Chemia kliniczna
2011/2012
dla studentów IV roku Analityki Medycznej
Agnieszka Sapa
Strona 1 z 3
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej
METODYKA OZNACZANIA GLUKOZY
I. Materiał badany.
Rodzaj materiału zależy od celu badań:
a. Do diagnostyki cukrzycy oraz innych zaburzeń gospodarki węglowodanowej należy stosować
osocze krwi żylnej pobranej na EDTA lub szczawian (ew. heparynę) z dodatkiem inhibitora
glikolizy (fluorek sodu, jodooctan sodu, maleinimid, mannoza). Próbka powinna być
przechowywana do 30 minut w wodzie z lodem lub natychmiast odwirowana a osocze oddzielone.
Krwinki obecne w próbce zużywają glukozę w procesie glikolizy, powodując spadek 5 - 7 % /h.
Szczególnie istotne jest stosowanie inhibitorów, kiedy występuje wysoka leukocytoza lub
w próbkach neonatologicznych (wysoki hematokryt) oraz gdy pobieranie materiału nie odbywa się
w laboratorium. Najczęściej stosowanym inhibitorem jest fluorek sodu, w stężeniu 2,5 mg/ml
krwi. Hamuje on enolazę (9 enzym szlaku glikolizy) a jego działanie następuje po 1 - 3 godzinach
od pobrania krwi. Najlepsze połączenie to fluorek + mannoza, której działanie jest
natychmiastowe, ale krótkotrwałe (do 4 godzin).
b. Oznaczanie glukozy wykonywane jest również w innych typach próbek, jak: płyn mózgowo-
rdzeniowy, mocz, płyny z jam ciała (nie służy wtedy do diagnostyki cukrzycy!).
c. Do kontroli glikemii u pacjentów cukrzycowych często stosuje się krew włośniczkową, przy
czym badanie powinno się wykonywać przy pomocy wystandaryzowanego glukometru, który
powinien przeliczyć stężenie we krwi pełnej na stężenie glukozy w osoczu. Stężenie glukozy we
krwi pełnej jest niższe niż w osoczu o ok. 11 %, we krwi kapilarnej (włośniczkowej) jest zwykle
wyższe niż w żylnej. Przelicznik zależy od hematokrytu, dlatego oznaczanie we krwi pełnej nie
powinno być używane do diagnostyki cukrzycy, ma zastosowanie jedynie w kontroli glikemii
podczas leczenia cukrzycy.
II. Metody oznaczeń
1. Enzymatyczne – wykorzystują różne układy enzymów, spośród nich najczęściej stosowane
metody to:
a. metoda oksydazowa (GOD/POD) – jest jedną z najczęściej używanych metod, cechuje się dobrą
poprawnością i precyzją. Stosowana jest w wersji manualnej i automatycznej. Wykorzystywana
także w suchej chemii, w automatach, gdzie poszczególne składniki reakcji umieszczone są
wewnątrz wielowarstwowych slajdów (np. Vitros firmy Ortho) oraz w glukometrach, gdzie
reagenty umieszczone są na pasku testowym.
Zasada metody:
glukoza + O
2
kwas glukonowy + H
2
O
2
H
2
O
2
+ 4-aminoantypiryna + hydroksybenzoesan
chinonoimina + H
2
O
peroksydaza chrzanowa
oksydaza glukozy
Chemia kliniczna
2011/2012
dla studentów IV roku Analityki Medycznej
Agnieszka Sapa
Strona 2 z 3
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej
Ilość powstającej barwnej pochodnej jest proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce. Akceptorami
tlenu mogą być też 4-aminofenazon/fenol (klasyczna reakcja Trindera). Oksydaza glukozy jest
wysoce specyficzna dla β-D-glukozy, dlatego w środowisku reakcji obecny jest enzym mutarotaza,
gdyż ok. 36 % glukozy znajduje się w formie α. Reakcja wskaźnikowa jest podatna na wpływ
substancji o silnych właściwościach utleniających lub redukujących (m.in. kwas askorbinowy,
moczowy, bilirubina, hemoglobina, glutation, tetracyklina).
b. metoda heksokinazowa – na tej reakcji jest oparta referencyjna metoda oznaczania glukozy,
cechuje się bardzo dobrą poprawnością i wysoką precyzją. Jest swoista tylko dla glukozy, brak
jest interferencji substancji o właściwościach silnie redukujących lub utleniających. Stosowana
jako metoda kinetyczna i punktu końcowego, manualna lub automatyczna.
