33

dehydrogenaza

glukozo-6-fosforanowa

OH

H

H

OH

H

H

HO

C

C O

C

C C

CH2O

O

P

lakton kwasu 6-fosfoglukonowego

glukozo-1-fosforan

OH

H

H

H

OH

H

H

HO

C

C O

C

C C

CH2OH

O P

fruktozo-6-fosforan

C

O

C

C C

H

H

OH H

OH

OH

P OH2C CH2OH

izomeraza

heksozofosforanowa

fosfoglukomutaza

glukozo-6-fosforan

OH

OH

H

H

H

OH

H

H

HO

C

C O

C

C C

CH2O P

ROZDZIAŁ 2. ELEMENTY ENZYMOLOGII

Enzymy są swoistymi białkami, katalizującymi zachodzące w przyrodzie ożywionej reakcje

chemiczne. Pod pojęciem katalizy enzymatycznej rozumie się zwiększenie szybkości reakcji termodynamicznie

możliwych (nawet milionkrotne), jedynie poprzez zmniejszenie energii aktywacji cząsteczek

substratu bez naruszania stanu końcowej równowagi. Enzym nie wchodzi w skład końcowych

produktów reakcji i zasadniczo pozostaje w stanie nie zmienionym po zakończeniu reakcji.

Zdecydowana większość dotychczas poznanych enzymów ma budowę białkową. Niektóre z nich

są białkami prostymi, zbudowanymi wyłącznie z aminokwasów (np. większość hydrolaz). Jednak w

przeważającej liczbie przypadków składają się one z części białkowej (apoenzymu) i niebiałkowej

(witamin i ich pochodnych, jonów metali oraz małocząsteczkowych związków organicznych) tzw.

grup pros t etyc znych i koenzymów. Pod nazwą grupa pros t etyc zna rozumie się

różnorodne niebiałkowe związki chemiczne (sacharydy, żelazoporfiryny) i jony metali luźno związane

z apoenzymem oraz silnie związane z częścią białkową koenzymy. Koenzymy są witaminami lub

ich pochodnymi. Połączenie koenzymu z apoenzymem określa się mianem holoenzymu. Trwałość

tego połączenia jest różna; bardzo często koenzym łatwo oddysocjowuje od apoenzymu.

Apoenzym jest czynny wyłącznie w połączeniu z koenzymem lub grupą prostetyczną i

decyduje o swoistości substratowej enzymu, a niekiedy również kierunkowej, np. dekarboksylację i

transaminację aminokwasów katalizują enzymy o różnych apoenzymach i tych samych koenzymach.

Dla porządku należy wspomnieć, iż aktywność biokatalityczną mogą również wykazywać cząsteczki kwasów

nukleinowych (Nagroda Nobla w 1989 roku dla G. Altmana i T. Czecha).

2.1. Ogólne właściwości katalityczne enzymów

Szczególną cechą enzymów jest ich duża specyficzność (określana także jako wybiórczość czy

swoistość) zarówno pod względem rodzaju katalizowanej reakcji chemicznej - tzw. specyficzność

kierunkowa, jak i wobec związków (substratów) biorących w niej udział - tzw. specyficzność

substratowa. Swoistość idzie często tak daleko, że enzym rozróżnia odmianę stereoizomeryczną

substratu, działając wyłącznie na jedną z nich - tzw. stereospecyficzność. Nic więc dziwnego, iż

enzymy mogą katalizować w sposób wybiórczy takie przekształcenia, których trudno lub wręcz nie

można dokonać w inny znany sposób.

Specyficzność kierunkowa. Określony enzym katalizuje na ogół pojedynczą reakcję lub grupę

ściśle spokrewnionych przemian chemicznych. Dokonuje on niejako selekcji wśród możliwych

reakcji, wybierając jedną z nich. Na przykład cząsteczka glukozo-6-fosforanu może w komórce ulec

wielu różnym przemianom, w tym utlenieniu (do laktonu kwasu 6-fosfoglukonowego), izomeryzacji

(do fruktozo-6-fosforanu) czy też mutarotacji (do glukozo-1-fosforanu).

Każda z tych reakcji jest katalizowana przez inny enzym: pierwszą katalizuje dehydrogenaza

glukozo-6-fosforanu, drugą - izomeraza heksozofosforanowej, wreszcie trzecią - fosfoglukomutaza.

34

Specyficzność substratowa. Od specyficzności działania enzymu należy odróżnić jego

specyficzność substratową, polegającą na katalizowaniu przez dany enzym przemiany chemicznej

tylko jednego określonego substratu lub ograniczonej ich liczby. Znane są enzymy, wykazujące

absolutną wybiórczość wobec substratu: np. ureaza działa tylko i wyłącznie na mocznik powodując

jego rozpad, dehydrogenaza metanolowa utlenia jedynie metanol. Jednakże nie wszystkie enzymy

wykazują tak daleko posuniętą specyficzność substratową, np. proteinazy, lipazy czy amylazy

hydrolizują większość swoich substratów tj. odpowiednio białek, lipidów oraz pochodnych α-glukanu

niezależnie od specyficznych cech budowy tych związków. O tych enzymach mówi się, że wykazują

szeroką specyficzność (są mało specyficzne). Ich przeciwieństwem są enzymy o wąskiej

specyficzności (wysoko specyficzne).

Stereospecyficzność. W Rozdziale 1 tego podręcznika omówiono zjawisko izomerii związków

chemicznych. Wiele enzymów rozróżnia izomery i wykazuje aktywność katalityczną wyłącznie w

stosunku do jednej z odmian izomerycznych związku lub też tworzy jedynie jedną z nich, np. cis lub

trans, α- lub β-, D- lub L-, itp. Klasycznym

przykładem jest dehydrogenaza bursztynianowa,

która przekształca bursztynian do fumaranu

(odmiana trans kwasu etenodikarboksylowego-

1,2). Kwas maleinowy (odmiana cis kwasu

etenodikarboksylowego-1,2) nie tylko, że nie

powstaje w tej reakcji, lecz ją hamuje.

Innym przykładem, który dobrze obrazuje zagadnienie stereospecyficzności enzymów, jest

α-glukozydaza. Ta hydrolaza działa na wszystkie α-D-glukopiranozydy, nie biorąc jednak udziału w

reakcjach hydrolizy innych glikozydów (np. β-D-glukopiranozydów, fruktofuranozydów, itp.). Z kolei

subtilizyna (serynowa proteinaza z B.subtilis) z mieszaniny racemicznej estrów

N-acetyloaminokwasów hydrolizuje jedynie formę L-aminokwasu.

Znane są enzymy wykazujące regioselektywność. Rozpoznają one miejsce w cząsteczce związku

chemicznego (np. atom węgla, grupę funkcyjną, itp.), w którym pod

działaniem enzymu następuje przekształcenie właściwe dla jego

specyficzności kierunkowej. Takie właściwości przejawiają m.in.

monooksygenazy, które mogą selektywnie wbudowywać atom tlenu w

jedno, ściśle określone miejsce cząsteczki, hydroksylując ją. Niektóre z

nich, hydroksylujące np. progesteron, mogą przejawiać jednocześnie

stereospecyficzność. To, czy hydroksylowanie nastąpi w pozycji  lub

 oraz w którym pierścieniu i przy którym atomie węgla zależy, z

jakiego drobnoustroju pochodzi enzym. Monooksygenazy bakterii

B.megaterium ATCC, jako jedne z nielicznych, hydroksylują

progesteron przy 15 atomie węgla w pozycji  i  Monooksygenazy

szczepu B.megaterium KM hydroksylują progesteron w kilku

pozycjach: 15  i , 6  oraz 11.

Natomiast tautomerazy, epimerazy lub Δ-izomerazy przekształcają jeden izomer w drugi.

Przykładem może być epimeraza UDP-glukozowa przekształcająca UDP-1-glukozę w UDP-1-

galaktozę.

2.2. Istota katalizy enzymatycznej

Według aktualnej wiedzy, katalityczne działanie enzymów związane jest ze zjawiskiem

międzycząsteczkowych oddziaływań. Enzym (E) i substrat (S) - ewentualnie substraty - tworzą

przejściowo połączenie ES, w którym na skutek specyficznych właściwości centrum katalitycznego

enzymu następuje aktywacja cząsteczki substratu z jednoczesnym osłabieniem niektórych jego wiązań

kowalencyjnych. Uaktywniony kompleks ES przekształca się w połączenie EP, gdzie P oznacza

produkt reakcji. W końcowym etapie połączenie EP rozpada

się na wolny enzym i produkt reakcji. Schematycznie reakcję

taką można zapisać równaniem:

Dokładne poznanie natury oddziaływań odpowiedzialnych za katalizę enzymatyczną jest

przedmiotem badań i rozważań w literaturze naukowej od wielu lat. Pionierami w tej dziedzinie byli

H2C COOH

H2C COOH

HC

CH

COOH

HOOC

bursztynian fumaran

FAD FADH2

dehydrogenaza

bursztynianowa

O CH3

Progesteron





C

O

15

11

6

,

E + S ES EP E + P

35

E. Fischer, pierwszy sugerujący komplementarność centrów aktywnych enzymów do substratów, oraz

L.Pauling, autor koncepcji silnej stabilizacji stanu przejściowego przez centrum aktywne. Od tego

czasu, pojawiało się wiele alternatywnych propozycji jak teoria naprężeń sterycznych, optymalnego

nałożenia orbitali, elektrostatycznego klucza i zamka, itp.

Jedno z bardziej nowoczesnych opracowań na temat czynników odgrywających rolę w katalizie

enzymatycznej zawarł w swojej książce Warshel*. Na drodze rozważań teoretycznych (półempirycznych)

dochodzi on do wniosku o dominującej roli oddziaływań o naturze elektrostatycznej w katalizie enzymatycznej.

Warshel rozpatruje następujące czynniki, które w różnych modelach teoretycznych proponowano jako źródło

aktywności katalitycznej enzymów:

 naprężenia steryczne;

 desolwatację reagentów;

 optymalne nakładanie orbitali (OS);

 wiązania wodorowe o niskiej barierze przeniesienia protonu (LBHB);

 efekty dynamiczne;

 zmiany entropii w wyniku wiązania z enzymem,

 oddziaływania elektrostatyczne w preorientowanym, polarnym centrum aktywnym.

Zmiany energii swobodnej podczas reakcji niekatalizowanej i enzymatycznej można przedstawić

schematycznie jak na rysunku obok. Wielkość energii swobodnej tworzenia stanu przejściowego

wyznacza barierę energetyczną dla całej

reakcji. Ta bariera dla reakcji

enzymatycznej jest wyraźnie niższa (o ΔGE)

niż bariera energetyczna dla reakcji

niekatalizowanej. Enzymy: zmniejszając

energię swobodną tworzenia stanu

przejściowego znacznie przyspieszają

przekształcenie substratów w produkty.

2.2.1. Mechanizm działania enzymów

W czasie reakcji enzymatycznej

cząsteczka substratu jest wiązana w

określonym obszarze do cząsteczki enzymu

w tzw. centrum aktywnym, przez co tworzy się kompleks enzym-substrat. Dzięki specyficznemu

rozkładowi grup chemicznych w centrum, enzym oddziałuje na ugrupowania chemiczne substratu

rozluźniając konkretne wiązanie chemiczne. W wyniku rozerwania tych wiązań substrat przekształca

się w produkt, który uwalniany jest z kompleksu z enzymem. Enzym po powrocie do formy

pierwotnej (w enzymach złożonych po przyłączeniu przenoszonych grup do innego związku) tworzy

nowy kompleks z następną cząsteczką substratu itd.

Mechanizm łączenia enzymu z substratem tłumaczy się obecnie indukowanym dopasowaniem,

polegającym na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu i przekształceniu go w produkt. Przy tym

enzym może zniekształcić substrat wymuszając

w nim konformację podobną do stanu

przejściowego. Przykładem może być wiązanie

glukozy z heksokinazą.

Centrum aktywne enzymów. Centrum aktywne to określony obszar cząsteczki białka

enzymatycznego, w którym podczas katalizy następuje wiązanie substratu i następnie jego

przekształcenie w produkt względnie produkty reakcji. Specyficzność kierunkowa i substratowa

enzymów, a także wiele ich właściwości, zdeterminowanych jest budową centrum aktywnego.

Przyjmuje się, że centrum aktywne enzymów zlokalizowane jest w głębi globularnej cząsteczki białka

w kieszonce kształtem przypominającej szczelinę lub rowek. Obszar centrum aktywnego w

przeważającej ilości tworzą reszty aminokwasów o właściwościach hydrofobowych, a co za tym idzie,

panują w tym obszarze warunki hydrofobowe. Tak więc, jest to mikrośrodowisko o małej stałej

* [Warshel, A.: Computer Modelling Of Chemical Reactions In Enzymes And Solutions", John Wiley & Sohns,

Inc., New York, Chichester, Brisbane, Toronto and Singapore, 1991 ]

E + S E S

Postęp reakcji

Energia swobodna

stan przejściowy

ΔGE

produkty

substraty

reakcja enzymatyczna

36

dielektrycznej, a stąd o zwielokrotnionych oddziaływaniach elektrostatycznych. Dzięki temu możliwe

jest rozluźnienie określonych wiązań kowalencyjnych w cząsteczce substratu i ich przekształcenie w

inne układy wiązań.

Aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego - z uwagi na funkcję, jaką pełnią - dzieli się

na cztery kategorie:

1. aminokwas lub a m i n o k w a s y b e z p o ś r e d n i o d z i a ł a j ą c e ; w enzymach złożonych ich

rolę pełnią koenzymy lub grupy prostetyczne,

2. a m i n o k w a s y w s p o m a g a j ą c e ,

3. aminokwa sy kont aktowe , zwane również w i ą ż ą c y m i ,

4. aminokwa sy pomocni c ze .

Aminokwa sy pomocni c ze nie biorą bezpośredniego udziału w katalizie, lecz niezbędne są

do utrzymanie właściwej konformacji przestrzennej pozostałych aminokwasów centrum aktywnego

(można je traktować, jako czynniki strukturotwórcze centrum aktywnego).

Aminokwa sy kont aktowe (w i ą ż ą c e ) odpowiedzialne są za rozpoznanie substratu i

„wciągniecie” go do kieszonki centrum aktywnego. Z reguły są zlokalizowane na obrzeżach

kieszonki. Odpowiedzialne są za specyficzność substratową enzymów.

Rola a m i n o k w a s u b e z p o ś r e d n i o d z i a ł a j ą c e g o i a m i n o k w a s ó w w s p o m a g a j ą c y c h

zostanie wyjaśniona na przykładzie centrum katalitycznego endopeptydaz serynowych. Enzymy te

hydrolitycznie rozszczepiają wiązania peptydowe w białkach. Omawiane aminokwasy zlokalizowane

są w głębi kieszonki; w przestrzeni znajdują w bliskiej od siebie odległości przyjmując z góry ściśle

określoną konfigurację (tak, jak to pokazano na rysunku).

Mechanizm działania centrum katalitycznego proteinaz serynowych (opis w tekście).

W centrum katalitycznym wszystkich proteinaz serynowych występuje triada aminokwasów.

