(m.in. identyfikacji),
namno

enie komórek ju

wyizolowanego i

zidentyfikowanego szczepu, np. w celu
pozyskania pewnych produktów jego
metabolizmu, lub zbadania jego zdolno

ci do

rozkładu okre

lonych zanieczyszcze

policzenie komórek wchodz

cych w skład

posiewanej próby.

Hodowla drobnoustrojów

ywka, w której prowadzi si

hodowl

okre

lonych drobnoustrojów musi

zaspokaja

ich wymagania od

ywcze.

Poza tym hodowla powinna by

prowadzona w optymalnych dla wzrostu
warunkach

rodowiskowych, takich jak:

- temperatura,
- odczyn,
- natlenienie,
- ci

nienie osmotyczne.

Wymagania pokarmowe.

Wszystkie bakterie potrzebuj

do wzrostu i rozmna

ania

ródła energii,

- w

gla,

- azotu i wielu innych składników pokarmowych.

Okre

la to łatwy do zapami

tania skrót CHOPKNS,

cy szeregiem symboli chemicznych

najwa

niejszych pierwiastków.

Oprócz wymienionych składników, w ka

dej po

ywce

niezb

dna jest równie

obecno

ść ż

elaza, magnezu oraz

tzw. pierwiastków

ladowych, koniecznych w bardzo

małych st

ęż

eniach (np. Co, Mn, Zn, Cu, Mo, Ca).

ła

iki

sole metali:

, K

, Mg

, Fe

proste zwi

zki organiczne

słu

żą

ce jako

ródło w

gla i energii

np.: C

(cukier) lub

COOH (kw. octowy)

bardziej skomplikowane

zwi

zki organiczne, czynniki

wzrostowe:

witaminy, aminokwasy
zasady organiczne itd.

Składniki pokarmu

autotrofy

prototrofy

heterotrofy

Składniki komórki:
C

(

glowodany

), R-CHNH

-COOH (

aminokwasy

)

Zasady purynowe i pirymidynowe, witaminy, wielocukry,
tłuszcze, kwasy nukleinowe, białka

auksotrofy

za Ró

ski 2002.

Dla heterotrofów

ródłem energii i w

gla

zwi

zki organiczne.

Pod wzgl

dem zapotrzebowania na

zwi

zki organiczne mikroorganizmy dzieli

na dwie grupy:

• prototrofy, wymagaj

ce do wzrostu tylko

jednego rodzaju zwi

zku w

gla,

• auksotrofy, wymagaj

ce przynajmniej

dwóch rodzajów zwi

zków w

gla.

Prototrofy

wyj

tkowo uzdolnione metabolicznie, gdy

potrafi

wszystkie potrzebne składniki

komórkowe zsyntetyzowa

z cz

sto bardzo

prostych, nawet jednow

glowych zwi

zków

wyj

ciowych, np. metanu czy mrówczanu.

to przede wszystkim drobnoustroje

ce w

rodowisku ubogim w składniki pokarmowe

(woda, gleba), ale s

ród nich równie

mieszka

rodowisk bogatych w pokarm, np.

wyst

puj

ca powszechnie w jelicie człowieka

pałeczka okr

ęż

nicy (Escherichia coli).

Auksotrofy

to cz

sto drobnoustroje

ce w innych

organizmach, np. liczne bakterie
chorobotwórcze.

Wyst

puje w

ród nich du

a rozpi

ść

wymaga

pokarmowych, od jednego dodatkowego
zwi

zku (np. pałeczka duru brzusznego

Salmonella typhi wymaga aminokwasu
tryptofanu) po liczne aminokwasy, zasady
purynowe, pirymidynowe i witaminy potrzebne
bakteriom fermentacji mlekowej.

ywki hodowlane

W mikrobiologii stosuje si

ró

ne rodzaje

ywek, w zale

ci od celu bada

. Ze

wzgl

du na konsystencj

na je

podzieli

na:

płynne,

stałe,

półpłynne.

ywki płynne

Stosowane s

zwykle do namna

ania w celu otrzymania

ej biomasy komórek i pozyskiwania produktów ich

metabolizmu.
Przykładem mo

e by

bulion od

ywczy, jedna z najcz

ęś

ciej

ywanych po

ywek.

