Kopciara Marcin Data wykonania:

Ramięga Tomasz ŚRODA

Świątczak Piotr godz. 15¹⁵-19⁰⁰

BIOTECHNOLOGIA ŚRODOWISKA

LABORATORIUM

TECHNOLOGIA REMDICAJI

ĆWICZENIE NR 5

„BIODEGRADACJA WĘGLOWODORÓW OLEJU NAPĘDOWEGO”

Mimo iż od tysięcy lat ludzie wykorzystują procesy biotechnologiczne do swoich celów dopiero w XX wieku, zaczęto stosować je na szeroką skalę. Najwcześniej poznanym procesem biotechnologicznym wykorzystywanym przez człowieka była produkcja wina, piwa i chleba z użyciem drożdży co datuje się na 6000 lat p.n.e. (wikipedia). W XXI w. biotechnologia jest obecna w życiu każdego z nas. Wykorzystuje się ją w produkcji żywności, farmaceutyków, w przemyśle spożywczym, medycynie oraz w przemyśle chemicznym i oczywiście w ochronie środowiska. W dzisiejszym świecie biotechnologia stanowi jedną z najistotniejszych dziedzin badań naukowych.

Według Encyklopedii Wikipedia „bioremediacja to technologia usuwania zanieczyszczeń (głównie substancji ropopochodnych) z gleby i wód podziemnych za pomocą żywych mikroorganizmów w celu katalizowania, destrukcji lub transformacji różnego rodzaju zanieczyszczeń w formy mniej szkodliwe. W bioremediacji wykorzystywane są naturalne zdolności mikroorganizmów do rozkładu węglowodorów ropy naftowej.”

Głównymi problemami, które są objęte działaniami w ramach biotechnologii środowiska są skażenia gleby oraz wód powierzchniowych i gruntowych ropą naftową i produktami jej przerobu. Źródłem tych zanieczyszczeń są nie tylko procesy wydobycia ale również pospolite awarie, transport i magazynowanie. Zanieczyszczenia węglowodorami ropy naftowej są bardzo uciążliwe dla środowiska. Wiele z tych substancji jest kancerogennych i toksycznych. Powodują też zmianę stosunku ilości węgla do azotu i fosforu w środowisku co może być przyczyną ginięcia pewnych gatunków roślin. Oprócz wzbogacania gleby czy wód w węgiel istotne znaczenie ma też konsystencja ksenobiotyki. Oleiste frakcje ropy zalegają na powierzchni utrudniając wymianę gazową w głębszych warstwach co ma miejsce na gruncie nieprzepuszczalnym. Na podłożu przepuszczalnym zanieczyszczenia wsiąkają w głąb środowiska glebowego przedostając się do wód podziemnych. Obecność tych węglowodorów w środowisku naturalnym przyczynia się do powstania oddziaływań między ksenobiotykiem a cząstkami gruntu. Następuje adsorpcja na cząstkach gleby, rozpuszczanie się w wodzie i odparowanie do powietrza gruntowego oraz degradacja biologiczna i chemiczna. Na biodegradowalność tych zanieczyszczeń ma też duży wpływ bardzo zróżnicowany skład.

Oczyszczanie tak skażonej gleby najczęściej odbywa się z użyciem biopreparatów, czyli mieszanek kultur mikroorganizmów zdolnych do degradacji poszczególnych związków produktów rafineryjnych. W skład takiego biopreparatu zazwyczaj wchodzą bakterie z rodzajów: Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes, Corynebacterium, Bacillus. Jednak w biodegradacji biorą również udział rośliny wyższe i grzyby. Wynika to ze zwiększonego skupiska mikroorganizmów w strefie korzeniowej roślin wyższych. Proces biodegradacji może być prowadzony zarówno w warunkach beztlenowych jak i tlenowych.

Poszczególne węglowodory są w różnym stopniu biodegradowalne. Najłatwiej są rozkładane związki o prostej, długołańcuchowej budowie, a najtrudniej węglowodory aromatyczne zwłaszcza te wielopierścieniowe (np. benzo[a]piren, rys. obok) i ich chlorowcopochodne.