Aminokwasem bezpośrednio działającym jest seryna, która w subtilizynach zajmuje pozycję 221 w

łańcuchu polipeptydowym, a np. w chymotrypsynie 195. Aminokwasami wspomagającymi są

histydyna i kwas asparaginowy. W środowisku alkalicznym zdysocjowana, silnie ujemna grupa

karboksylanowa rodnika aspartylowego wywołuje efekt indukcyjny, który w wyniku rezonansu

przenosi się poprzez rodnik imidazolowy histydyny i na azocie 3 pojawia się silny ładunek ujemny; w

konsekwencji wodór grupy hydroksylowej seryny zostaje przeniesiony na azot i jednocześnie

powstaje ujemny jon alkoholanowy seryny. Jeżeli w jego pobliżu znajdzie się odpowiednio ustawiony

przestrzennie węgiel wiązania peptydowego - naładowany dodatnio - to oba przeciwnie naładowane

atomy zaczną się zbliżać do siebie. Na skutek silnych oddziaływań elektrostatycznych panujących w

tym obszarze wiązanie peptydowe ulegnie rozerwaniu. Proton z cząsteczki wody przyłączy się do

atomu azotu grupy aminowej i ten fragmentu łańcucha peptydowego odłączy się od centrum

Asp

CH2

C

O O-

32

His

H N N

CH2

64

Ser

221

CH2

H O

Asp

CH2

C

O OH

32

His

N N

CH2

H

64

Ser

221

CH2

OC

NH

R2

R1

O δ -

δ+

-

Ser

221

CH2

O

Ser

221

CH2

O C

R2

O

H2O

OH

-

R2 COOH

R1 NH2

+

-

Ser

221

CH2

O

37

Lip

S

S

aktywnego. Drugi fragment łańcucha peptydowego przejściowo utworzy wiązanie estrowe z resztą

seryny centrum aktywnego, by po chwili ulec hydrolizie pod działaniem wolnej grupy OH- i też

oddzieli się od centrum aktywnego proteinazy.

2.2.2. Koenzymy i grupy prostetyczne.

W enzymach złożonych rolę aminokwasu bezpośrednio działającego pełnią koenzymy lub grupy

prostetyczne. Spełniają one rolę przenośników elektronów, atomów lub niewielkich grup

chemicznych. Biorą udział w 2 kolejnych reakcjach enzymatycznych: w pierwszej pobierają z jednego

substratu grupę chemiczną, w drugiej oddają ją drugiemu substratowi, odtwarzając się w pierwotnej

postaci, po czym proces się powtarza. Przenoszenie takie może również odbywać się w obrębie tej

samej cząsteczki i mamy wtedy do czynienia z izomeryzacją substratu. Trwałość połączenia

apoenzymu z koenzymami jest różna; jeśli koenzym łatwo dysocjuje, reakcje przenoszenia grup

chemicznych na koenzymy i z koenzymów katalizuje układ złożony z 2 enzymów o wspólnym

koenzymie; jeśli koenzym jest związany z enzymem trwale (pełniąc rolę grupy prostetycznej), enzym

ten katalizuje kolejno obie reakcje. Uogólniając, niebiałkowe składniki enzymów można traktować,

jako kosubstraty reakcji enzymatycznej. W tabeli 2.1. zestawiono ważniejsze koenzymy i grupy

prostetyczne, których budowa chemiczna i mechanizm działania zostaną omówione dalej.

Tabela 2.1. Ważniejsze koenzymy i grupy prostetyczne

Nazwa koenzymu lub grupy prostetycznej Skrót Przenoszone grupy lub

charakterystyczna cecha

Koenzymy oksydoreduktaz

Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy

Fosforan dinukleotydu

nikotynamidoadeninowego

Dinukleotyd flawinoadeninowy

Mononukleotyd flawinowy

Metaloflawoproteidy

Flawoproteidy transportujące elektrony

Ubichinon

Liponian

Porfiryny

Koenzymy transferaz

Adenozynometionina

Adenozynotrifosforan

Biotyna

Difosfotiamina

Fosforan pirydoksalu

Koenzym A

Koenzym B12

Kwas foliowy

Siarczan fosfoadenilowy

Urydynodifosforan

NAD

NADP

FAD

FMN

Me-Fp

ETF

Q

-

-

ATP

-

DPT

TPP

CoASH

B12

FH4

PAPS

UDP

Atomy wodoru i epimeryzacja

Atomy wodoru

Atomy wodoru i koenzym oksydaz

Atomy wodoru

Transport elektronów

Transport elektronów

Transport elektronów

Atomy wodoru i grupy acylowe

Cytochromy, oksydaza cytochromowa

koenzym katalazy i peroksydaz

Grupy metylowe

Grupy fosforanowe, pirofosforanowe i

AMP

CO2 (koenzym karboksylaz)

Grupy aldehydowe lub dekarboksylacja

Przemiany aminokwasów (w tym

deaminacja)

Grupy acylowe

Wewnątrzcząsteczkowe przeniesienie

grupy -COOH

Grupy formylowe, hydroksymetylowe,

formimidowe

Reszta kwasu siarkowego

Grupy glikozylowe

38

Koenzymy i grupy prostetyczne oksydoreduktaz

Nukleotydy nikotynamidowe. Koenzymem wielu dehydrogenaz, czyli enzymów odrywających

lub przyłączających atomy wodoru do substratów, jest dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+)

lub jego fosforan - NADP+. Jak wskazuje nazwa, koenzymy te są dinukleotydami

zbudowanymi z nukleotydu adeninowego i nukleotydu nikotynamidowego lub jego

fosforanu. Podstawowym składnikiem nukleotydu nikotynamidowego jest amid

kwasu nikotynowego. Kwas nikotynowy, (znany także jako niacyna), jest pochodną

pirydyny i jest jedną z witamin z grupy B o nazwie witamina PP.

Niedobór witaminy PP w organizmie człowieka powoduje zaburzenia czynności przewodu pokarmowego

oraz ośrodkowego układu nerwowego a także powoduje zmiany skórne znane jako pelagra. Kwas nikotynowy w

wystarczających dla człowieka ilościach występuje w mięsie, rybach oraz nasionach zbóż. Dzienne

zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi około 30mg.

Postać utleniona dinukleotydu nikotynamidoadeninowego przedstawiana jest skrótem NAD+, a

jego forma zredukowana NADH + H+. Umownie, dla wygody, dopuszcza się również symboliczne

zapisy NAD (zamiast NAD+) i NADH2 (zamiast NADH+H+).

Poznano przeszło 200 dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP. Właściwości i działanie

obu koenzymów jest analogiczne. Stężenie NAD w komórkach jest znacznie większe niż NADP i stąd

dehydrogenazy sprzężone z NAD są liczniejsze. Ogólnie można przyjąć, że NAD pełni w żywej

komórce rolę akceptora wodoru, natomiast jego fosforan jest donorem wodoru (pełni rolę reduktora).

W wielu przemianach enzymatycznych oba koenzymy mogą być nawzajem wymieniane. Ale znane są

przemiany, w których różnice pomiędzy NAD i NADP są bardzo wyraźne. Np. dehydrogenaza

alkoholowa z NAD (EC 1.1.1.1) jest 10000 razy aktywniejsza niż z NADP (EC 1.1.1.2); stąd

rozróżnienie w klasyfikacji enzymów. Istnieje możliwość wymiany H pomiędzy obu koenzymami:

Zredukowane formy NADH2 - wyjątkowo również NADPH2 - w żywych komórkach

regenerowane (utleniane) są w łańcuchu oddechowym. Ale NADH2 może też regenerować się w

reakcjach, w których staje się donorem wodoru

(w tym, jako donor wodoru dla oksygenaz z

pod-podklas EC 1.14.12. i EC 1.14.13.).

Większość reakcji katalizowana przez

dehydrogenazy sprzężone z NAD jest

odwracalna. Jeżeli reakcja redukcji ma przewagę

nad reakcją utlenienia, enzym nazywa się reduktazą, np. przyłączenie atomów wodoru do podwójnego

wiązania w kwasie fumarowym katalizuje reduktaza fumaranowa (sprzężona z NAD - EC 1.3.1.6).

Identyczną reakcję tyle, że biegnącą głownie w przeciwnym kierunku katalizuje dehydrogenaza

bursztynianowa (sprzężona z FAD - EC 1.3.99.1).

Swoistość substratowa dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zależy od rodzaju

apoenzymu. Nie jest ona jednak absolutna. W wielu przypadkach wyraża się bardzo dużymi różnicami

N

C

O

NH2

amid kwasu

nikotynowego

dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD)

i jego fosforan (NADP)

P P

+

N

CONH2

OH HO

CH2O

O

O

OH OH

OH2C

( P )

N

N

N

N

NH2

N

Ryb

CONH2

H H

P P Aden

N

CONH2

Ryb P P Aden

+ + H+

XH2 X

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2

przez NAD

NAD NADH + H+

NADPH2 + NAD NADP + NADH2

transdehydrogenaza

EC 1.6.1.1

NADH+H+ NAD

reduktaza fumaranowa

H2C COOH

H2C COOH

kwas bursztnowy

HC

CH

COOH

HOOC

kwas fumarowy (EC 1.3.1.6)

39

H

ryboflawina

N

N N

NH

H3C

H3C

CH2

O

O

CHOH

CHOH

CHOH

CH2O

Lip

S

S

szybkości katalizowanych reakcji, np. dehydrogenaza aldehydu fosfoglicerynowego utlenia również

aldehyd glicerynowy, ale około 1000 razy wolniej.

Apoenzymy licznych dehydrogenaz sprzężonych z NAD lub NADP zawierają związane jony

metali Mg2+, Zn2+, Mn2+. Jony te są aktywatorami działania tych dehydrogenaz. Np. jony Mg2+ lub

Zn2+ odgrywają ważną rolę podczas utleniania alkoholi, ułatwiając powstawanie jonu

alkoholanowego.

Niektóre dehydrogenazy sprzężone z NAD lub NADP podczas swojego „właściwego” działania, czyli

utleniania substratu mogą równocześnie prowadzić do jego d e k a r b o k s y l a c j i . Takiej dekarboksylacji ulegają

tylko α-ketokwasy lub α-hydroksykwasy. Utlenianie α-ketokwasów połączone z ich dekarboksylacją nazywa się

α - o k s y d a c j ą i katalizowane jest przez u k ł a d y w i e l o e n z y m a t y c z n e (sprzężone z ,DPT, FAD,

CoASH i NAD). Przykładem jest przemiana pirogronianu do acetylo~SCoA katalizowana przez

d e h y dr og e na z ę p i r o g r o n i a n o w ą ( d e k a r b o k s y l u j ą c ą ) , o czym będzie mowa dalej. Natomiast

przykładem dekarboksylacji α-hydroksykwasów podczas ich utlenienia jest działanie dehydrogenaz

jabłczanowych (dekarboksylujących). Ogólnie znane są aż cztery dehydrogenazy jabłczanowe sprzężone z NAD

lub NADP, w tym trzy o właściwościach dekarboksylujących:

EC 1.1.1.37 - d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a - znana z cyklu Krebsa, sprzężona z NAD, utlenia jabłczan do

szczawiooctanu,

EC 1.1.1.38 - d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( s z c z a w i o o c t a n - de k a rb ok s y lu j ą c a ) - sprzężona z

NAD, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność

dekarboksylacji szczawiooctanu,

EC 1.1.1.39 - d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( d e k a r b o k s y l u j ą c a ) - sprzężona z NAD, podczas

utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; nie posiada zdolności dekarboksylacji

szczawiooctanu,

EC 1.1.1.40 - d e h y d r o g e n a z a j a b ł c z a n o w a ( s z c z a w i o o c t a n - d e k a r b o k s y l u j ą c a ) - sprzężona z

NADP, podczas utleniania jabłczanu, jednocześnie dekarboksyluje go; posiada zdolność

dekarboksylacji szczawiooctanu.

Nukleotydy flawinowe. W skład tych nukleotydów wchodzi rybof l awina . Związek ten

zbudowany jest z heterocyklicznej izoalloksazyny i przyłączonego do niej rybitolu,

pięciowodorotlenowego alkoholu, będącego pochodną rybozy. Ryboflawina jest witaminą B2.

Ryboflawina posiada charakterystyczne żółte zabarwienie. Jej niedobór w organizmie człowieka powoduje

zmiany chorobowe w obrębie jamy ustnej; m.in. pękanie kącików ust i śluzówki, obrzęki warg i ich łuszczenie się,

zmiany zapalne języka a także zaburzenia ze strony narządu wzroku. Duże ilości tej witaminy występują w

drożdżach, w ziarnach zbóż i jajach. Zapotrzebowanie człowieka wynosi 2mg na dobę.

Fosforan ryboflawiny - mononukl eotyd f l awinowy - zapisuje się symbolicznie FMN, a

jego połączenie z nukleotydem adeninowym - dinukl eotyd f l awinoadeninowy - oznacza się

skrótem FAD. Oba nukleotydy flawinowe są nierozerwalnie związane z odpowiednimi białkami

enzymatycznymi, tworząc f l awoprot e idy, będąc jednocześnie przykładem grup prostetycznych.

FMN i FAD są grupami prostetycznymi dehydrogenaz, przenoszących głównie atomy wodoru.

Ich cechą charakterystyczną jest zdolność odrywania atomów wodoru od dwóch sąsiadujących ze sobą

atomów węgla, tworząc podwójne wiązanie: -CH2-CH2-→ -CH=CH-. Przykładem może być

wspomniana już dehydrogenaza bursztynianowa (EC 1.3.99.1). Zredukowaną formę FAD

dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)

O

OH OH

N

N

N

N

NH2

OH2C

N

N N

NH

H3C

H3C

CH2

O

O

CHOH

CHOH

CHOH

CH2O P P

40

ubichinon (Q)

O

O

H3C

H3C CH3

( )n H

symbolicznie zapisuje się FADH2. Podobnie jak zredukowany NADH2, zredukowany FADH2 w

komórce regeneruje się (utlenia) w łańcuchu oddechowym.

Ale FMN i FAD mogą być również koenzymami oksydaz: enzymów posiadających zdolność

bezpośredniego przenoszenia oderwanych od substratu atomów wodoru na tlen - uaktywnianie

cząsteczki tlenu prowadzą in situ, tj. w miejscu zetknięcia się enzymu z cząsteczką tlenu. Reakcja ta

przebiega bez zmiany formy grup prostetycznych na ich formy zredukowane. Przykładem takiego

enzymu może być oksyda za aminowa

z a w i e r a j ą c a F A D (EC 1.4.3.4). Reakcję taką

symbolicznie zapisuje się z FAD ujętym w nawias

dla podkreślenia, że nie zmienia się jego forma po

zakończeniu reakcji. Dla podkreślenia roli FAD

lub FMN w tego typu reakcjach, nazywa się je kofaktorami reakcji utlenienia.

FAD jest również elementem składowym systemu enzymatycznego cytochromu

P450. Zredukowany FADH2 może z kolei być donorem wodoru dla oksygenaz z

podpodklasy EC 1.14.14.

Dość często apoenzym oksydoreduktaz, sprzężonych z FMN lub

FAD, zawiera w swojej budowie jony metali Fe2+, Zn2+ lub Mo2+, które

współdziałają podczas reakcji utleniania i redukcji; enzymy tego typu

nazywa się metaloflawoproteidami i oznacza symbolem Me-Fp.

Transportują one przede wszystkim elektrony.

Ubichinon (koenzym Q). Przenośnikiem atomów wodoru może być również ubichinon, zywany

też koenzymem Q. Związek ten pod względem budowy przypomina witaminy E i K, choć sam

witaminą nie jest, gdyż w komórkach zwierzęcych jest syntetyzowany (z tyrozyny). Łańcych boczny

zbudowany jest z jednostek izoprenoidowych. Ich liczba bywa rózna w zależności od źródła

pochodzenia ubichinonu. Np. ubichinon z serca świni ma ich 50, a z serca wołu 10, co zapisuje się

symbolicznie Q-50 i odpowiednio Q-10. Ilośc jednostek izoprenoidowych w ubichinonach

drobnoustrojowych waha się od 5 do 13.