Bulion jest mieszanin

peptonu (produktu enzymatycznej

hydrolizy białek), wyci

gu mi

snego (ekstraktu

zawieraj

cego m.in. zasady organiczne i witaminy) i NaCl,

dodawanego dla zapewnienia odpowiedniego ci

nienia

osmotycznego.
Na bulionie dobrze rosn

mikroorganizmy o

rednich

wymaganiach pokarmowych, jednak dla wielu
drobnoustrojów

cych w

rodowiskach ubogich w pokarm

(glebowych i wodnych), jest on zbyt bogat

ywk

hamuj

ich rozwój. Z kolei dla bardzo wymagaj

cych

bakterii chorobotwórczych bulion jest zbyt ubogi i musi by

wzbogacony, np. o krew lub wyci

g dro

owy. Tego typu

ywki okre

la si

mianem wzbogaconych.

ywki stałe

• Stosuje si

głównie do izolacji czystych

szczepów, przechowywania ich, do bada

morfologii kolonii, oraz w badaniach ilo

ciowych

(okre

laniu liczby komórek w próbie).

• Do zestalania po

ywek płynnych u

ywa si

głównie agar, a tak

elatyn

• W przypadku hodowli niektórych bakterii

autotroficznych, wra

liwych na wi

ksze st

ęż

enia

zwi

zków organicznych, stosuje si

ę ż

krzemionkowy, którym zestala si

ywk

mineraln

Agar-agar

• Jest mieszanin

dwóch polisacharydów: agarozy i

agaropektyny, które s

polimerami galaktozy.

• Jest on wytwarzany przez glony morskie z grupy

krasnorostów, jako składnik ich

cian komórkowych.

Produkuje si

go w postaci proszku lub granulek.

• Po wymieszaniu z wod

i podgrzaniu do temp. 95-98

agar rozpuszcza si

, a w trakcie schładzania zachowuje

swoj

płynn

konsystencj

do temperatury ok. 45-48

kiedy krzepnie przechodz

c w galaretowaty

el.

• Sam agar nie jest po

ywk

dla wi

kszo

ci bakterii, gdy

nie potrafi

go rozkłada

. Jest on u

ywany wył

cznie do

zestalania po

ywek płynnych (w ilo

ci 1,5 - 2 %).

Dodany do bulionu od

ywczego tworzy tzw. agar

ywczy, w skrócie MPA.

elatyna,

• Czyli tzw. klej kostny, jest białkiem

otrzymywanym w wyniku dłu

szego gotowania

odpadków zawieraj

cych kolagen (skóra, ko

ci).

• Wad

ą ż

elatyny jako podło

a mikrobiologicznego

jest to,

e rozpuszcza si

ona ju

w temp. ok.

30-35

C, a wi

c poni

ej temperatury inkubacji

wielu drobnoustrojów.

• Niektóre bakterie potrafi

rozkłada

ć ż

elatyn

upłynniaj

c j

, co jest wykorzystywane w

badaniach diagnostycznych (identyfikacyjnych).

ywki półpłynne

• Maj

konsystencj

redni

dzy po

ywkami

płynnymi a stałymi, i zawieraj

0,15-0,2 % agaru.

• Słu

żą

one do badania zdolno

ci ruchu u bakterii. Po

zaszczepieniu słupka z agarem półpłynnym, bakterie
zdolne do ruchu b

przemieszcza

i, dzi

ki małej

sto

ci agaru, zasiedl

cał

obj

ść

ywki. W

efekcie licznych podziałów, po okresie inkubacji
powstanie zm

tnienie w całej obj

ci słupka

agarowego.

• W przypadku bakterii nie zdolnych do ruchu, ich podziały

komórkowe spowoduj

jedynie wzrost wzdłu

linii

wkłucia.

Podział po

ywek uwzgl

dniaj

wymagania od

ywcze

drobnoustrojów:

• po

ywki proste,

• po

ywki wzbogacone,

• po

ywki specjalne,

• po

ywki wybiórcze (selektywne),

• po

ywki wybiórczo-namna

ce,

• po

ywki wybiórczo-ró

nicuj

ce.

ywki proste

• Zaspokajaj

niskie i

rednie wymagania

pokarmowe mikroorganizmów.

• Nale

żą

tu m.in. bulion i agar od

ywczy.

• Stanowi

one baz

dla innych, bardziej

zło

onych po

ywek.

ywki wzbogacone

• Stosuje si

do hodowli bardziej wymagaj

cych

drobnoustrojów chorobotwórczych (np.
paciorkowców i gronkowców), przystosowanych
do

ycia w bogatym w substancje od

ywcze

rodowisku wn

trza organizmu

ywiciela.