Zasada metody:
glukoza + ATP
glukozo-6-fosforan + ADP
glukozo-6-fosforan + NADP
+
6-fosfoglukonian + NADPH + H
+
Jest to metoda spektrofotometryczna (tzw. test Warburga). Wzrost absorbancji przy długości fali
340 nm jest wprost proporcjonalny do stężenia glukozy w próbce.
c. metoda z dehydrogenazą glukozy – jest oparta na reakcji wysoce specyficznej dla glukozy,
niewrażliwa na interferencje, wyniki są bardzo zbliżone do uzyskiwanych metodą
heksokinazową. Mimo to nie jest powszechnie stosowana.
Zasada metody:
glukoza + NAD
+
dehydrogenaza glukozy
D-glukono-δ-lakton + NADH + H
+
Wzrost absorbancji przy 340 nm jest wprost proporcjonalny do stężenia glukozy w próbce (test
optyczny Warburga). W środowisku reakcji obecna jest mutarotaza.
d. metoda z użyciem polarograficznej elektrody tlenowej – jest to metoda wykorzystywana
w niektórych automatach.
Zasada metody:
Opiera się na reakcji katalizowanej przez oksydazę glukozy (patrz pkt. a), przy czym mierzone jest
polarograficznie zużycie tlenu w środowisku reakcji. W celu eliminacji wpływu tlenu tworzącego się
de novo z łatwo rozpadającego się H
2
O
2
konieczne jest zastosowanie jednej z następujących reakcji:
H
2
O
2
+ C
2
H
5
OH
katalaza
CH
3
CHO + 2 H
2
O
lub
H
2
O
2
+ 2H
+
+ 2I
-
molibdenian
I
2
+ 2 H
2
O
dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu
heksokinaza
Chemia kliniczna
2011/2012
dla studentów IV roku Analityki Medycznej
Agnieszka Sapa
Strona 3 z 3
Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej
e. czujniki glukozy – wszczepiane podskórnie biosensory :-)
f. GlucoWatch – pomiar glukozy poprzez jej elektroosmozę przez skórę :-)
2. Redukcyjne – oparte na redukcyjnych właściwościach cukrów, które pod względem budowy
chemicznej są aldozami lub ketozami i w środowisku zasadowym można przeprowadzić z ich
udziałem reakcje utleniania-redukcji, addycji i kondensacji. Metody te są nieswoiste dla glukozy,
reagują wszystkie związki redukujące obecne we krwi np. glutation, inne cukry proste. Obecnie
mają znaczenie historyczne.
3. Kondensacyjne – w środowisku silnie kwaśnym heksozy i pentozy ulegają odwodnieniu i tworzą
odpowiednio hydroksymetylenofurfural i furfural, które następnie można sprzęgać z różnymi
aromatycznymi pochodnymi (np. o-toluidyną), tworzą się barwne produkty. Cukry złożone
również biorą udział w reakcji. Metody te są bardziej swoiste niż redukcyjne, gdyż w reakcji
biorą udział tylko cukry ale wciąż nie są swoiste dla glukozy. Obecnie metody te nie są
stosowane.
III. Wg zaleceń Międzynarodowej Federacji Chemii Klinicznej (IFCC) metody do oznaczania
glukozy stosowane w laboratoriach powinny spełniać następujące kryteria:
1. Nieprecyzyjność
3,3 %
2. Obciążenie
2,5 %
3. Błąd całkowity
7,9 %
Zalecana literatura:
- Burtis C. A., Ashwood E. R., Bruns D. E., Sawyer B.G.: Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. 6
th
ed. Saunders
Elsevier Inc., St. Louis, USA, 2008.
- Guder W.G., Narayanan S., Wisser H., Zawta B.: Próbki od pacjenta do laboratorium. Wpływ zmienności
przedanalitycznej na jakość wyników badań laboratoryjnych. Wydanie I polskie (red. M. Woźniak). Medpharm,
Wrocław, 2009.
- Kaplan L. A., Pesce A. J.: Clinical chemistry. Theory, analysis, and correlation. 2
nd
ed. Mosby Co., St. Louis, USA, 1989.
- Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycemia – report of a WHO/IDF consultation.
World Health Organization 2006.
-
Zalecenia kliniczne dotyczące postępowania u chorych na cukrzycę 2010,
Diabetologia Praktyczna, 2010, 11, supl. A.