Mechanizm przenoszenia atomów wodoru przez ubichinon polega na utlenianiu i redukcji

pierścienia chinonowego.

N

N N

NH

H3C

H3C

O

O

R

Fe2+

metaloflawoproteid

H2O

oksydaza

O2 (FAD)

+ + H2O2

R CH2 NH2 C

O

H

R NH3

aminowa

przez FAD

XH2 X

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2

FAD FADH2

N

N N

NH

H3C

H3C

O

O

rybitol P P Aden

N

N N

NH

H3C

H3C

O

O

rybitol

H

H

P P Aden

Q

O

O

H3C

H3C

R

CH3

QH2

H3C

H3C

R

CH3

OH

OH

XH2 X

mechanizm odrywania wodoru od substratu XH2

przez ubichinon

41

Ubichinon jako koenzym dehydrogenaz bądź reduktaz spotykany jest rzadko. Jednym z

nielicznych przykładów może być dehydrogena za NADH (ubi chinonowa ) -EC 1.6.5.3, która

katalizuje reakcję utlenienia NADH2 do NAD z jednoczesną redukcją ubichinonu do ubichinolu.

Ciekawym enzymem jest dehydrogena za me t anolowa (EC 1.1.99.8) znaleziona u niektórych

metylotrofów, której grupą prostetyczną jest ubichinonoproteina (kofaktor PQQ).

Natomiast ubichinon w komórkach pełni bardzo ważną rolę, będąc elementem składowym

ł a ń c u c h a o d d e c h o w ego.

Związki porfirynowe. Porfiryny to związki, w których 4 pierścienie pirolowe połączone są ze

sobą mostkami metinowymi (=CH-). Przy atomach węgla β (3 i 4) pierścieni pirolowych zamiast

atomów wodoru występują różne grupy

chemiczne (metylowe, winylowe, octanowe i

inne). W celu ujednolicenia zapisu związków

tego typu Fisher zaproponował symboliczny,

uproszczony ich wzór. Pominięto w nim mostki

metinowe a pierścienie pirolowe zaznaczano

kodem kreskowym. Pierścienie ponumerowano

cyframi rzymskimi od I do IV, atomy węgla w

pierścieniach od 1 do 8, a mostki metinowe

literami alfabetu łacińskiego od α do δ, jak to

przedstawiono na rysunku obok.

Z uwagi na możliwość podstawiania atomów wodoru 1-8 w pierścieniach pirolowych różnymi

podstawnikami, istnieje teoretycznie olbrzymia ilość izomerów pochodnych porfiryny. Jednakże w

naturalnych systemach biologicznych głównie występuje izomer typu III, w którym podstawniki przy

IV pierścieniu pirolowym są ułożone asymetrycznie w stosunku do innych pierścieni. Oznaczony i

nazwany jest on przez Fishera p r o t o p o r f i r y n ą I X . Izomer ten jest prekursorem me t a lopor f i ryn

wchodzących w skład hemoprot e in i chlorof i l i .

Me t a l o p o r f i r y n y to pochodne protoporfiryny IX z atomem metalu (żelaza, magnezu, miedzi)

centralnie wbudowanym w układ porfirynowy za pośrednictwem atomów azotu pierścieni pirolowych.

Metaloporfiryny z wbudowanym żelazem (hem i heminy) występują jako grupy prostetyczne w

hemoprot eina ch. Metaloporfiryny z wbudowanym Mg2+ są składnikami chlorof i lu.

Hemo p r o t e i n y to białka zawierające jako grupę prostetyczną hem lub heminę.

Hem to połączenie żelaza występującego na II stopniu utlenienia (Fe2+) z protoporfiryną IX.

Hem jest barwną grupą prostetyczną hemoglobiny i mioglobiny. W organizmach zwierząt,

hemoglobina - czerwony barwnik krwi - uczestniczy w transporcie tlenu, CO2 a także jonów

wodorowych. Mioglobina uczestniczy w transporcie tlenu w mięśniach i w jego magazynowaniu.

Hemi n y to połączenia protoporfiryny IX z jonem żelaza występującym na III stopniu utlenienia

(Fe3+). Heminy we wszystkich organizmach pełnią funkcję przenośników elektronów w łańcuchu

oddechowym (układ cytochromów), a także są grupami prostetycznymi katalaz i peroksydaz,

katalizując procesy utleniania. Powstają z hemoglobiny pod wpływem kwasu solnego, a reakcja ta

służy w medycynie sądowej do wykrywania śladów krwi.

HC

N

CH

N N

HC CH

N

porfiryna

I

II

III

IV

1 2

5

7

6

8

4





γ

δ

H H

3 3

I

IV II

III

1 2

4

6 5

7

8

symboliczny, uproszczony

zapis wzoru porfiryny

M =

P =

V =

CH3

CH=CH2

CH2 CH2 COOH

I

IV II

III

M V

M

M

M

V

P

P

I

IV II

III

M V

M

M

M

V

P

P

Fe2+

Fe2+

protoporfiryna IX hem

ferrochelataza

EC 4.99.1.1

enzymatyczna transformacja protoporfiryny IXw hem

42

fragment łańc

ń

ucha polipeptydowego

cytochromu c

Liz His

S S

Cys Ser Glu(NH2) Cys

miejsce przyłączenia heminy

N

CH3

HC CH

N

CH3

N

HOOC CH2 CH2

H3C

Fe+3

CH3

HOOC CH2 CH2

HC CH

N

CH2

H2C

CH2

CH2

hemina

cytochrom c

Cy t o c h r omy to hemoproteiny, które dzięki odwracalnej zmianie stopnia utlenienia żelaza

grupy heminowej (z Fe2+ na Fe3+) stanowią układ przenośników elektronów w łańcuchu oddechowym

w żywych organizmach. Na podstawie budowy chemicznej, widma absorpcyjnego i przede wszystkim

miejsca w łańcuchu oddechowym, cytochromy dzieli się na grupy: a, b i c (np. cytochromy b) oraz

podgrupy (np. cytochromy a3). Kompleks hemoprotein a + a3 jest enzymem znanym jako oksyda za

cytochromowa .

Ok s y d a z a c yt o c h r omu c (EC 1.9.3.1) to enzym będący kompleksem hemoprotein a i a3,

składający się z kilku łańcuchów polipeptydowych o różnej masie cząsteczkowej, 2 grup heminowych

oraz 2 atomów miedzi. Oksydaza cytochromowa jest końcowym enzymem łańcucha oddechowego;

aktywuje tlen atomowy do przyłączenia atomów wodoru, przenosząc na niego elektrony.

Ch l o r o f i l e , pochodne protoporfiryny IX, zielone barwniki występujące u fotosyntetyzujących

roślin, glonów i bakterii (bakteriochlorofil). Chlorofile pełnią rolę grupy prostetycznej chromoproteidu

zwanego chloroplastyną. Są to metaloporfiryny, zawierające wbudowany w centrum jon magnezu

(Mg2+). Połączone są wiązaniem estrowym z

fitolem. Rozróżnia się 4 rodzaje chlorofilu. U

wszystkich roślin wyższych i glonów

występuje chlorofil a (niebieskozielony, co

najmniej w 3 formach: P700, Ca680, Ca670 -

liczby oznaczają długość fali świetlnej, przy

której występuje maksimum absorpcji światła).

Chlorofil b - żółtozielony, występujący u

roślin wyższych i niektórych glonów. Chlorofil

c — występuje w małych ilościach w

czerwono zabarwionych roślinach wodnych

(m.in. z rodzaju Alternanthera), brunatnicach,

niektórych okrzemkach i wiciowcach.

Chlorofil d znajdowany jest u krasnorostów.

Chlorofil a absorbuje głównie światło

fioletowe i czerwone, oraz żółtozielone, chlorofil b absorbuje głównie światło niebieskie

i pomarańczowe. Chlorofile z karotenoidami wchodzą w skład fotosystemów PS-I i PS-II.

Kwas liponowy (tiooktanowy). Związek ten uczestniczy w transporcie elektronów, a także w

przenoszeniu grup acylowych w reakcjach α-oksydacji (oksydacyjnej dekarboksylacji α-ketokwasów).

Jest elementem składowym układów wieloenzymatycznych wraz z DPT, CoASH, FAD i NAD, np. w

dehydrogenazie pirogronianowej (dekarboksylującej). Jest to kwas 6,8-ditiolooktanowym. Łatwo

ulega odwracalnemu utleenieniu i redukcji.

C20H39

CH3OOC

fityl

chlorofil a

N

CH3

H

C CH

N

CH3

N

HC CH

N

CH3 CH

CH3

CH2

CH2

CH2 C2H5

CH

OOC

C

O

H

Mg2+

43

C

Enzym-NH

CH2 CH2 CH2 CH2 CH

CH2

S

CH2

S

O

liponian

Lip

S

S

Lip

S

SH

~C

O

CH3 DPT

enzym

DPT CH

CH3

OH

enzym

Lip

S

S

H

H

FADH2 FAD

CoASH

CH3 C

O

~SCoA

O

OH OH

N

N

N

N

NH2

CH2 S CH2

CH2

CHNH2

COOH

CH3

+

adenozynometionina

H

H

kwas tetrawodorofoliowy (H4folian)

1

2

3

4 5 6

8 7

9 10

COOH

CH2

CH2

COOH

CH

O

CH2 NH C NH

H2N

OH

N

N

N

N

Jak już wspomniano, liponian jest składnikiem układów wieloenzymatycznych. W układach tych,

jako kosubstrat, transportuje rodniki acylowe.

Koenzymy i grupy prostetyczne transferaz

Adenozynometionina. Jest to koenzym transferaz przenoszących jednowęglową grupę -CH3.

Grupa metylowa w tym układzie jest wybitnie reaktywna (tzw. „aktywny metyl”). I dlatego, w formie

jonu CH3

+, może być przenoszona na elektroujemnie naładowane inne grupy chemiczne

(najkorzystniej z wolną parą elektronową). Koenzym ten bierze udział w wielu szlakach

anabolicznych, metylując m.in. grupę aminową (np. w biosyntezie choliny).

Kwas foliowy. Koenzym ten jest pochodną pterydyny, heterocyklicznego dipierścieniowego

związku, do którego bocznej gupy metylowej przy C6 przyłączona jest cząsteczka kwasu

p-aminobenzoesowego i dalej poprzez wiązanie amidowe jedna lub więcej cząstwczek kwasu

glutaminowego. Kwas foliowy jest witaminą. Jej niedobór w ustroju człowieka może prowadzić do

pojawienia się trombocytopenii i pokrewnych odmian niedokrwistości. Do organizmu człowieka

dostarczany jest przez bakterie jelitowe.

Kwas foliowy - a właściwie produkt jego redukcji, kwas 5,6,7,8-tetrawodorofoliowy (H4folian) -

jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących jednowęglowe rodniki typu:

 CH3-

 HOCH2-

 -CH2-

 -CH=

 HOC-

 HN=CH-

Miejscem przyłączenia grup C1 są atomy N-5 lub N-10 tetrawodorofolianu. Natomiast źródłem

ich pochodzenia są przemiany aminokwasów: histydyny, tryptofanu, seryny i metioniny.

Lip

S

S

XH2 X

Lip

S

S

H

H

liponian

uteniony

liponian

zredukowany

44

Biotyna. Biotyna jest grupą prostetyczną karboksylaz i dekarboksylaz. Przyłączenie grupy

-COO- do substratu wymaga dostarczenia energi chemicznej; jej dawcą jest ATP, który transformuje

do aż AMP.

Biotyna jest witaminą H. Jej brak w organizmie człowieka wywołuje zaburzenia skórne oraz zmiany

psychomotoryczne: depresję, brak łaknienia i snu, itp. Witamina ta jest wytwarzana przez bakterie jelitowe.

Koenzym A. Na pierwszy rzut oka przypomina on opisane wcześniej dinukleotydy. Jednakże

koenzym ten nie jest zaliczany do dinukleotydów. Zbudowany jest z adenozyno-3'-fosforanu-5'-

pirofosforanu połączonego wiązaniem estrowym z kwasem pantotenowym, a ten z kolei wiązaniem

peptydowym z cystoaminą. Cysteoamina jest produktem dekarboksylacji cysteiny. Kwas pantotenowy

jest amidem kwasu 2,4-dihydroksy-3,3-dimetylomasłowego i β-alaniny. Symbolicznie koenzym A

zapisuje się jako CoASH.

Kwas pantotenowy jest witaminą B5. Niezbędna jest ona do prawidłowego metabolizmu białek, cukrów i

tłuszczów oraz do syntezy niektórych hormonów, uczestniczy w regeneracji tkanek i przyspiesza gojenie ran,

zapobiega przemęczeniu i usprawnia układ sercowo-naczyniowy, nerwowy i pokarmowy, bierze udział w

wytwarzaniu tłuszczów, cholesterolu, poprawia pigmentację i stan włosów. Kwas pantotenowy wytwarzany jest w

organizmach roślin, drobnoustrojów, a także niektórych pleśni. Bogatym źródłem tego związku są drożdże,

grzyby, groch, wątróbka, otręby pszenne, ryby (np. śledzie, makrele, pstrągi), mleko pełne, mięso kurczaka,

mleczko pszczele, pestki słonecznika, sery, orzechy, jajka, owoce awokado, pomarańcze, ziemniaki, brokuły,

ciemny ryż, melony, pełnoziarnisty chleb, soja, masło orzechowe, banany.

Koenzym A odgrywa podstawową rolę podczas aktywacji i

przenoszenia rodników acylowych. Reakcje przyłączenia CoASH

do kwasu karboksylowego katalizują syntetazy, które do swego

działania wymagają dostarczenia energii, której źródłem jest

ATP. Powstałe wiązanie tioestrowe jest wiązaniem

wysokoenergetycznym (zaznaczane we wzorach chemicznych

tyldą „~”). Przykładem może być synteza acetylo~SCoA z kwasu octowego, katalizowana przez

syntetazę acetylo-CoA (EC 6.2.1.1).

Difosfotiamina. Tiamina jest związkiem zbudowanym z pierścienia pirymidynowego

połączonego z heterocyklicznym pierścieniem tiazolowym grupą metylenową. W difosfotiaminie

grupa hydroksylowa łańcucha bocznego pierścienia tiazolowego jest zestryfikowana pirofosforanem.

Z apoenzymem wiąże się właśnie przez ugrupowanie pirofosforanowe. Symbolicznie diosfotiaminę

zapisuje się jako DPT.

HN NH

O

S C

O

NH-Enzym

biotyna

HN NH

O

S R

biotyna

NH

O

N

S R

ATP AMP+PP HOOC

CO2

karboksylaza

karboksybiotyna

adenozyno-3'-fosforan-5`-pirofosforan

koenzym A (CoA-SH)

P O CH2 C

CH3

CH3

CH

OH

C

O

NH CH2 CH2 C

O

O P NH CH2 CH2 SH

OH

CH2

O

N

N

N

N

NH2

P

kwas pantotenowy cysteoamina

ATP AMP+PP

syntetaza

X-CoA

CoASH

X COOH X C~SCoA

O

45

N

H3C N NH2

CH2

N

S

CH2

CH3

CH2 O P P

+

difosfotiamina (DPT)

Tiamina jest w i t a m i n ą B 1 . Skutkami jej niedoboru są zaburzenia czynności centralnego układu

nerwowego (uczucie osłabienia i zmęczenie, możliwy oczopląs, zaburzenia pamięci i koncentracji a nawet

depresja), niewydolność krążenia (przyspieszona akcja serca, powiększenie wymiarów serca, obrzęki kończyn),

zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego (utrata łaknienia, nudności, wymioty, biegunki, bóle brzucha, brak

apetytu, spadek wagi). W przypadku silnej awitaminozy B1 może wystąpić choroba Beri-beri, objawiająca się

bólami kończyn, osłabieniem mięśni i ich drżeniem oraz wyraźną niewydolnością układu krążenia. Etanol

powoduje rozkład tego związku, o czym powinni pamiętać ludzie nadużywający alkoholu i dbać o dostarczanie jej

do organizmu. Ź r ó d ł e m t e j w i t a m i n y są produkty zbożowe, mięso, groch, fasola, drożdże, orzechy, ryby,

owoce i warzywa. Zapotrzebowanie człowieka na tę witaminę wynosi ok. 1,5 mg na dobę.