• Czynnikiem wzbogacaj

cym mo

e by

odwłókniona krew (cz

sto barania), wyci

gi z

narz

dów zwierz

cych, np. w

troby, wyci

g z

dro

y, hydrolizat kazeiny – głównego białka

mleka i inne.

ywki specjalne

• Słu

żą

do hodowli drobnoustrojów o

szczególnych wymaganiach od

ywczych,

takich jak pr

tki gru

licy, dwoinki rze

żą

czki

czy maczugowce błonicy.

• U

ywa si

w nich wysokowarto

ciowych

składników od

ywczych (

ółtka jaj

kurzych, surowice, witaminy).

ywki wybiórcze

• Umo

liwiaj

wzrost okre

lonym drobnoustrojom (które

chcemy wyizolowa

z próby) dzi

ki stworzeniu im

sprzyjaj

cych warunków wzrostu lub dodanie składnika

hamuj

cego wzrost niepo

żą

danych mikroorganizmów.

• Przykładem mo

e by

ywka umo

liwiaj

wyosobnienie z gleby bakterii Azotobacter, wi

ążą

cej azot

atmosferyczny. W po

ywce tej nie ma zwi

zku

zawieraj

cego azot, pierwiastek niezb

dny do wzrostu

wszystkim komórkom. Tylko drobnoustroje zdolne do
asymilacji (przyswojenia) azotu cz

steczkowego (N2) z

powietrza mog

na takiej po

ywce rosn

ąć

. Poza tym,

zawiera ona mannitol, ulubione

ródło w

gla bakterii

Azotobacter.

• Innym przykładem mog

ywki zakwaszone, które

wybiorcze dla grzybów. Obni

ony odczyn hamuje wzrost

kszo

ci bakterii, które zwykle preferuj

odczyn oboj

tny

lub lekko zasadowy, natomiast grzyby jako mikroorganizmy
kwasolubne dobrze rosn

i dziel

na takich podło

ach.

ywki wybiórczo-namna

• S

sto po

ywkami płynnymi i umo

liwiaj

nie

tylko wyosobnienie okre

lonego drobnoustroju

(który zwykle wyst

puje w znikomej ilo

ci), ale

namno

enie go do du

ej biomasy

umo

liwiaj

cej dalsze badania (np.

identyfikacyjne).

• Przykładem mo

e by

podło

e z kwa

nym

selenianem sodowym, stosowane do izolacji
pałeczek Salmonella np. z produktów

ywno

ciowych lub gleby (selenian jest tu

czynnikiem hamuj

cym wzrost drobnoustrojów

gramdodatnich, a zwłaszcza ziarniaków).

ywki wybiórczo-ró

nicuj

• Umo

liwiaj

nie tylko wzrost wybranym drobnoustrojom,

ale te

pozwalaj

je zró

nicowa

• Przykładem mo

e by

ywka Endo, cz

sto stosowana

w sanitarnych badaniach

rodowiska. Pozwala ona

rosn

ąć

jedynie bakteriom gramujemnym, czyli jest dla

nich wybiórcza (obecno

ść

w podło

u fuksyny hamuje

rozwój bakterii gramdodatnich), ale te

umo

liwia

zró

nicowanie wyrosłych bakterii na zdolne, i nie zdolne

do fermentacji laktozy. Podczas fermentacji tego cukru
powstaje bowiem aldehyd octowy, który daje czerwone
zabarwienie po poł

czeniu si

z fuksyn

(dot

bezbarwn

, bo zredukowan

przez siarczyn sodu,

równie

dodawany do po

ywki).

• Dlatego bakterie fermentuj

ce laktoz

(jak pałeczka

okr

ęż

nicy) tworz

kolonie koloru czerwonego z

metalicznym (tzw. fuksynowym) połyskiem, a nie zdolne
do fermentacji – koloru ró

owego lub bezbarwne.

ywki dzieli si

ze wzgl

na skład na:

• syntetyczne (o

le zdefiniowanym składzie

ilo

ciowym i jako

ciowym),

• naturalne (o nie znanym dokładnie składzie, na

bazie składników pochodzenia naturalnego, np.
wyci

g z tkanek ro

linnych lub zwierz

cych,

krew, mleko itp.),

• półsyntetyczne (po

ywka mineralna o znanym

składzie, plus składniki pochodzenia
naturalnego, o nie sprecyzowanym dokładnie
składzie).

Temperatura

• Drobnoustroje wykazuj

e zró

nicowanie

wymaga

termicznych, które musz

uwzgl

dnione podczas hodowli.