Kontakt, pozostających w fazie wodnej, drobnoustrojów z zazwyczaj rozpuszczonym w tłuszczu substratem umożliwiają produkowane przez ten organizm biosurfaktanty. Są to środki powierzchniowo czynne, których własnością jest to, że powodują zmniejszenie napięcia powierzchniowego cieczy co umożliwia tworzenie się emulsji.

Jedną z technik wykorzystanych do oznaczeń w tym doświadczeniu jest chromatografia gazowa GC.

„Chromatografia gazowa to analityczna technika chromatograficzna, w której fazą nośną jest gaz (najczęściej hel, argon, coraz rzadziej wodór). Technika ta umożliwia procentowe ustalenie składu mieszanin związków chemicznych, w których występuje ich nawet kilkaset. Stosując klasyczną detekcję umożliwia przybliżoną identyfikację składników mieszaniny, pełną identyfikację z detektorem masowym.

Chromatografia gazowa jest najczęściej stosowaną metodą do szybkiej analizy złożonych mieszanin związków chemicznych oraz oceny czystości tych związków, zarówno w przemyśle jak i w rozmaitych laboratoriach. Chromatografię gazową stosuje się m.in. w:

1. przemyśle petrochemicznym - np. do oceny składu chemicznego produkowanej benzyny;

2. ochronie środowiska - do oceny stopnia zanieczyszczenia, gleby, powietrza i wody;

3. kryminalistyce - np. do analizy źródła pochodzenia narkotyków na podstawie składu zawartych w nich zanieczyszczeń;

4. kontroli antydopingowej - gdzie aparaty GC-MS (Gas chromatography - mass spectrometry) stanowią podstawową metodę wykrywania niedozwolonych substancji w krwi, pocie, moczu i ekstrakcie z włosów sportowców.”

Wykonanie ćwiczenia

Biodegradacja prowadzona była w trzech hodowlach: z użyciem szczepu G-21 - Achronobacter xylosoxidans, szczepu S - 7 - Gordonia alkanivorans oraz z użyciem konsorcjum obu tych szczepów. Substratem był olej napędowy w ilości 6% wagowych podłoża. Źródło azotu stanowił chlorek amonu.

Hodowla prowadzona była metodą wstrząsaną w temperaturze 30°C w czasie 2 tygodni.

Pomiar biomasy

Pomiar biomasy został wykonany metodą wagową. W tym celu zawiesinę hodowlaną poddaliśmy wirowaniu w wirówce Backmana - 18000 obr./min. w 4°C, w czasie 20 minut. Płyn pohodowlany zlaliśmy, a do osadu biomasy dodaliśmy 10 ml mieszaniny aceton-heksan (3:1) i wymieszaliśmy. Całość odsączyliśmy na filtrze bibułowym. Pozostałą na sączku biomasę wysuszyliśmy do stałej masy.

Uprzednio zważony sączek został zważony razem z wysuszoną biomasą.

m_S - masa sączka = 0,293 g

m_SB - masa sączka z wysuszoną biomasą = 0,319 g

Masa biomasy (m_B):

m_B = 0,319 - 0,293 = 0,026 g

400 ml to ilość podłoża hodowlanego. W 1 litrze podłoża mamy więc:

0,026 g * 25 = 0,65 g / litr

Oznaczanie aktywności emulgacyjnej bakterii prowadzących proces biodegradacji - szczepu G-21 - Achronobacter xylosoxidans.

Zasada tego oznaczenia polega na określeniu zmian absorbancji w mieszaninie płynu po hodowli (pozbawionego biomasy) w obecności substratu węglowodorowego.

Po odwirowaniu zawiesiny hodowlanej i oddzieleniu powstałych dwóch faz ciekłych, pobieramy 3 ml fazy wodnej do naczynka. Płyn pohodowlany musi być pozbawiony biomasy.