Difosfotiamina jest grupą prostetyczną enzymów przenoszących aldehydy: glikolowy, octowy i

semialdehyd bursztynowy.

Jako grupa prostetyczna k e t ol a z , DPT przenosi aldehyd glikolowy, który odrywa od ksylulozo-

5-fosforanu i transportuje go na erytrozo-4-fosforan.

Jako e l e m e n t u k ł a d ó w w i e l o e n z y m a t y c z n y c h - podczas α-oksydacji - np.

pirogronianu lub α-ketoglutaranu zachowuje się jak transferaza, a równocześnie jak liaza. Jako

dehydrogenaza pirogronianowa (acetyl-transportująca) - EC 1.2.4.1, prowadzi dekarboksylację

pirogronianu do aldehydu octowego, a jako dehydrogenaza ketoglutaranowa (bursztyniantransporująca)

- EC 1.2.4.2, dekarboksyluje α-ketoglutaran do semialdehydu bursztynianowego, które

dalej przenosi na kwas liponowy.

Pirydoksyna. Mieszanina trzech naturalnych związków: pirydoksyny, pirydoksalu i

pirydoksaminy. Są one pochodnymi pirydyny.

DPT

N

S CH2

CH3

R

H CH2 O

+

PP

Enzym

aldehyd

3-fosfoglicerynowy

P

CH OH

CH2O

C

O

H

transketolaza

ksylulozo-5-fosforan

CH2OH

C O

HO CH

CH OH

CH2O P

N

S CH2

CH3

R

CH2 O

+

PP

Enzym

C~

H

HO

CH2OH

aktywny aldehyd glikolowy~DPT

H3C N

HO CH2OH

CH2OH

H3C N

HO CH2OH

CH2NH2

H3C N

HO CH2OH

C

O

H

pirydoksyna pirydoksamina pirydoksal

DPT

N

S CH2

CH3

R

H CH2 O

+

PP

Enzym

~DPT

CH3

C O

COOH

pirogronian

hydroksyetylo

CO2

fragment dehydrogenazy

pirogronianowej

(dekarboksylującej)

N

S CH2

CH3

R

CH2 O

+

PP

Enzym

C~

OH

H

CH3

46

5 -Fo s f or a n pi r yd o ks a l u (PLP) jest koenzymem lub grupą prostetyczną przeszło 50

enzymów. Bierze udział w przemianach aminokwasów. Przede wszystkim współdziała z

aminotransferazami przenoszącymi grupę aminową z aminokwasów na α-ketokwasy i odwrotnie. Jest

koenzymem dekarboksylaz aminokwasów. Uczestniczy ponadto w przemianie tryptofanu w amid

kwasu nikotynowego, transformacji glicyny w serynę i w biosyntezie cysteiny. Szczegóły dotyczące

reakcji transaminacji i dekarboksylacji aminokwasów zostaną opisane w rozdziale omawiającym

metabolizm aminokwasów.

Mieszanina pirydoksyny, pirydoksalu i pirydoksaminy nazywana jest witaminą B6. Wszystkie trzy związki

ulegają w organizmie wzajemnym przekształceniom i wykazują podobne działanie biologiczne. Niedobór witaminy

B6 występuje tylko wyjątkowo, np. u małych dzieci karmionych sztucznymi odżywkami lub karmionych przez

matki, które długo przyjmowały doustne środki antykoncepcyjne oraz u alkoholików i ich potomstwa. Do

najczęściej spotykanych objawów należą stany zapalne skóry (łojotokowe zmiany na twarzy), podrażnienie języka

i błon śluzowych jamy ustnej (języka, kącików warg) zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym (apatia,

bezsenność, nadwrażliwość, napady drgawek), zwiększona podatność na infekcje. Witamina B6 wytwarzana jest

przez florę bakteryjną przewodu pokarmowego, w dużych występuje w wątrobie, jajach, jarzynach i mięsie.

Cyjanokobalamina. Jej nazwa wywodzi się od jonu cyjankowego połączonego koordynacyjnie

z atomem kobaltu, wbudowanym w rdzeń porfirynowy. Rdzeń porfirynowy wraz z jonem kobaltu

noszą nazwę kobal aminy. Zamiast jonu CN-, z kobalaminą może być połączony inny anion, np.

hydoksylowy, chlorkowy czy azotynowy. W tym ostatnim przypadku związek nosi nazwę

nitrokobalaminy, a znajdowany jest w podłożach hodowlanych Streptomyces griseus.

Cyjanokobalamina jest koenzymem niektórych dehydrataz, amoniako-liaz i mutaz.

Witamina B12, znana jako czynnik przeciwdziałający niedokrwistości złośliwej lub jako czynnik

przeciwanemiczny. Brak tej witaminy powoduje charakterystyczne zmiany w obrazie krwi, związane z anemią

złośliwą. Obserwuje się również zmiany zapalne języka oraz brak kwasu solnego w żołądku. Organizmy roślin i

zwierząt nie produkują cyjanokobalaminy. Zdolność tą mają niektóre gatunki bakterii (choć u niektórych

mikroorganizmów jest ona także czynnikiem wzrostowym). Zwierzęta mięsożerne zapotrzebowanie na tę

witaminę pokrywają, spożywając mięso innych zwierząt. Szczególnie obfita w cyjanokobalaminę jest wątroba.

Zwierzęta roślinożerne wykorzystują cyjanokobalaminę wytwarzaną przez florę bakteryjną ich przewodu

pokarmowego. Źródło to jest czasem niewystarczające i u niektórych gatunków zwierząt dochodzi niekiedy do

zjadania własnych odchodów, co prowadzi do zwiększenia ilości tej witaminy w organizmie. Organizm dorosłego

człowieka potrzebuje ok. 3 mg cyjanokobalaminy dziennie. Zapotrzebowanie to jest w zupełności pokrywane

przez normalną dietę.

Nukleozydofosforany. Nukleotydy, które do swojej reszty fosforanowej dodatkowo mają

przyłączoną jedną lub dwie cząsteczki kwasu fosforowego, czyli nukleozydodi- i trifosforany są

koenzymami, a właściwie poprawniej definiując kofaktorami czy też kosubstratami reakcji

katalizowanych przez liczne enzymy. Zaliczane są one do związków bogatych w energię chemiczną;

tzw. związków makroergicznych lub inaczej związków wysokoenergetycznych. Wśród nich

najczęściej kosubstratem w reakcjach enzymatycznych bywa adenozynot r i fos for an - ATP. Jest

on kosubstratem większości ligaz (enzymów z klasy EC 6.), kinaz (transferaz z podklasy EC 2.7.,

H

+

CN

P

N

N

CH3

CH3

O

O OH

HOH2C

CH3

CH2 CO NH CH2 CH

Co

H3C

H2NOH2C

H2NOH2CH2C

H2NOH2C CH2

CH3

CH2CH2CONH2

CH3

CH3

CH3

CH2CH2CONH2

H3C CH2CONH2

CH3

CH3

N

CH

N

C

N

C

N

cyjanokobalamina

47

O

OH

CH2

O

O P O

OH

N

N

N

N

NH2

H

adenozyna

AMP

ADP

ATP



O

P O

OH

P

OH

OH

O O

przenoszących grupę fosforanową na różne substraty) czy wreszcie niektórych karboksykinaz

(enzymów z pod-podklasy EC 4.1.1.).

Te rmo d yn ami ka r e a kc j i e n zyma t yc zn ych . Zgodnie z prawami termodynamiki reakcje

endoergiczne nie mogą przebiegać spontanicznie, nawet jeśli są katalizowane przez enzymy. Tego

typu reakcje muszą być sprzężone z inną reakcją silnie egzoergiczną, tak by suma ich energii

swobodnej ΔG była równa zero lub ujemna.

Przykładowo reakcja glukozy z kwasem

fosforowym jest reakcją endoergiczną; zmiana

energii swobodnej ΔG = 12 kJ/mol. Stąd

równowaga tej reakcji jest silnie przesunięta

na lewą stronę; glukozo-6-fosforan

praktycznie nie powstaje. Reakcja hydrolizy

ATP do ADP + Pi* jest z kolei silnie egzoergiczna; ΔG = −29 kJ/mol. Przy tak dużej ujemnej wartości

ΔG jest to reakcja praktycznie nieodwracalna. W przypadku enzymatycznego sprzęgnięcia obu tych

reakcji suma energii swobodnej ΔG = −17 kJ/mol. W takim układzie równowaga reakcji przesunięta

jest zdecydowanie na prawą stronę i praktycznie cała pula glukozy jest przemieniona w glukozo-6-P.

W ATP pierwsza cząsteczka kwasu fosforowego przyłączona jest do grupy -OH rybozy

zwykłym wiązaniem estrowym. Energia swobodna jego hydrolizy wynosi ΔG = −14 kJ/mol.

Natomiast kolejne cząsteczki kwasu fosforowego wiążą się ze sobą wiązaniem bezwodnikowym.

Energia swobodna ich hydrolizy odpowiednio wynosi:

Stąd ATP i ADP (adenozynodifosforan) należą do związków bogatych w energię chemiczną.

Natomiast AMP (adenozynomonofosforan) jest związkiem niskoenergetycznym. Przyjmuje się, że

dolną wartością energii swobodnej hydrolizy, która decyduje o zaliczeniu związku do

makroergicznych jest ΔG zbliżone do −29 kJ/mol.

W tabeli 2.2. przykładowo podano przybliżone średnie wartości energii swobodnej hydrolizy

kilku związków zawierających grupę fosforanową. Energia swobodna hydrolizy ATP do ADP+Pi

wynosi ΔG = −29 kJ/mol, co sprawia, że ten nukleozydotrifosforan wraz z ADP i pirofosforanem

należą do grupy fosforanów znajdujących się pośrodku listy cytowanych związków

wysokoenergetycznych i niskoenergetycznych. Dlatego ATP może być donorem fosforanów dla

związków niskoenergetycznych znajdujących na liście poniżej, o ΔG >−29 kJ/mol. Z tego samego

powodu ADP może być akceptorem wysokoenergetycznego fosforanu od związków znajdujących się

na tej liście powyżej, o ΔG <−29 kJ/mol.

* umownie Pi oznacza fosforan nieorganiczny

ATP ADP + Pi G= -29 kJ/mol ADP AMP + Pi G= -28 kJ/mol,

glukoza G= -17 kJ/mol

ATP ADP + Pi

glukozo-6- P

G= -29 kJ/mol

ATP ADP

glukoza + H3PO4 glukozo-6- P

-H2O

+H2O

G= 12 kJ/mol

48

Należy jeszcze dodać, że wiązania bezwodnikowe w ATP łatwo ulegają rozerwaniu. Oderwana

reszta fosforanowa lub pirofosforanowa może być przenoszona na różne substraty, tym łatwiej, iż

rozkład ATP jednocześnie dostarcza energii swobodnej niezbędnej dla takich reakcji.

Tabela 2.2. Energia swobodna hydrolizy niektórych fosforanów

Nazwa związku ΔG [kJ/mol] 1

Fosfoenolopirogronian

Karbamoilofosforan

1,3-difosfoglicerynian

Fosfokreatyna

Acetylo~SCoA

−62

−51

−49

−43

−34

ATP→AMP+PP

ATP→ADP+P

ADP→AMP+P

PP (pirofosforan)

−31

−29

−28

−27

Glukozo-1-fosforan

AMP

Glukozo-6-fosforan

−21

−14

−14

1 cytowane dane są przybliżonymi wartościami ΔG

ATP zawiera dwa wysokoenergetyczne wiązania bezwodnikowe. Oderwanie fosforanu, prowadzące

do powstania ADP, powoduje utratę jednego z nich (ΔG =−29 kJ/mol). Oderwanie fosforanu od

ADP prowadzi do powstania AMP (ΔG =−28 kJ/mol). Teoretycznie wyliczona, sumaryczna energia

swobodna takiej dwuetapowej przemiany ATP do AMP obniża się więc o ΔG =−57 kJ/mol*. Ale od

ATP może być oderwany również pirofosforan, jednoetapowo prowadząc do powstania AMP. Zmiana

energii swobodnej ΔG takiej przemiany równa jest −31 kJ/mol. Dla pełnego jej bilansu należy jednak

uwzględnić dodatkowo energię swobodną zawartą w pirofosforanie

(ΔG =−27 kJ/mol), co po podsumowaniu daje ΔG =−58 kJ/mol*. Ta

swobodna energia zawarta w PPi jest uwalniana podczas jego

enzymatycznej hydrolizy pod działaniem pirofosfatazy nieorganicznej (EC 3.6.1.1).

W komórkach żywych organizmów pomiędzy ATP, ADP i AMP istnieje pewnego typu

specyficzna równowaga. Kinaza adenylanowa (EC 2.7.4.3)

przenosi jeden z wysokoenergetycznych fosforanów z ATP na

AMP, co prowadzi do powstania dwóch cząsteczek ADP, tak jak

to przedstawiono na rysunku obok.

Dla pełnego obrazu należy jeszcze wspomnieć, że w komórkach ATP uczestniczy w reakcjach

enzymatycznych w postaci kompleksu z jonem Mg2+. Stąd jony Mg2+ są aktywatorami enzymów

współdziałających z ATP.

Reasumując, rol a ATP j a ko kos ub s t r a t u w reakcjach enzymatycznych jest następująca:

1. ATP jako d on or e ne r gi i swob od ne j w reakcjach syntez katalizowanych przez ligazy. W

większości takich przypadków ATP ulega rozkładowi do AMP + PPi. Jak już wspomniano,

ilość energii swobodnej dostarczona do takiego układu jest równoważna ΔG =−58 kJ/mol, co

wystarcza do przeprowadzenia rozmaitych syntez, niekiedy nawet związków

wysokoenergetycznych. Za przykład niech posłuży synteza acetylo~SCoA katalizowana przez

syntetazę acetylo-CoA (EC 6.2.1.1).

* Sumaryczna energia swobodna wyzwolona w jednoetapowym i dwuetapowym przekształceniu ATP do AMP

oczywiście musi być taka sama. Różnica 1 kJ/mol pomiędzy wyliczeniami wynika ze stosowania przybliżonych wartości ΔG.

PPi 2Pi

pirofosfataza

nieorganiczna

ATP + AMP 2 ADP

kinaza

adenylanowa

49

NADH

ATP ADP

NADPH

kinaza NADH

metionina + ATP

adenozynotransferaza

metioninowa

EC 2.5.1.6

PP + P

adenozynometionina

ATP dużo rzadziej, jako koenzym ligaz, ulega podczas reakcji rozkładowi do ADP. Tym

niemniej znanych jest sporo i takich przypadków. Dla podkreślenia, że ATP rozkłada się

jedynie do ADP w nazwie ligazy w nawiasie umieszcza się (ADP-tworząca). Jako przykład

podana zostanie syntetaza acetylo-CoA (ADP-tworząca) - EC 6.2.1.13. Wybrano ją celowo,

gdyż tylko wyjątkowo niektóre bakterie posiadają ten enzym, a z energetycznego „punktu

widzenia” komórki jest on korzystniejszy od wcześniej opisanej syntetazy acetylo-CoA.