• Dla ka

dego mikroorganizmu mo

na okre

trzy tzw. temperatury kardynalne:

• minimaln

, poni

ej której wzrost komórek i

podziały nie wyst

puj

• optymaln

, w której komórki rosn

i dziel

najszybciej,

• maksymaln

, powy

ej której wzrost i podziały

nie zachodz

Temperatura

• Temperatury ni

sze od minimalnych i wy

sze od

maksymalnych nie musz

dla drobnoustrojów

zabójcze, zawsze jednak hamuj

ich rozwój.

• Punkty kardynalne nie zawsze oznaczaj

ą ś

okre

lonej temperatury. Mo

e to by

pewien (zwykle

ski) zakres temperatur, zale

ny od innych czynników,

np. od odczynu podło

• Temperatura inkubacji hodowli zwykle pokrywa si

temperatur

optymaln

dla danego drobnoustroju.

• Aby zachowa

wła

ciw

temperatur

podczas rozwoju

hodowli, prowadzi si

w tzw. cieplarkach, czyli

szafkach zaopatrzonych w urz

dzenie termostatowe

umo

liwiaj

ce nastawienie odpowiedniej temperatury i

utrzymanie jej.

Punkty kardynalne s

podstaw

podziału mikroorganizmów na trzy

podstawowe grupy:

• psychrofilne (zimnolubne), o

temperaturze optymalnej ok. 20

(minimum ok. -10

C, maksimum ok. 30

C),

• mezofilne (

redniotemperaturowe), o

optimum w 37

C (minimum 15

maksimum 45

C),

• termofilne (ciepłolubne), o optimum w

C (minimum 30

C, maksimum 75

C).

• Psychrofilami jest wi

kszo

ść

drobnoustrojów

cych

rodowisku wodnym i glebowym.

• Mezofilami s

głównie drobnoustroje

ce w ciele (i na

ciele) zwierz

t stałocieplnych (ptaki i ssaki). S

ród

nich zarówno gatunki chorobotwórcze, jak i
niechorobotwórcze (saprofityczne) tworz

ce tzw.

mikroflor

organizmu.

• Do mikroorganizmów termofilnych nale

żą

głównie

gramdodatnie laseczki i ziarenkowce. Wyst

puj

one np.

w fermentuj

cych resztkach ro

linnych, np. w oborniku,

kompo

cie, stogach siana, w nawozie, gor

cych

ródłach itp. Istnieje te

grupa mikroorganizmów

prokariotycznych zwana archeonami (do niedawna
zaliczana do bakterii), która

yje w warunkach

ekstremalnych, gdzie temperatura przekracza 1000C.
Chodzi o tzw. kominy termalne na dnie oceanów.
Drobnoustroje

ce w tak wysokich temperaturach

okre

la si

mianem ekstremalnych termofili.

Odczyn

• Odpowiednie st

ęż

enie jonów wodorowych (pH)

ma powa

ny wpływ na rozwój komórek.

• Wi

kszo

ść

bakterii preferuje odczyn oboj

tny lub

lekko zasadowy (pH ok. 7 – 7,5), grzyby
natomiast lepiej rosn

rodowisku kwa

nym

(pH ok. 5,2 – 5,6).

• W trakcie hodowli, jej odczyn do

ść

szybko si

zmienia, z powodu powstawania produktów
przemiany materii.

• Aby utrzyma

optymalny odczyn, po

ywki

przygotowuje si

na bazie odpowiednich

buforów

Natlenienie

Pod wzgl

dem stosunku do tlenu

mikroorganizmy dzieli si

na:

• Bezwzgl

dne tlenowce (bezwzgl

dne

aeroby),

• Bezwzgl

dne beztlenowce (bezwzgl

dne

anaeroby),

• Wzgl

dne beztlenowce (wzgl

dne anaeroby),

• Mikroaerofile.

Bezwzgl

dne tlenowce

• Jak sugeruje ich nazwa, wymagaj

warunków

tlenowych w st

ęż

eniu atmosferycznym (20%).

• W hodowli nie napowietrzanej na po

ywce

płynnej (np. bulionie), rosn

tylko na

powierzchni, w postaci ko

uszka, pozostawiaj

ywk

przezroczyst

(np. laseczki z rodzaju

Bacillus i wiele grzybów).

• W gł

bi po

ywki mog

one rosn

ąć

jedynie w

warunkach napowietrzania.

Bezwzgl

dne beztlenowce

• Nie toleruj

tlenu, poniewa

w jego obecno

powstaje w procesach metabolizmu nadtlenek
wodoru (H

), zwi

zek silnie utleniaj

cy, a

drobnoustroje te nie wykazuj

aktywno

katalazowej (katalaza jest enzymem
rozkładaj

cym H

• Przykładem bezwzgl

dnych beztlenowców s

niektóre laseczki z rodzaju Clostridium, np.
laseczka t

ęż

ca (C. tetani).

