Piotr Świątczak

Tomasz Ramięga

Marcin Kopciara

Ćwiczenie 1

BIODEGRADACJA MATERIAŁÓW CELULOZOWYCH

1. Wstęp teoretyczny

Celuloza jest wielocukrem strukturalnym, wchodzącym w skład ściany komórkowej roślin. Połączona z hemicelulozami i ligninami jest zorganizowana w niezwykle zwartą i trwałą strukturę. Zawartość celulozy w odpadach jest zróżnicowana i wynosi 20-95%. Ze względu na rosnący deficyt białka zostały opracowane specjalne techniki mikrobiologiczne pozyskiwania go z niekonwencjonalnych źródeł. Białko pozyskuje się się się z odnawialnych, jak i nieodnawialnych surowców, prowadząc biosyntezę SCP i MBP. SCP to białka organizmów jednokomórkowych, czyli biomasa otrzymywana jest w procesie hodowli bakterii, grzybów, drożdży i glonów na substratach nie zawierających frakcji stałych. Biomasę mikrobiologiczną MBP otrzymuję się w procesie hodowli drobnoustrojów na substratach nierozpuszczalnych, np. makulatura. SCP i MBP oprócz białka dostarczają również węglowodanów, tłuszczy, witamin i soli mineralnych.

Możliwość utylizacji celulozy można przedstawić na schemacie:

enzymy, kwas fermentacja

celuloza-----------------> glukoza------------------> Etanol,paliwo, chemikalia,produkty biotechnologiczne farmaceutyki.

2. Wykonanie ćwiczenia:

2.1 Oznaczenie ilości cukrów redukujących obecnych w płynie po hodowlanym metodą Somogyi-Nelsona:

Do 1ml płynu po hodowlanego odpowiednio rozcieńczonego (50x) dodaliśmy 1ml odczynnika miedziowego i gotowaliśmy we wrzącej łaźni wodnej przez 10min. Po ostudzeniu dodaliśmy 1ml odczynnika Nelsona, wymieszaliśmy i odczytaliśmy absorbancję przy długości fali 520nm.

Zawartość cukrów redukujących wyliczyliśmy ze wzoru:

C = 0,3234 x E x R , gdzie

C- ilość cukrów redukujących [μmol/ml]

E- absorbancja

R- rozcieńczenie płynu po hodowlanego

0,03234- przelicznik wynikający z krzywej wzorcowej wykonanej dla glukozy.

Absorbancja E=0,01

C = 0,3234x0,01x50 = 0,1617 [μmol/ml]

2.2

Oznaczanie aktywności endo-1,4-β-glukanazy na podstawie ilości cukrów redukujących uwolnionych z CM-celulozy metodą Somagyi-Nelsona.

Do 0,5ml rozcieńczonego filtratu enzymu (200 razy rozcieńczony) dodajemy 0,5 ml roztworu CMC (0,4 % roztwór w buforze octanowym 0,05M o pH4,4) a następnie inkubujemy 15 minut w temperaturze 50^oC. Następnie dodaliśmy do probówki 1ml odczynnika miedziowego i gotowaliśmy próbę przez 10 minut. Po tym czasie schłodziliśmy próbę i dodaliśmy 1ml odczynnika Nelsona. Absorbancję badamy przy λ=520nm. Jednocześnie wykonujemy próbę odniesienia, w której roztwór enzymu zastępujemy wodą destylowaną.

Wynik i Obliczenia:

Absorbancja E=0,035

Aktywność obliczamy ze wzoru poniżej

Gdzie: A aktywność

E absorbancja przy długości fali 520nm

R rozcieńczenie filtratu

C ilość cukrów redukujących w filtracie [^µmol/_ml]

t czas inkubacji [min]

Wniosek:

Metoda stosowana do obliczeń jest metodą bardzo czułą. Uzyskane wyniki w znacznym stopniu odbiegają od rzeczywistych wartości. Są o rząd wielkości za niskie. Błędy wynikają z niedokładności wykonania oznaczeń jak i z niedokładności odczytów.

2.3

Scukrzanie odpadów celulozowych

Wykonanie:

Scukrzanie zostało przeprowadzone w jednej z prób z odpadem (przed zajęciami) i było prowadzone w temperaturze 50°C w czasie 58 godzin. Wcześniej próby z danym odpadem poddane zostały enzymatycznej hydrolizie.

Po scukrzaniu w każdej próbie oznaczono zawartość cukrów redukujących metodą Somogyi-Nelsona w ten sam sposób jak w ćwiczeniu nr 1. Zawartość cukrów redukujących została również oznaczona w próbach przed scukrzeniem.

Przygotowanie prób do pomiaru (odpad - słoma z wiesiołka):

1 próba

(kontrolna) - 1 ml H₂O + 1 ml odczynnika miedziowego

2 próba - słoma z wiesiołka przed scukrzeniem (R = 20x)

3 próba - słoma z wiesiołka po scukrzeniu (R = 100x)

Wyniki pomiaru absorbancji:

2 próba - E = 0,065 przed scukrzeniem

3 próba - E = 0,085 po scukrzeniu

Obliczenia:

Stopień scukrzenia obliczamy ze wzoru:

S_C = ΔC * V * 100 *0,9 * 180 / 10⁶ * m

gdzie:

S_C - stopień scukrzenia [%]

ΔC - różnica między ilością cukrów redukujących po i przed hydrolizą [μM/ml]

V - objętość próbki [ml]

m - sucha masa odpadu użytego do scukrzania[g]

0,9 - przelicznik wynikający z przyłączenia cząsteczki wody do wiązania glikozydowego w

Produktach degradacji celulozy

ΔC = C_po - C_przed

C_po = 0,3234 * E * R = 0,3234 * 0,085 * 100 = 2,75 [μM/ml]

C_przed = 0,3234 * E * R = 0,3234 * 0,065 * 20 = 0,42 [μM/ml]

ΔC = 2,75 - 0,42 = 2,33 [μM/ml]

V = 15 ml

m = 0,2 g

S_C = 2,33μM/ml *15ml * 100 * 0,9 * 180 / 10⁶ * 0,2 g = 2,83%

Wnioski:

Stopień scukrzenia słomy z wiesiołka okazał się niski. Jest to związane z niewielką zawartością celulozy w tym surowcu oraz z jego niewielkim rozdrobnieniem. Podobne wyniki obliczeń uzyskano dla pozostałych substratów, z wyjątkiem błonnika pszennego. Jest to spowodowane tym, że błonnik charakteryzuje się bardzo wysoką zawartością celulozy.

Wyniki zamieszczono w tabeli wraz z innymi wynikami.

Grupy	Cukry redukujące [^µmol/ml ]	Aktywność [^µmol/ml ×min]	Substrat	Stopień scukrzenia [%]
1	0,404	0,534	Kiełki słodowe		7,8
2	2,18	1,58					9,68
3	0,1617	0,291			Słoma z wiesiołka		2,83
4	1,45	1,37					3,45
5	1,86	1,294			Paździerze lniane		0,23
6	0,4851	0,74					0,2
7	0,3234	1,189			Błonnik pszenny		67,1
8	1,78	2,08					67,8

+ 1 ml odczynnika miedziowego → łaźnia wodna, 10 min., 100°C

→ pomiar absorbancji, 520 nm

---