2. ATP jako d on or or t ofo s f or a nu . Odpowiednie transferazy (kinazy) przenoszą rodnik

fosforanowy na rozmaite substraty, np. na monosacharydy,

glicerol, nukleozydy, itp. Za przykład posłuży synteza NADPH z

NADH katalizowana przez kinazę NADH (EC 2.7.1.86).

Na marginesie omawianego zagadnienia warto zwrócić uwagę na fakt, że w wyjątkowych sytuacjach

źródłem ortofosforanu może być pirofosforan. Nie powinno to budzić większego zdziwienia, bowiem

energia swobodna jego hydrolizy ΔG =−27 kJ/mol. Przykładem może być kinaza octanowa

(pirofosforanowa) - EC 2.7.2.12, katalizująca przeniesienie fosforanu z PPi na kwas octowy z

wytworzeniem acetylofosforanu.

3. ATP jako d on or pi r ofos for an u . W niektórych przypadkach konieczne jest przyłączenie

do substratu rodnika pirofosforanowego. Jego donorem jest ATP, a reakcję katalizują

pirofosfokinazy. Jako przykład może posłużyć synteza

difosfotiaminy z tiaminy. Reakcję katalizuje

pirofosfokinaza tiaminowa (EC 2.7.6.2).

4. ATP jako d on or r od ni ka a de n yl i lowe go . Adenylacja to reakcja przeniesienia rodnika

adenylilowego z ATP na substrat z jednoczesnym odłączeniem PPi. Reakcja ta ma

podstawowe znaczenie dla syntezy dinukleotydów adenilowych i związków o podobnej

budowie (choćby wspomnianego wcześniej CoASH). Reakcję katalizują adenylilotransferazy

(zwane zwyczajowo pirofosforylazami). Jako przykład posłuży synteza FAD z FMN

katalizowana przez adenylilotransferazę FMN (EC 2.7.7.2).

Ale enzymy z pod-podklasy EC 2.7.7. mogą również transportować inne nukleotydilowe

rodniki z nukleotydotrifosforanów. Jedną z takich reakcji o podstawowym znaczeniu dla

procesów biochemicznych jest synteza UDPG (urydyliloglukozy). Reakcja katalizowana jest

przez urydylilotransferazę glukozo-1-fosforanową (EC 2.7.7.9).

5. ATP jako d on or ade no zyn y . W pewnych szczególnych przypadkach ATP staje się

donorem adenozyny. Przykładem może być synteza adenozynometioniny. Koenzym ten

powstaje w reakcji metioniny z ATP, katalizowanej przez adenozynotransferazę metioninową

(EC 2.5.1.6).

Niekiedy rolę ATP w omówionych wyżej reakcjach może pełnić inny z

nukleozydotrifosforanów. O urydynotrifosforanie (UTP) i jego roli już wspomniano.

Guanozynotrifosforan (GTP) lub inozynotrifosforan (ITP) są koenzymami syntetazy bursztynylo-CoA

ATP AMP+PP

syntetaza

acetylo-CoA

CoASH

C~SCoA

O

CH3

CH3 COOH

ATP ADP+P

CoASH

C~SCoA

O

CH3

CH3 COOH

syntetaza

acetylo-CoA

(ADP-tworzaca)

FMN

ATP PPi

FAD

adenylilotransferaza FMN

tiamina

ATP AMP

pirofosfokinaza

tiaminowa

difosfotiamina

glukozo-1- P

UTP PPi

urydylilotransferaza

glukozo-1-fosforanowa

UDPG

50

(patrz cykl Krebsa). Cytydynotrifosforan (CTP) bierze udział w syntezie substancji lipidowych pod

postacią cytydylodifosfocholiny.

Pomiędzy ATP a pozostałymi nukleotydotrifosforanami występuje zależność:

2.2.3. Kinetyka reakcji enzymatycznych

S z y b k o ś ć r e a k c j i e n z y m a t y c z n e j , podobnie jak każdej reakcji chemicznej, wyraża się

ubytkiem stężenia jednego z substratów lub też przyrostem stężenia któregoś z produktów:

dt

d P

dt

d S

v

[ ] [ ]    (2.1)

Równowa ga r e a kc j i e n zyma t yc zn ych . Teoretycznie wszystkie reakcje chemiczne

(również katalizowane enzymatycznie) są odwracalne. Po pewnym czasie ustala się równowaga

pomiędzy substratami reakcji a jej produktami, objawiająca się tym, że szybkość powstawania

produktów jest równa szybkości ich rewersji do substratów. Szybkość powstawania produktów v1 jest

proporcjonalna do stężeń reagujących substratów. Szybkość reakcji rewersji produktów v-1 jest

proporcjonalna do stężeń produktów. W stanie równowagi:

1 2 v  v [ ] [ ] 1 1 v  k  A  B  [ ] 1 1 v  k  AB   (2.2)

gdzie: A,B - substraty; AB - produkt; k+1, k-1 - stałe szybkości reakcji

Dla przypomnienia: stałe szybkości reakcji k są charakterystyczne dla konkretnych reagentów. Rosną wraz

ze wzrostem temperatury reakcji.

Zgodnie z prawem działania mas Guldberga i Waagego w stanie równowagi, stężenia reagentów

spełniają zależność:

K

A B

AB

k

k 





 [ ] [ ]

[ ]

1

1 gdzie: K jest stałą równowagi konkretnej reakcji. (2.3)

Im większa jest stała równowagi K, tym większe stężenie produktu AB, czyli równowaga reakcji

bardziej przesunięta na prawo. Reakcja pomiędzy A i B zachodzi tym energiczniej, im większa jest

stała równowagi reakcji K.

Jeszcze raz należy wyraźnie podkreślić: obecność enzymu w układzie nie zmienia wartości

stałej K. Enzym jedynie przyspiesza moment osiągnięcia równowagi przez reagenty. Jeżeli K>1

to reakcja jest spontaniczna.

Stałą K można wyrazić liczbowo, o ile znane są stężenia substratów i produktów reakcji w stanie

równowagi. Wartości K można również wyliczyć na drodze termodynamicznej. Pomiędzy zmianami

energii swobodnej ΔG a stałą równowagi reakcji K istnieje zależność:

G  -RT  ln K gdzie: R - stała gazowa, T - temperatura bezwzględna (2.4)

Z zależności tej wynika prosta formuła potwierdzająca wcześniejsze stwierdzenia: im większa

stała równowagi reakcji K, tym większa różnica pomiędzy wartościami energii swobodnej substratów

i produktów. I odwrotnie: im większe ΔG, tym równowaga reakcja jest bardziej przesunięta na korzyść

produktów. W krańcowych przypadkach, gdy ujemna wartość ΔG jest bardzo duża cały substrat ulega

przekształceniu w produkt, a reakcja praktycznie staje się nieodwracalna.

Z kolei pomiędzy zmianami energii swobodnej ΔG (w chemii fizycznej znanej pod słuszną

nazwą potencjału termodynamicznego), entalpią układu i zmianami entropii występuje zależność:

G  H  TS

(2.5)

S z y b k o ś ć p o c z ą t k owa r e a kc j i en zyma t yc zne j .

Szybkość początkowa reakcji v jest to szybkość wyznaczona przed

powstaniem dostatecznie dużej ilości produktu, który by umożliwiał

zachodzenie reakcji odwrotnej. Szybkość początkowa reakcji

enzymatycznej jest zawsze proporcjonalna do stężenia enzymu.

nukleozydotrifosforan + ADP

kinaza

nukleozydodifosforanowa

nukleozydodifosforan + ATP

EC 2.7.4.6

S P

enzym

A + B AB

v+1, k+1

v-1, k-1

V

[E]

Wpływ stężenia enzymu [E] na

szybkość reakcji enzymatycznej V

[S]>>[E]

51

m K [S]

2

max V

V Vmax

Stąd oznaczenie ilości enzymu (jego aktywności) powinno być oparte, o ile jest to możliwe, na

pomiarach początkowej szybkości reakcji przy znacznym nadmiarze substratu S. W takim

układzie szybkość reakcji nie zależy od stężenia substratu i reakcja jest rzędu zerowego.

A k t y w n o ś ć e n z y m a t y c z n a . Oznaczenie bezwzględnej ilości enzymu (np. w gramach lub

molach) jest trudne do wykonania, gdyż wiąże się z oczyszczeniem białka enzymatycznego do stanu

homogenności. Stąd umówiono się, że za miarę ilości enzymu w biopreparatach przyjmuje się jego

aktywność katalityczną (enzymatyczną), czyli szybkość, z jaką w założonych warunkach preparat

enzymatyczny przekształca określoną ilość wybranego arbitralnie substratu. Miarą tej szybkości jest

ubytek substratu lub przyrost produktów reakcji enzymatycznej w przeliczeniu na jednostkę czasu.

Zdefiniowano również oficjalnie obowiązujące standardowe jednostki enzymatyczne.

Pierwszą z nich, obowiązującą w układzie SI, nazwano ka t al em (Kat). 1 Kat to taka ilość

enzymu, która katalizuje przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy w temperaturze 30C.

Druga z tych oficjalnie obowiązujących jednostek, rekomendowana przez Międzynarodową Unię

Biochemiczną, nazwana została m i ę d z y n a r o d o w ą j e d n o s t k ą e n z y m a t y c z n ą (w skrócie

m.j.e.). 1 m.j.e. to taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 μmola substratu w ciągu 1 minuty

w temperaturze 30C.

Jednakże dla wielu enzymów obie te oficjalne obowiązujące jednostki nie znalazły praktycznego

zastosowania. Natomiast powszechnie przyjęły się jednostki enzymatyczne skojarzone z

odpowiednimi metodami oznaczania aktywności opracowanymi dla całej gamy konkretnych enzymów

a nawet grup enzymów.

Teoria Michaelisa-Menten. W 1913 roku L.Michaelis i M.L.Menten przedstawili swoją

koncepcję katalizy enzymatycznej. Model Michaelisa-Menten opiera się na założeniu powstawania

przejściowego kompleksu enzymu-substrat:

(2.6)

Zgodnie z tym równaniem, przy niewielkich stężeniach substratu - równoważnym stężeniom

enzymu - reakcja enzymatyczna staje się reakcją I rzędu i jej szybkość staje się proporcjonalna do

stężenia zarówno substratu [S], jak i enzymu [E]. Przy stałym stężeniu enzymu [E] szybkość reakcji

będzie zależała jedynie od stężenia substratu. Wpływ stężenia substratu [S] na początkową szybkość

reakcji enzymatycznej przy stałym stężeniu enzymu przedstawia poniższy wykres.

Dla pewnych stężeń substratu - równoważnym ilościom dostępnych centrów aktywnych

enzymu - reakcja osiągnie szybkość maksymalną Vmax. Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie

przyspiesza jego przemiany. Jak już wspomniano wcześniej szybkość reakcji enzymatycznej zależy

od łatwości tworzenia kompleksu enzymu z substratem. Z równania (2.6) wynika, że w stanie

równowagi szybkość tworzenia kompleksu ES jest równa szybkości jego rozpadu:

1 2 2 1 v  v  v  v (2.7)

[ ] [ ] 1 1 v  k  E  S  [ ] 1 1 v  k  ES   [ ] 2 2 v  k  ES  [ ] [ ] 1 2 v  k  E  P   (2.8)

Po podstawieniu zależności (2.8) do równania (2.7) i po prostych matematycznych

przekształceniach otrzymuje się:

E + S ES E + P

k-1

k1 k2

k-2

52

[S]

v

Vmax

Km1 Km2

S1 S2

Vmax



1

v

-1

Km

1

[S]

tgα = Km/Vmax

1 2

2

1 2

1 [ ] [ ]

[ ]

[ ]

 



 















k k

k P

k k

k S

E

ES

(2.9)

Uwzględniając fakt, że na początku reakcji [P]  0 oraz po dalszych prostych przekształceniach

równania (2.9), otrzymuje się:

m  K









 

1

1 2

[ ]

[ ] [ ]

k

k k

ES

E S

(2.10)

Wielkość Km nosi nazwę s t a ł e j M i c h a e l i s a . J est ona charakterystyczna dla danego układu

enzym-substrat. Łatwo zauważyć, że im mniejsza wartość Km, tym większe stężenie kompleksu

przejściowego [ES].

Analizując równania (2.6)  (2.10) należy zauważyć, że

1. stężenie enzymu [E] w równaniu (2.10), w rzeczywistości jest stężeniem enzymu wolnego w

danym momencie reakcji, czyli niezwiązanego w kompleks przejściowy ES. Na każdym

etapie reakcji część enzymu wyjściowego [E0] obecnego w układzie reakcyjnym jest związana

w ES. Stąd [E]= [E0]-[ES].

2. Szybkość reakcji enzymatycznej v, czyli szybkość powstawania produktu P, zależy tak

naprawdę od szybkości rozpadu kompleksu ES, czyli od v+2. Stąd: v = v+2=k+2  [ES].

3. Gdy cały enzym jest w kompleksie z substratem, czyli [E0]=[ES] szybkość reakcji

enzymatycznej osiąga maksymalną szybkość Vmax.

Uwzględniając powyższe założenia w równaniu (2.10) otrzymuje się równa ni e

ma t ema t yc zne Mi cha e l i s a -Me nt e n:

[ ]

[ ] max

K S

V S

v

m 



 (2.11)

Równanie (2.11) pozwala w prosty sposób zdefiniować stałą Michaelisa Km:

gdy: v= 1/2Vmax to Km = [S]

Stała Michaelisa Km jest to takie stężenie substratu [S], przy którym szybkość reakcji

enzymatycznej równa się połowie szybkości maksymalnej Vmax.

Łatwo wykazać, że:

1. Jeśli [S]<<Km (czyli przy małych stężeniach substratu), to reakcja jest I rzędu: v= f([S]),

2. Jeśli [S]=Km, to v=1/2Vmax

3. Jeśli [S]>>Km, to reakcja jest 0 rzędu i v=Vmax.

Odwrotność stałej Michaelisa 1/Km nazywana jest powinowactwem danego enzymy do substratu.

Im mniejsza stała Michaelisa Km, tym większe powinowactwo enzymu do substratu, co pokazuje

poniższy rysunek. Celowo dla obu substratów - S1 i S2 - przyjęto identyczne szybkości maksymalne

reakcji Vmax. Km2>Km1, co oznacza, że ten enzym wykazuje większe powinowactwo do substratu S1

aniżeli do S2. Oznacza to, że szybciej przekształca on substrat S1 aniżeli S2.

Wpływ rodzaju substratu na szybkość reakcji Wykres Lineweavera-Burka

enzymatycznej

Stałe Michaelisa Km dla różnych układów enzym-substrat mogą mieć różne wartości; nawet od

10-2 mola/dm3 do 10-7mola/ dm3.

Stałą Km można wyznaczyć graficznie korzystając ze wzoru Lineweavera-Burka..

53

max max

1

[ ]

1 1

V S V

K

v

 m  

Szczegółowo kinetyką reakcji enzymatycznych zajmuje się enzymologia i tam można znaleźć więcej danych

odnośnie tematu.

2.2.4. Klasyfikacja i nomenklatura enzymów

Pierwotne nazewnictwo enzymów było nieuporządkowane i dopuszczało stosowanie dowolnych

nazw takich, jak pepsyna, papaina, subtilizyna. W późniejszym okresie nazwę enzymu wywodzono od

typu reakcji lub substratu, na który działał, przy czym za charakterystyczną dla enzymów uznano

końcówkę -aza (np. reduktaza, lipaza, itp.).