• Hodowla takich bakterii wymaga usuni

cia tlenu

z po

ywki, co mo

na osi

ąć

ró

nymi

metodami.

Wzgl

dne beztlenowce

• Mog

rozwija

zarówno w warunkach

tlenowych, jak i beztlenowych.

• Przykładem mo

e by

pałeczka okr

ęż

nicy

(Escherichia coli), pospolity mieszkaniec jelita
grubego człowieka.

• W nie napowietrzanej hodowli bulionowej ro

nie

ona w całej obj

ci po

ywki (a wi

c w

miejscach o ró

nym stopniu natlenienia) tworz

jednolite zm

tnienie.

• Ten typ wzrostu okre

la si

jako dyfuzyjny.

Mikroaerofile

• To drobnoustroje wymagaj

ce do wzrostu

tlenu, ale w niewielkim st

ęż

eniu, dlatego w

nie napowietrzanej hodowli na po

ywce

płynnej tworz

tnienie tylko na pewnej

gł

boko

ci po

ywki, gdzie st

ęż

enie tlenu

jest odpowiednio niskie.

• Przykładem mog

bakterie fermentacji

mlekowej z rodzaju Lactobacillus.

• Aby zapewni

dobre natlenienie hodowli,

stosuje si

wytrz

sanie (w hodowlach

płynnych), doprowadzanie powietrza za
pomoc

pompki membranowej (w ka

dym

typie hodowli) oraz zapewnienie mo

liwie

ych powierzchni wymiany gazów

(szczególnie w przypadku hodowli na
podło

ach stałych).

Warunki beztlenowe w hodowli mo

osi

ąć

ró

nymi metodami, m.in. przez:

zagotowanie po

ywki bezpo

rednio przed posiewem,

wprowadzenie na powierzchni

ywki płynnej warstwy

sterylnej parafiny,
posiew wgł

bny w podło

u zestalonym,

dodanie do po

ywki zwi

zków redukuj

cych, które

obni

potencjał oksydacyjno-redukcyjny (kwas

askorbinowy, tioglikolan sodu),
hodowl

w jednym naczyniu hodowlanym (szczelnie

zamkni

tym) tlenowców i beztlenowców (tlenowce

ywaj

tlen i stwarzaj

warunki beztlenowe),

hodowl

w tzw. anerostatach, w których powietrze jest

usuwane np. pompk

wodn

, a w jego miejsce

wprowadzany gaz oboj

tny, np. azot,

nienie osmotyczne

kszo

ść

drobnoustrojów mo

e rosn

ąć

tylko przy

okre

lonym st

ęż

eniu soli, w roztworze izotonicznym (st

ęż

enie

soli na zewn

trz i wewn

trz komórki s

sobie równe).

Komórki w roztworze hipotonicznym, gdy st

ęż

enie soli na

zewn

trz komórki jest mniejsze i woda ma tendencje do

wnikania do wn

trza, mog

ulec p

kni

ciu (dzi

cianie

komórkowej udaje im si

jednak wytrzyma

okre

lony napór

wody).
Z tego powodu do rozcie

czania prób w mikrobiologii nie

stosuje si

wody destylowanej, lecz roztwór fizjologiczny

cy 0,85% roztworem NaCl.

W roztworach hipertonicznych (st

ęż

enie na zewn

trz jest

ksze) prze

ywalno

ść

komórek zale

y od zdolno

ci do

przeciwstawiania si

wypływowi wody i wysuszeniu.

Drobnoustroje zdolne do wytrzymywania wi

kszych st

ęż

soli (do ok. 15%) okre

lane s

mianem osmotolerancyjnych

(np. gronkowce), natomiast te, które wytrzymuj

jeszcze

sze st

ęż

enia to tzw. osmofile lub halofile (niektóre

archeony).

W hodowli statycznej

• Mikroorganizmy posiane do po

ywki rosn

i rozmna

do czasu wyczerpania si

składników pokarmowych

lub (i) nagromadzenia si

toksycznych produktów

przemiany materii. W tego typu hodowli rozwój populacji
bakterii przebiega w kilku charakterystycznych fazach,
które mo

na zobrazowa

na wykresie w postaci tzw.

krzywej wzrostu:

• faza zastoju,
• faza wzrostu logarytmicznego (wykładniczego),
• faza stacjonarna,
• faza zamierania.