Skład mieszaniny reakcyjnej:

- 3 ml płynu pohodowlanego pozbawionego biomasy

- 0,5 ml 0,05M buforu Tris-HCl o pH = 7,2

- 0,25 ml 1M MgSO₄

- 0,1 ml oleju napędowego

- 0,3 ml wody destylowanej

Całość została poddana wytrząsaniu w ciągu 1 godziny w temperaturze 30°C na wytrząsarce. Uzyskany w tym czasie stopień zemulgowania węglowodorów oznacza się na drodze pomiaru zmętnienia zawiesiny przy długości fali λ = 540 nm. Próbę odniesienia stanowi woda destylowana.

Wynik pomiaru (w mili jednostkach absorbancji):

0,208 mUA

Oznaczenie stopnia wykorzystania węglowodorów

Zużycie węglowodorów ogółem (S_WO)

Zawartość węglowodorów ogółem w próbach po dwutygodniowej hodowli szacuje się metodą wagową. Z powierzchni płynu pohodowlanego po wirowaniu zebraliśmy przy pomocy pipety automatycznej warstwę nie zużytych w hodowli węglowodorów do wcześniej zważonej probówki. Probówkę z zebranym olejem zważyliśmy.

Masa zebranej fazy organicznej świadczy o stopniu zużycia węglowodorów ogółem.

Zużycie węglowodorów ogółem obliczyliśmy na podstawie poniższego wzoru:

S_WO = 100% - (m_P * 100% / m_K )

Gdzie:

m_P - masa nie zdegradowanego oleju

m_K - masa próby kontrolnej

m_K = 2,444 g

m_P = m_{probówki z olejem} - m_{pustej probówki} = 6,861g - 5,127 g = 1,734 g

S_WO = 100% - (1,734g * 100% / 2,444g) = 100% - 70,9 = 29,1% (29 %)

Stopień biodegradacji heksadekanu (S_H)

Próbka z olejem, który nie został zdegradowany została poddana chromatografii gazowej, co posłuży do oceny stopnia biodegradacji hesadekanu.

Z otrzymanego chromatogramu odczytaliśmy dane potrzebne do obliczeń. Czas retencji dla piku heksadekanu wyniósł 24,509.

Stopień biodegradacji heksadekanu obliczyliśmy na podstawie następującego wzoru:

S_H = 100% - (A_HP * 100% / A_HK )

A_HP - pole powierzchni pod pikiem heksadekanu = 983460

A_HK = 1914961

S_H = 100% - (983460 * 100% / 1914961 ) = 100% - 51,36 = 48,64% (49%)

Wyniki pomiarów i obliczeń wszystkich grup zamieściliśmy w poniższej tabeli:

Szczep	Namnożenie biomasy [g/l]			Zdolność emulgacyjna [mVA]			Zużycie węglowodorów ogółem SWO [%]			Stopień biodegradacji heksadekanu SH [%]
G -21	0,87	0,47	0,65	0.965	0,120	0,208	32	33	29	49	51	49
S - 7	1,22	1,75	1,05	0,319	0,125	0,970	45	53	40	22	27	49
konsorcjum G- 21 + S - 7	1,97	1,55		1,666	1,307		31	40		56	43

Wnioski:

Większa ilość biomasy świadczy o tym, że dany szczep lepiej się rozwijał. Szep G-21 osiągnął najmniejsze namnożenie. Wiąże się z tym najmniejsze zużycie węglowodorów ogółem przez ten szczep. Konsorcjum rozwinęło się w największej ilości.

Największą zdolnością emulgacyjną charakteryzuje się konsorcjum szczepów G-21 i S-7. Zdolność emulgacyjna jest tym większa im większa jest ilość surfaktantów, dlatego konsorcjum ma przewagę nad pojedynczymi szczepami.

Konsorcjum jest najlepszym degragentem. Szczep G-21 posiada lepsze właściwości niż szczep S-7 - większą zdolność emulgacyjną oraz większy stopień biodegradacji heksadekanu.

---