Od 1964 roku Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej zaleciła stosowanie

s ys t ema t yc zn ych n a zw en zymów, składających się przeważnie z dwu części. Pierwsza jest

utworzona od nazwy katalizowanej reakcji i określa jej rodzaj (np. oksydoreduktaza, glukohydrolaza,

itp.). Druga część nazwy enzymu składa się z nazwy substratu lub substratów biorących udział w

reakcji. Np.:

maltohydrolaza 1,4-α-D-glukanu (zwana oficjalnie i zwyczajowo β-amylazą) - EC 3.2.1.2,

oksydoreduktaza alkohol:NAD (oficjalnie zwana dehydrogenazą alkoholową) - EC 1.1.1.1.

Nazwy systematyczne enzymów są długie i niekiedy bardzo skomplikowane. Z tego powodu ich

stosowanie napotyka na spory opór ze strony biochemików. Ponadto do wielu enzymów przylgnęły

nazwy stosowane pierwotnie. Dlatego zdecydowano, że obok nazwy systematycznej, dopuszczalne

jest stosowanie nazw zwyczajowych. Ostatnio (po 2000 roku) pojawiła się koncepcja wprowadzenia

tzw. nazw oficjalnych enzymów wywodzących się od nazw zwyczajowych. I tak np. nazwa α-amylaza

jest w świetle tej koncepcji nazwą oficjalną enzymu sklasyfikowanego pod numerem EC 3.2.1.1.

Należy jeszcze uzupełnić, że pierwotne, zwyczajowe nazwy niektórych enzymów (np. sacharaza,

maltaza) okazały się w świetle aktualnej wiedzy bez pokrycia i dla nich nie zaleca się ich stosowania.

Ponadto zdarza się, że pod jedną i tą samą nazwą zwyczajową są znane nawet trzy różne enzymy, np.

tyrozynaza. Nazwa „tyrozynaza” dla dwóch z nich oczywiście jest nazwą błędną.

W numerze 1 czasopisma "Postępy Biochemii" z 1985 roku zamieszczono słownik zalecanych i

zwyczajowych nazw enzymów w języku polskim.

Wszystkie poznane enzymy zostały ujęte przez Komisję Enzymową w jednolity system

klasyfikacji (EC). Każdy enzym w ramach tego systemu posiada odpowiedni numer złożony z

czterech członów liczbowych oddzielonych kropkami (np. dehydrogenaza alkoholowa ma numer EC

1.1.1.1). Podanie tego numeru jednoznacznie określa konkretny enzym, co pozwala uniknąć

nieporozumień i pomyłek. Zasady klasyfikacji i numeracji zbadanych enzymów oparte zostały o ich

specyficzność kierunkową (rodzaj katalizowanej reakcji) i substratową. Wszystkie enzymy podzielono

na sześć głównych klas:

EC.1. Oksydoreduktazy - enzymy katalizujące reakcje odłączania lub przyłączania atomów

wodoru, przyłączenia atomu tlenu lub przenoszenia elektronów.

EC.2. Transferazy - enzymy przenoszące grupy funkcyjne, rodniki, fragmenty cząsteczek itp.

EC 3. Hydrolazy - enzymy katalizujące reakcje hydrolizy.

EC 4. Liazy - enzymy niehydrolitycznie rozrywające wiązania.

EC 5. Izomerazy - enzymy katalizujące przemiany wewnątrzcząsteczkowe (racemizacja,

izomeryzacja, przenoszenie grup itp.).

EC 6. Ligazy - enzymy syntetyzujące, katalizujące tworzenie wiązań.

Każda klasa główna dzieli się na szereg podklas, których kolejne numery stanowią drugi człon

numeru klasyfikacyjnego i wynikają, ogólnie biorąc, z uściślonej specyficzności kierunkowej. Na

przykład EC.3.4. jest numerem podklasy hydrolaz peptydowych, czyli enzymów hydrolizujących

wiązanie peptydowe. W obrębie podklas rozróżnia się pod-podklasy - trzeci człon numeru

klasyfikacyjnego. Określa on dokładniej specyfikę katalizowanej reakcji. Dla oksydoreduktaz określa

grupę funkcyjną będącą akceptorem; dla transferaz uściśla rodzaj przenoszonej grupy; dla hydrolaz -

typ hydrolizowanego wiązania; dla liaz - rodzaj odszczepianej grupy; dla izomeraz - charakter

przekształcenia i wreszcie dla ligaz - rodzaj powstałego związku.

54

Dostęp do internetowej bazy danych dotyczącej nomenklatury enzymów (Enzyme Nomenclature

Database) można znaleźć pod adresem http://www.expasy.org/enzyme/. Na następnej stronie

przykładowo pokazano stronę internetową ExPASy dla dehydrogenazy alkoholowej - EC 1.1.1.1.

55

Wzór strony ExPASy dla EC 1.1.1.1 - dehydrogenaza alkoholowa.

Official Name

Alcohol dehydrogenase.

Alternative Name(s)

Aldehyde reductase.

Reaction catalysed

An alcohol + NAD(+) <=> an aldehyde or ketone + NADH

Cofactor(s)

Zinc or Iron.

Comment(s)

 Acts on primary or secondary alcohols or hemiacetals.

 The animal, but not the yeast, enzyme acts also on cyclic secondary alcohols.

Cross-references

Biochemical

Pathways; map

number(s)

D8 ; E6 ; J10

PROSITE PDOC00058 ; PDOC00059 ; PDOC00060

BRENDA 1.1.1.1

PUMA2 1.1.1.1

PRIAM enzymespecific

profiles

1.1.1.1

Kyoto University

LIGAND chemical

database

1.1.1.1

IUBMB Enzyme

Nomenclature

1.1.1.1

IntEnz 1.1.1.1

MEDLINE Find literature relating to 1.1.1.1

Swiss-Prot

P80222, ADH1_ALLMI; P49645, ADH1_APTAU; P06525, ADH1_ARATH;

P41747, ADH1_ASPFL; P12311, ADH1_BACST; Q17334, ADH1_CAEEL;

P43067, ADH1_CANAL; P48814, ADH1_CERCA; P23991, ADH1_CHICK;

P23236, ADH1_DROHY; P48586, ADH1_DROMN; P09370, ADH1_DROMO;

P22246, ADH1_DROMT; P07161, ADH1_DROMU; P12854, ADH1_DRONA;

P08843, ADH1_EMENI; P05336, ADH1_HORVU; P20369, ADH1_KLULA;

Q07288, ADH1_KLUMA; P00333, ADH1_MAIZE; P80512, ADH1_NAJNA;

Q9P6C8, ADH1_NEUCR; P20306, ADH1_ORYSA; P12886, ADH1_PEA;

P14219, ADH1_PENAM; P25141, ADH1_PETHY; O00097, ADH1_PICST;

Q03505, ADH1_RABIT; P22797, ADH1_RANPE; P14673, ADH1_SOLTU;

P80338, ADH1_STRCA; P13603, ADH1_TRIRP; P00330, ADH1_YEAST;

Q07264, ADH1_ZEALU; P20368, ADH1_ZYMMO; P42327, ADH2_BACST;

O45687, ADH2_CAEEL; O94038, ADH2_CANAL; P48815, ADH2_CERCA;

P27581, ADH2_DROAR; P25720, ADH2_DROBU; P23237, ADH2_DROHY;

P48587, ADH2_DROMN; P09369, ADH2_DROMO; P07160, ADH2_DROMU;

P24267, ADH2_DROWH; P37686, ADH2_ECOLI; P54202, ADH2_EMENI;

Q24803, ADH2_ENTHI; P10847, ADH2_HORVU; P49383, ADH2_KLULA;

Zasady klasyfikacji enzymów w podklasach i pod-podklasach.

Oksydoreduktazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, na

jaką grupę funkcyjną lub grupę związków działa dana oksydoreduktaza. Pewnego typu odstępstwo

występuje w podklasach EC 1.13. i EC 1.14. Te dwie podklasy skupiają oksygenazy - enzymy

56

wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratów, choć oficjalnie mówi się o

„oksydoreduktazach działających na pojedyncze lub podwójne donory z jednoczesnym

wybudowaniem atomów tlenu”.

Poniżej przedstawiono przykłady podklas (w EC 1.13. i EC 1.14. również pod-podklas) w tej

klasie enzymów.

EC 1. Oksydoreduktazy

EC 1.1. działające na grupę -CH2-OH jako donor

EC 1.2. działające na grupę -CHO lub >C=O jako donor

EC 1.3. odrywające atomy wodoru od -CH2-CH2, prowadząc do -CH=CH

EC 1.4. działające na grupę -CH2-NH2 jako donor

EC 1.5. działające na grupę -CH-NH- jako donor

EC 1.6. działające na NADH lub NADPH

EC 1.7. działające na inne związki azotowe jako donory

EC 1.8. działające na związki siarki jako donory

EC 1.9. działające na grupę hemową jako donor

EC 1.10. działające na związki difenolowe i pokrewne jako donory

EC 1.11. działające na H2O2 jako akceptor peroksydazy

Są to p e r o k s y d a z y . W tej podklasie brak jest pod-podklas, stąd ich numer zaczyna się od

EC 1.11.1. Na przykład numer EC 1.11.1.6 odnosi się do k a t a l a z y .

EC 1.12. działające na wodór jako donor

EC 1.13. oksygenazy, enzymy wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratu, nie wymagają

dodatkowego donoru wodoru

EC 1.13.11. dioksygenazy- wbudowują dwa atomy tlenu

EC 1.13.12. monooksygenazy - wbudowują jeden atom tlenu

EC 1.14. oksygenazy, enzymy wbudowujące atom lub dwa atomy tlenu do substratu, wymagają

dodatkowego donoru wodoru

Schematycznie, reakcje katalizowane przez te enzymy można przedstawić następująco:

EC 1.14.11. dioksygenazy, DH2 = 2-ketoglutran

EC 1.14.12. dioksygenazy, DH2 = NADH

EC 1.14.13. monooksygenazy, DH2 = NADH

EC 1.14.14. monooksygenazy, DH2 = FADH2 lub zredukowany FMN

EC 1.14.15. monooksygenazy, DH2 = zredukowane żelazowo-siarkowe białka

EC 1.14.16. - EC 1.14.20. monooksygenazy, DH2 = inne zredukowane związki

EC 1.15. działające na ponadtlenki jako akceptory

EC 1.16. utleniające jony metali

EC 1.17. działające na grupy =CH lub -CH2 jako donory

EC 1.18. działające na siarkowo-żelazowe białka jako donory

EC 1.19. - EC 1.21. działające na inne związki jako donory

EC 1.97. inne oksydoreduktazy

W klasie oksydoreduktaz trzeci człon numeru - czyli pod-podklasa - wskazuje, co jest donorem lub

akceptorem atomów wodoru względnie elektronów. Poniżej podano kilka przykładów pod-podklas z

klasy oksydoreduktaz.

EC 1.x.1. akceptorem wodoru jest NAD lub NADP, dehydrogenazy i reduktazy

EC 1.x.2. akceptorem elektronów są cytochromy

EC 1.x.3. akceptorem wodoru jest tlen cząsteczkowy, oksydazy

Oksydazy są flawoproteidami (np. z FAD), metaloflawoproteidami bądź hemoproteidami. Znane są

dwa typy oksydaz: oksydazy typu I wytwarzają podczas działania wodę, oksydazy typu II wytwarzają

nadtlenek wodoru.

XH X-OH

O2 DH2 D

H2O

mechanizm działania

monooksygenazy z podklasy EC 1.14.

XH2

O2 DH2 D

mechanizm działania

dioksygenazy z podklasy EC 1.14.

X

OH

OH

XH2

O2

H2O

(koenzym)

X

1/2

oksydazy typu I

XH2

O2 (koenzym)

X

oksydazy typu II

H2O2

57

Przykładem oksydazy typu I jest oksydaza cytochromu-c (EC 1.9.3.1), a przykładem oksydazy typu II

oksydaza glukozowa (EC 1.1.3.4).

EC 1.x.4. akceptorem są związki disulfidowe (min. liponian) dehydrogenazy (dekarboksylujące)

EC 1.x.5. akceptorem wodoru jest ubichinon dehydrogenazy

EC 1.x.7. akceptorem są żelazo-siarkowe białka

EC1.x.99.z innym akceptorem (najczęściej z FAD) dehydrogenazy

Transferazy. W tej klasie enzymów drugi człon numeru - czyli podklasa - wskazuje, jaką grupę

funkcyjną transportuje dana transferaza. Trzeci człon numeru - pod-podklasa - uściśla o jaki rodnik

chodzi lub wskazuje akceptor przenoszonej grupy.

EC 2. Transferazy

EC 2.1. transportujące grupy jednowęglowe (C1)

EC 2.1.1. metylotransferazy (CH3)

EC 2.1.2. hydroksymetylo- i formylotransferazy (CH2OH, CHO)

EC 2.1.3. karboksy i karbamoilotransferazy

EC 2.1.4. amidynotransferza (CONH2)

EC 2.2. transportujące grupy aldehydowe lub ketonowe

EC 2.3. Acylotransferazy

EC 2.3.1. transportujące grupy inne niż acetylo-aminowe

EC 2.3.2. aminoacylotransferazy

EC 2.3.3. acylowe grupy przekształcane na alkilowe rodniki podczas transportu

EC 2.4. glikozylotransferazy

EC 2.4.1. heksozylotransferazy

EC 2.4.2. pentozylotransferazy

EC 2.4.99 transportujące inne glikozylowe grupy

EC 2.5. transportujące alkilowe lub arylowe grupy, inne niż metylowe grupy

EC 2.6. transportujące grupy z azotem

EC 2.6.1. Transaminazy aminotransferazy

EC 2.6.2. Oksymotransferazy

EC 2.6.99. transportujące inne grupy z azotem

EC 2.7. transportujące grupy zawierające fosfor

EC 2.7.1. Fosfotransferazy z grupą alkoholową jako akceptorem kinazy

EC 2.7.2. Fosfotransferazy z grupą karboksylową jako akceptorem kinazy

EC 2.7.3. Fosfotransferazy z grupą z azotem jako akceptorem kinazy

EC 2.7.4. Fosfotransferazy z grupą fosforową jako akceptorem kinazy

EC 2.7.6. Difosfotransferazy difosfokinazy

EC 2.7.7. Nukleotydilotransferazy

EC 2.7.8. Transferazy dla innych pochodnych grup fosforowych

EC 2.7.9. Fosfotransferazy z parą akceptorów dikinazy

EC 2.8. transportujące grupy zawierające siarkę

EC 2.8.1. Siarkotransferazy

EC 2.8.2. Siarczanotransferazy

EC 2.8.3. CoA-transferazy

EC 2.8.4. transportujące grupy tioalkylowe

EC 2.8. transportujące grupy zawierające selen

Hydrolazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju

wiązanie ulega hydrolizie. Trzeci człon numeru - pod-podklasa - uściśla typ hydrolizowanego

wiązania.

EC 3.Hydrolazy

EC 3.1. działające na wiązanie estrowe

EC 3.1.1. Hydrolazy estrów karboksylowych esterazy, lipazy i laktonazy

EC 3.1.2. Hydrolazy tioestrów

EC 3.1.3. Hydrolazy monoestrów fosforowych fosfatazy i nukleotydazy

EC 3.1.4. Hydrolazy diestrów fosforowych fosfolipazy i fosfodiesterazy

EC 3.1.5. Hydrolazy monoestrów trifosforowych

EC 3.1.6. Hydrolazy estrów kwasu siarkowego

EC 3.1.7. Hydrolazy monoestrów difosforowych difosfatazy

EC 3.1.8. Hydrolazy triestrów fosforowych

EC 3.1.11. 3.1.31. Egzo- i endorybonukleazy

EC 3.2. Glikozylazy

58

EC 3.2.1. Glikozydazy, i inne enzymy hydrolizujące O- i S-glikozyle

EC 3.2.2. hydrolizujące związki N-glikozylowe

EC 3.3. działające na wiązanie eterowe

EC 3.3.1. Hydrolazy tioeterowe i trialkilosulfonianowe

EC 3.3.2. Hydrolazy eterowe

EC 3.4. działające na wiązanie peptydowe hydrolazy peptydowe

EC 3.4.11. Aminopeptydazy

EC 3.4.13. Dipeptydazy

EC 3.4.14. Dipeptydylo- i tripeptydylo-peptydazy

EC 3.4.15. Peptydylo-dipeptydazy

EC 3.4.16 Karboksypeptydazy serynowego typu

EC 3.4.17 Metalokarboksypeptydazy

EC 3.4.18 Karboksypeptydazy cysteinowego typu

EC 3.4.19 Omega peptydazy

EC 3.4.21. Endopeptydazy serynowe

EC 3.4.22. Endopeptydazy cysteinowe

EC 3.4.23. Endopeptydazy aspartylowe

EC 3.4.24. Metaloendopeptydazy

EC 3.4.25. Endopeptydazy treoninowe

EC 3.4.99. Endopeptydazy o nierozpoznanym mechanizmie działania

EC 3.5. działające na wiązanie CN, inne niż peptydowe

EC 3.5.1. w linearnych amidach m.in. amidazy i deacylazy

EC 3.5.2. w cyklicznych amidach

EC 3.5.3. w linearnych amidynach

EC 3.5.4. w cyklicznych amidynach

EC 3.6. działające na bezwodniki kwasowe

EC 3.6.1. w związkach zawierających fosforanowe bezwodniki m.in. difosfatazy

EC 3.6.2. w związkach zawierających sulfonowe bezwodniki

EC 3.6.3. działające na bezwodniki kwasowe; katalizujące przenoszenie transmembranowe

EC 3.6.5. działające na GTP; związane z komórkowym transportem

EC 3.7. działające na wiązanie CC

EC 3.7.1. w ketonowych substancjach

EC 3.8. działające na halogenkowe wiązania

EC 3.8.1. w związkach Chalogen

EC 3.9. działające na wiązanie fosforo-azotowe

EC 3.10. działające na wiązanie siarkowo-azotowe

EC 3.11. działające na wiązanie węglowo-fosforowe

EC 3.11. działające na wiązanie siarkowo-siarkowe

EC 3.11. działające na wiązanie węglowo-siarkowe

Liazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego rodzaju wiązanie

ulega rozerwaniu. Trzeci człon numeru - pod-podklasa - uściśla typ rozrywanego wiązania.

EC 4. Liazy

EC 4.1. Liazy węgiel-węgiel

EC 4.1.1. karboksy-liazy dekarboksylazy

EC 4.1.2. aldehydo-liazy

EC 4.1.3. liazy ketokwasów

EC 4.1.99. inne węgiel-węgiel liazy

EC 4.2. Liazy węgiel-tlen

EC 4.2.1. hydro-liazy dehydratazy

EC 4.2.2. działające na polisacharydy

EC 4.2.3. działające na fosforany syntazy

EC 4.2.99 inne węgiel-tlen liazy

EC 4.3. Liazy węgiel-azot

EC 4.3.1. amoniako-liazy

EC 4.3.2. liazy działające na amidy, amidyny, itp.

EC 4.3.3. amino-liazy

EC 4.3.99. inne węgiel-azot liazy

EC 4.4. Liazy węgiel-siarka

EC 4.5. Liazy węgiel-halogen

EC 4.6. Liazy fosfor-tlen

Izomerazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) uściśla typ katalizowanej

reakcji. Trzeci człon numeru - pod-podklasa - wskazuje, jakie związki lub ugrupowania ulegają

izomeryzacji.

EC 5. Izomerazy

59

EC 5.1. Racemazy i epimerazy

EC 5.1.1. działające na aminokwasy i ich pochodne

EC 5.1.2. działające na hydroksykwasy i ich pochodne

EC 5.1.3. działające na węglowodory i ich pochodne

EC 5.1.99. działające na inne związki

EC 5.2. cic-trans izomerazy

EC 5.3. wewnątrzcząsteczkowe oksydoreduktazy

EC 5.3.1. wzajemnie przekształcające się aldozy i ketozy

EC 5.3.2. wzajemnie przekształcające się ugrupowania enolowe i ketonowe tautomerazy

EC 5.3.3. przenoszące wiązania C=C Δ-izomerazy

EC 5.3.4. przenoszące wiązania SS

EC 5.3.99. inne wewnątrzcząsteczkowe oksydoreduktazy

EC 5.4.wewnątrzcząsteczkowe transferazy mutazy

EC 5.4.1. transportujące grupy acylowe

EC 5.4.2. fosfotransferazy fosfomutazy

EC 5.4.3. transportujące grupy aminowe

EC 5.4.99. transportujące inne grupy

EC 5.5. wewnątrzcząsteczkowe liazy

EC 5.99. inne izomerazy

Ligazy W tej klasie enzymów drugi człon numeru (podklasa) wskazuje, jakiego typu wiązanie jest

tworzone. Trzeci człon numeru - pod-podklasa - uściśla, jakiego typu związki lub ugrupowania

powstają w wyniku syntezy.

EC 6. Ligazy

EC 6.1. tworzące wiązanie węgiel-tlen

EC 6.1.1. ligazy tworzące aminoacylo-tRNA i spokrewnione związki

EC 6.2. tworzące wiązanie węgiel-siarka

EC 6.2.1. ligazy kwas-tiol syntetazy acylo-CoA

EC 6.3. tworzące wiązanie węgiel-azot

EC 6.3.1. ligazy kwas-amoniak syntetazy amidowe

EC 6.3.2. ligazy kwas- D-aminokwas syntetazy peptydowe

EC 6.3.3. cyklo-ligazy

EC 6.3.4. inne ligazy tworzące wiązanie węgiel-azot

EC 6.3.5. ligazy wiązania węgiel-azot z glutaminą, jako amido-N donorem

EC 6.4. tworzące wiązanie węgiel-węgiel

EC 6.5. tworzące wiązanie fosforowoestrowe

EC 6.6. tworzące wiązanie azot-metal chelatazy

Izoenzymy

Izoenzymy, to odmiany tego samego enzymu o identycznym centrum aktywnym i mechanizmie

działania, a różniące się w niewielkim stopniu sekwencją aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym.

Konsekwencją tego mogą być pewne różnice właściwości fizyko-chemicznych i biologicznych takich

odmian enzymu, np.: różne pI, optymalne pH i temperatura działania, KM i odczyn immunologiczny.

Izoenzymy są umieszczane w Klasyfikacji i Nomenklaturze Enzymów pod tym samym numerem.

Zazwyczaj w komentarzu do danego enzymu wspomina się o jego odmianach i podaje odpowiednie

odnośniki literaturowe.

2.2.5. Czynniki wpływające na efektywność działania enzymów

Zaletą enzymów są łagodne pod względem temperatury, pH i ciśnienia warunki działania, co

obniża koszt procesów, w których uczestniczą oraz pozwala na zachowanie w otrzymanych

produktach cennych, a nieodpornych na drastyczne warunki obróbki, składników. Ponadto przebieg

procesów katalizowanych przez enzymy można łatwo regulować, zmieniając stężenie enzymu bądź

temperaturę lub pH środowiska reakcyjnego.

Do podstawowych czynników określających przebieg (kinetykę) reakcji enzymatycznych należą:

pH środowiska, temperatura, stężenie jonów, potencjał oksydoredukcyjny, obecność inhibitorów,

aktywatorów oraz stabilizatorów (substancji hamujących lub podwyższających efektywność działania

enzymu) i oczywiście tak istotne parametry procesu, jak stężenie enzymu i substratu, o czym mowa

była już wcześniej. Optymalne pH

60

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12

pH

Aktywność względna [%]

pepsyna

metaloproteinaza

B.subtilis subtilizyna

pH środowiska. Szybkość reakcji enzymatycznych w znacznym stopniu zależy od pH

środowiska. Każdy enzym wykazuje charakterystyczne dla siebie optimum pH. Na poniższym

rysunku przedstawiono wpływ pH na aktywność trzech endopeptydaz: pepsyny, metaloproteinazy z

Bacillus subtilis oraz subtilizyny.

Wpływ pH na aktywność trzech różnych endopeptydaz

Jak widać, każda z tych endopeptydaz działa w zupełnie innym zakresie pH: pepsyna w

środowisku kwaśnym (optymalne pH 1,8), metaloproteinaza w obojętnym (optymalne pH 7,3), a

subtilizyna w alkalicznym (optymalne pH 10,2). Związane jest to z wpływem stężenie jonów

hydronowych na konformację centrum aktywnego każdej z nich. Pepsyna, której aminokwasem

bezpośrednio działającym w centrum aktywnym jest kwas asparaginowy, wymaga jego formy

niezdysocjowanej (czyli grupy -COOH). Grupa taka w przewadze występuje w środowisku kwaśnym.

Endopeptydazy serynowe, których centrum aktywne opisano wyżej, wymagają do aktywnego

działania zdysocjowanej formy kwasu asparaginowego (grupy karboksylanowej -COO-), która

występuje w przewadze w środowisku alkalicznym.

Należy ponadto zwrócić uwagę na to, że o ile subtilizyna jest aktywna w szerokim zakresie pH od

6 do 11, to pozostałe dwie proteinazy działają w bardzo wąskim przedziale pH i niewielkie jego

zmiany wykazują znaczny wpływ na wzrost lub obniżenie ich aktywności. Optymalne pH niektórych

enzymów (np. aktywność subtilizyny) zmieniać się może w zależności od substratu na który działają,

choć są to wahania nie większe niż 0.5 jednostki (np. subtilizyna wobec hemoglobiny optimum pH

wykazuje przy 10,2, a wobec kazeiny 10,5).

Optymalna temperatura. Temperatura z jednej strony przyspiesza samą reakcję enzymatyczną, z

drugiej jednak przyspiesza denaturację enzymu,

co wiąże się z jego inaktywacją. Na poniższym

rysunku przedstawiono wpływ temperatury na

aktywność subtilizyny. Do osiągnięcia pewnej

granicznej wielkości (w tym przypadku

temperatury 60C), szybkość reakcji

katalizowanej przez ten enzym wzrasta, podobnie

jak to się dzieje przy wszystkich reakcjach

chemicznych, a następnie dość gwałtownie spada

do wartości zerowych. Większość enzymów

drobnoustrojowych najefektywniej działa w

granicach 60C. Enzymy roślinne i zwierzęce z

reguły już powyżej 40-50C ulegają denaturacji. Znane są enzymy z bakterii termofilnych,

wykazujące optimum działania nawet w temperaturach sięgających 90C.

Stabilność enzymów w roztworach wodnych. Jak już wspomniano pH środowiska i temperatura

bezpośrednio wpływają na szybkość reakcji enzymatycznej. Jednakże mogą również niekorzystnie

oddziaływać na sam enzym, prowadząc do jego inaktywacji. Dlatego niezbędna jest znajomość

wpływu tych dwóch czynników na aktywność enzymu w subtilizyny stabilność subtilizyny warunkach

rzeczywistych lub do nich zbliżonych, panujących podczas procesu prowadzonego z jego udziałem.

0

20

40

60

80

100

-20 0 20 40 60 80

Temperatura [oC]

Aktywność względna [%]

Wpływ temperatury na aktywność subtilizyny

61

0

20

40

60

80

100

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

pH

Aktywność względna [%]

w buforze

Z dodatkiem

1% CaCl2

Preinkubacja:

45C, 60min

Większość enzymów jest względnie stabilna w obszarze pH zbliżonym dla ich optymalnego działania,

jakkolwiek nie jest to regułą. Na rysunku 3 przedstawiono wpływ pH na stabilność subtilizyny. Jej

optymalne pH (porównaj rys.1) przekracza 10, jednakże obszar stabilności tego enzymu w warunkach

przykładowej reakcji (1% kazeiny, 45 C, 60 min.) zawarty jest w zakresie 6.5-9.5, a w pH zbliżonym

do optymalnego straty aktywności (w wyniku postępującej autolizy) sięgają 50% wyjściowej.

Wpływ pH na stabilność subtilizyny w roztworze buforowym i z dodatkiem 1% CaCl2

Dużo poważniejsze straty enzymu spowodowane mogą być wpływem podwyższonej temperatury

reakcji. Znaczna część enzymów jest bardzo wrażliwa na ten czynnik (wyjątkiem są niektóre enzymy

termostabilne otrzymywane ze szczepów drobnoustrojów termofilnych). Na rys.4 pokazano wpływ

temperatury na zachowanie się subtilizyny podczas przykładowego procesu hydrolizy kazeiny (1%

roztwór substratu w buforze o pH 9).

Wpływ temperatury na stabilność subtilizyny w roztworze buforowym i z dodatkiem 1%CaCl2

Należy wyraźnie zaznaczyć, że subtilizyna (konsekwentnie w tekście niniejszego opracowania

rozpatrywana jako enzym modelowy) jest wyjątkowo odporna na działanie wielu czynników fizykochemicznych,

w tym temperatury. Tym niemniej w warunkach testu, po 40 minutach reakcji

prowadzonej w 60 C straty jej aktywności sięgają 70%. W tym samym czasie w temperaturze 70 C

enzym ulega już pełnej inaktywacji. Natomiast w 50C po 60 minutach straty enzymu są stosunkowo

niewielkie i wynoszą 36%. Oczywiście, ostatecznego wyboru temperatury dokonuje się po

szczegółowej analizie wyników wszystkich badań, uwzględniającej aspekty technologiczne i

ekonomiczne procesu. Przy tego typu analizach przydatne jest wyznaczenie produktywności reakcji

enzymatycznej w kilku wytypowanych temperaturach (rys.5). Wybór optymalnej temperatury

skojarzony jest w tym przypadku z czasem procesu, który może być determinowany innym

czynnikiem (np. kosztem energii).

0

20

40

60

80

100

0 15 30 45 60 75 90 105 120

c z as [minuty ]

Aktywność względna [%]

20C

40C

60C

70C 60C

Preinkubacja:

w buforze o pH 9

Z dodatkiem

1%CaCl2

62

Rys. 5 Produktywność subtilizyny w hydrolizie kazeiny

Inhibitory, aktywatory, stabilizatory.

Oprócz wymienionych wyżej czynników inaktywujących działanie enzymów, istnieje grupa

substancji zdolnych do wybiórczego hamowania ich aktywności katalitycznej (są to tzw. inhibitory

specyficzne). W opracowaniu pominięto szczegóły dotyczące tego działu enzymologii. Należy jednak

wiedzieć, że tego typu naturalne inhibitory występują w przyrodzie, co może mieć istotne znaczenie

dla aplikacji enzymów w niektórych przypadkach. Przykładem mogą być specyficzne inhibitory

proteinaz serynowych (w tym subtilizyny) znalezione m.in. w ziemniakach czy soi, które skutecznie

blokują aktywność tej grupy enzymów.

Istnieje wiele typów cząsteczek , które są zdolne do zakłócania aktywności danego enzymu.

Każda cząsteczka działająca bezpośrednio na enzym w kierunku zmniejszenia jego aktywności

katalitycznej jest określana jako inhibitor. Pewne inhibitory enzymów są normalnymi metabolitami

komórkowymi, które hamują dany enzym w ramach naturalnej metabolicznej kontroli odpowiedniego

szlaku. Inne inhibitory mogą być substancjami obcymi dla organizmu, takimi jak toksyny i leki, i w

tym przypadku hamowanie enzymu może mieć działanie terapeutyczne , ale również letalne.

Rozróżnia się dwa główne typu inhibicji : - nieodwracalną - odwracalną.

Inhibicję odwracalną można podzielić na:

1) kompetycyjną

2) niekompetycyjną

Inhibicja nieodwrcalna polega na wiązaniu się inhibitora i enzymu w sposób trwały ,

nieodwracalny, często tworząc wiązania kowalencyjne z resztami aminokwasów, znajdującymi się w

miejscu aktywnym lub jego pobliżu i w ten sposób inaktywują enzym na stałe. W wiązaniu tym biorą

udział reszty Ser i Cys mające , odpowiednio, reaktywne grupy -OH i -SH . Przykładem może być

związek diizopropylofluorofosforan (DFP) , składnik gazów bojowych (soman) działający na układ

nerwowy, reaguje z resztą Ser w miejscu aktywnym enzymu esterazy acetylocholinowej,

nieodwracalnie hamując enzym i uniemożliwiając przekazywanie impulsów nerwowych.

Inhibitor kompetycyjny jest zazwyczaj strukturalnie podobny do normalnego substratu danego

enzymu. Dzięki temu współzawodniczy z cząsteczkami o wiązanie się z miejscem aktywnym. Enzym

może się wiązać albo z cząsteczkę substratu, albo cząsteczkę inhibitora, ale nie z obiema

jednocześnie. Inhibitor kompetycyjny wiąże się z miejscem aktywnym odwracalnie. Przy dużych

stężeniach substratu działanie inhibitora kompetycyjnego zostaje przezwyciężone , ponieważ duże

stężenie substratu będzie z powodzeniem współzawodniczyć z cząsteczką inhibitora o wiązanie się w

miejscu aktywnym. Nie nastąpi więc żadna zmiana w wartości Vmax enzymu , ale w obecności

inhibitora kompetycyjnego zmniejsza się powinowactwo enzymu do jego substratu i dlatego wratośc

63

Km wzrasta. Przykładem hamowania kompetycyjnego może być dehydrogenaza bursztynianowa.

Enzum ten używa bursztyniany jako substratu i jest hamowany kompetycyjnie przez malonian, który

różni się od bursztynianu posiadniem tylko jednej, a nie dwóch grup metylenowych.

Inhibitor niekompetycyjny wiąże się odwracalnie w innym miejscu enzymu niż jego miejsce

aktywne i powoduje zmianę przestrzennego kształtu enzymu, co prowadzi do zmniejszenia

aktywności katalitycznej. Ponieważ inhibitor wiąże się w innym miejscu niż substrat, enzym może

wiązać albo inhibitor, albo substrat równocześnie. Efektu inhibitora niekompetycyjnego nie można

przezwyciężyć przez zwiększanie stężenia substratu i dlatego zmniejsza się wartość Vmax . W inhibicji

niekompetycyjnej powinowactwo enzymu do substratu pozostaje nie zmienione, a więc wartość Km

nie zmienia się . Przykładem inhibicji niekompetycyjnej jest działanie pepstatyny na enzym reninę .

Na działanie enzymów wpływ mogą wywierać jony obecne w środowisku reakcyjnym. Jony

dwuwartościowych metali, jak magnez, wapń, cynk, mangan lub kobalt w specyficzny sposób

aktywują wielu enzymów (t.zn. zwiększa- ją szybkość reakcji przez nie katalizowanej). Aktywatorami

mogą być też aniony np. amylaza ślinowa jest aktywowana jonami Cl . Jony metali mogą wykazywać

również wpływ stabilizujący na enzym (tzn. podwyższać jego stabilność wobec niekorzystnego

wpływu m.in. pH i temperatury). Przy- kładem może być wpływ jonów Ca na subtilizynę. Na rys. 3 i

4 pokazano, że jony te podwyższają termostabilność subtilizyny (z 50 do 60 C) i jej trwałość w

alkalicznym środowisku (z pH 9.5 do 10.5). Natomiast jony wielu metali ciężkich (np. Hg, Cu, Pb) są

64

silnymi inhibitorami enzymów (tzn. inaktywują one enzym, tym samym hamując reakcję

przebiegającą przy jego udziale). Jest to inhibicja niespecyficzna, której podlegają wszystkie znane

enzymy. Istnieje ponadto wiele innych substancji mających zdolność niespecyficznej inaktywacji

enzymów (związanej ze zniszczeniem naturalnej struktury białka). Do nich zalicza się mocznik,

aldehyd mrówkowy czy glutarowy, silne utleniacze (np. nadmanganian lub chlor).

Koncentracja wody.

W praktyce nie wszystkie reakcje katalizowane przez enzym przebiegają do końca. Należy

bowiem pamiętać, że są one odwracalne i po pewnym czasie ustala się równowaga pomiędzy reakcją

przebiegającą do "przodu" i odwrotną. Jednym z czynników wpływających na ich stałą równowagi

może być stężenie wody w środowisku reakcyjnym. Dotyczy to zwłaszcza prze- mian, w których

woda jest jednym z reagentów (np. w reakcjach enzymatycznej hydrolizy). Wykazano, że stężenie

wody decyduje o kierunku ich przebiegu. I tak, subtilizyna w środowisku wodnym katalizuje

hydrolizę wiązań peptydowych w białkach lub wiązań estrowych w licznych estrach, natomiast w

środowisku bezwodnym lub o obniżonej koncentracji wody katalizuje rewersję tych reakcji. Dla

pożądanego przesunięcia stałej równowagi takich reakcji stosuje się rozmaite zabiegi. M.in. rewersję

enzymatycznej hydrolizy (czyli syntezę) osiąga się, stosując w środowisku reakcyjnym

rozpuszczalniki organiczne, prowadząc proces w układzie dwufazowym (z rozpuszczalnikiem

apolarnym nasyconym wodą), korzystnie z immobilizowaną formą enzymu itp. Obecnie jest to jeden z

najbardziej preferowanych kierunków badawczych, m.in. z uwagi na potencjalnie możliwe do

uzyskania efekty (również o charakterze aplikacyjnym w wielu procesach przemysłowych).

Charakterystyka biokatalizatorów przemysłowych

Termin "biokatalizatory przemysłowe" (używany obecnie w bardzo szerokim znaczeniu) oznacza

katalizatory otrzymywane w skali przemysłowej na drodze biologicznej. Pod tym pojęciem rozumie

się zarówno enzymy: natywne, spreparowane rozmaitymi technikami (np. ich immobilizowane

formy), ich mikstury, rozmaite proszki zawierające ich dodatek, jak i komórki: całe lub ich fragmenty,

żywe i martwe.

Enzymy wyodrębniane są z tkanek zwierzęcych lub roślinnych oraz wytwarzane przez

drobnoustroje. Te pochodzące z dwóch pierwszych wymienionych źródeł występują na rynku

stosunkowo w małych ilościach i są względnie drogie. Niektóre z nich: renina, pepsyna, trypsyna,

papaina i bromelaina są ekstrahowane ze spożywczych surowców.

Tabela 1 Enzymy produkowane przez mikrobiologiczną fermentację (adaptowane z Trampera, 1994).

Enzym Substrat Mikroorganizm

-amylaza Skrobia Bacillus amyloliquefaciens,

Bacillus licheniformis

-amylaza Skrobia Bacillus polymyxa

Amyloglukozydaza

(glukoamylaza)

Dekstryny Aspergillus niger

Rhizopus niveus

Celulazy Celuloza Phanerochaete chrysosporium

Trichoderma reesei

Izomeraza glukozowa Glukoza Actinoplanes missouriensis

Streptomyces murinus

Streptomyces olivochromogenus

Oksydaza glukozowa Glukoza Aspergillus niger

-glukozydaza Maltoza Aspergillus niger

Bacillus amyloliquefaciens

Saccharomyces cerevisiae

65

Lipazy Lipidy Aspergillus niger

Candida rugosa

Geotrichum candidum

Rhizopus arrhizus

Pektynoesteraza Pektyna Aspergillus niger

Aspergillus oryzae

Proteinaza alkaliczna

(serynowa)

Białka Aspergillus oryzae

Bacillus licheniformis

Bacillus subtilis

Proteinaza kwaśna

(pepsyno-podobna)

Białka Aspergillus oryzae

Aspergillus saitoi

Proteinaza kwaśna (reninopodobna)

białka Endothia parasitica

Mucor michei

Mucor pusillus

Proteinaza obojętna białka

Bacillus stearothermophilus

Bacillus subtilis

Pullulanaza

Amylopektyna

Aerobacter aerogenes

Bacillus cereus var.mycoides

W wyniku rozwoju biotechnologii, mikroorganizmy stanowią podstawowe źródło enzymów.

Zastosowanie mutacji i specjalnych technik selekcji drobnoustrojów pozwoliło osiągnąć wysoki

poziom produkowanych przez nie enzymów, w niektórych przypadkach sięgający 10% wszystkich

wytwarzanych białek . Ponadto użycie dużych fermentorów (do 300 m ) sprawia, że obecnie w

krótkim czasie i przy niskich kosztach produkuje się na skalę przemysłową olbrzymie ilości

rozmaitych enzymów (tabela 1).

Niezależnie od źródła pochodzenia enzymy mogą katalizować te same reakcje chemiczne, ale nie

muszą posiadać identycznej budowy chemicznej, a tym samym mogą znacznie różnić się optymalnymi

warunkami działania. I tak na przykład α -amylaza katalizuje hydrolizę wiązań ŕ-1,4- między

cząsteczkami D-glukozy w polisacharydach, takich jak amyloza. α-amylaza trzustkowa posiada

optymalne pH około 7 i optymalną temperaturę 37 C, podczas gdy enzym ten wyodrębniony z

Aspergillus oryzae - optymalne pH 4,7 i optymalną temperaturę działania 50 C, a z Bacillus subtilis

odpowiednio pH 6,5 i 75 C. W zasadzie te dwa parametry (pH i temperatura) decydują o możliwości

zastosowania enzymów w procesach produkcji środków spożywczych przebiegających w różnych

warunkach (np. w różnych gałęziach przemysłu spożywczego). Fakt ten tłumaczy występowanie na

rynku rozmaitych preparatów homologicznych enzymów. Należy jednak mieć na uwadze, że tylko

część drobnoustrojów i wytwarzanych przez nie bioproduktów (w tym enzymów) traktowana jest jako

nieszkodliwa dla stosowania w środkach spożywczych (tabela 2).

W ogólnym zarysie proces produkcji enzymów drobnoustrojowych polega na hodowli

wyselekcjonowanych kultur mikroorganizmów na specjalnie opracowanych dla każdej z nich

pożywkach, z zachowaniem specyficznych warunków fizycznych środowiska hodowlanego, a w

następnym etapie wyodrębnieniu wytworzonego enzymu. Jeśli enzym jest nagromadzany

pozakomórkowo, to można go wyodrębnić z podłoża pohodowlanego na drodze wirowania lub

filtracji. Filtrat lub supernatant poddaje się ogólnie stosowanym proce- durom wydzielania i

oczyszczania białek. Jeśli zanieczyszczenia zawarte w preparacie nie działają ujemnie na własności

katalityczne enzymu oraz nie stanowią toksykologicznego zagrożenia dla konsumenta nie zachodzi

konieczność poddawania ich skomplikowanym i drogim procesom oczyszcza- nia. W dużej mierze

przeznaczenie enzymu decyduje o stopniu czystości jego handlowych preparatów. Ogólnie biorąc,

preparaty enzymów wykorzystywane dla celów analitycznych charakteryzują się najwyższą czystością

(niekiedy są one homogennym białkiem enzymatycznym). Również enzymy stosowane w farmacji

posiadają wysoką czystość. Natomiast te same enzymy przeznaczone dla przemysłu spożywczego nie

wymagają już tak wysokiego stopnia czystości. Dla niektórych technologii nie muszą być nawet

wyjaławiane. Coraz częściej dla konkretnego procesu wytwarza się specjalnie przeznaczony preparat

enzymu, dobierając jego aktywność tak, aby dodana ilość wynosiła 0.05-0.5 % na kg substratu.

66

Tabela 1 Mikroorganizmy używane dla produkcji enzymów (adaptowane z Gacesa i Hubble, 1987).

Grupa A

Mikroorganizmy tradycyjnie używane w produkcji żywności (nie wymagające

testowania)

 Bacillus subtilis (włączając szczepy znane jako mesentericus, natto i

amyloliquefaciens),

 Aspergillus niger (włączając awamori, foetidus, phoenicis, saitoi i usamii),

 Asp. oryzae (włączając sojae i effesus)

 Mucor javanicus

 Rhizopus arrhizus, oligosporus, oryzae

 Saccharomyces cerevisiae

 Kluyveromyces fragilis, lactis

 Leuconostoc oenos

Grupa B

Mikroorganizmy uważane za nieszkodliwe w żywności (enzymy wytwarzane

przez nie, testowane są jedynie pod kątem ewentualnej toksyczności)

 Bacillus stearothermophilus, licheniformis, coagulans, megaterium, circulans,

 Klebsiella aerogenes

Grupa C

Mikroorganizmy nie włączone do grup A i B (ewentualne stosowanie enzymów

produkowanych przez nie w produkcji żywności, wymaga specjalistycznych

testów)

 Mucor miehei, pusillus

 Endothia parasitica

 Actinoplanes missouriensis

 Streptomyces albus, olivaceus

 Bacillus cereus

 Trichoderma reesei (T. viride)

 Penicillium dimorphosporum, simplicissium, funiculosum

Zwykle handlowe preparaty zawierają od 2 do 10% suchej masy czystego enzymu. Reszta to

zanieczyszczenia pochodzące z podłoża hodowlanego (np. inne białka wytworzone przez rosnącą

kulturę, niektóre z nich będące również enzymami) oraz celowo dodane stabilizatory, wypełniacze itp.

Z aplikacyjnego punktu widzenia istotna jest zwłaszcza wiedza na temat enzymów stanowiących

zanieczyszczenie handlowych preparatów. Niektóre z nich mogą bowiem katalizować niekorzystne,

uboczne reakcje chemiczne. Niekiedy jednak gotowe preparaty celowo są mieszaniną kilku enzymów

(np. preparaty typu "Protogal" przeznaczone dla detergentów, a otrzymywane w oparciu o technologię

opracowaną w Instytucie Biochemii Technicznej PŁ zawierają w swoim składzie proteinazę, ŕamylazę

i lipazę- wszystkie trzy przydatne w środkach piorących).

Przeznaczenie preparatu enzymatycznego określa jego postać końcową. Mogą być one

otrzymywane w postaci ciekłego koncentratu lub ciała stałe- go, o różnym stopniu oczyszczenia,

ewentualnie z dodatkiem stabilizatorów. Preparaty enzymatyczne w stanie stałym charakteryzują się

znacznie wyższą stabilnością od preparatów ciekłych. Te drugie podatne są na działanie

drobnoustrojów, a ponadto w środowisku wodnym enzym ulega łat- wiej denaturacji i dodatkowo

narażony jest na działanie enzymów proteolitycznych, których obecność w gotowych preparatach

(choćby w nieznacznych ilościach) jest dość powszechna. Preparaty stałe enzymu nie powinny być

pyliste (z uwagi na możliwość wywołania reakcji alergicznych u pracowników), stąd najczęściej

wytwarzane są w postaci granulowanej.

Zasadniczym przełomem w biotechnologii było zastosowanie enzymów immobilizowanych. W

uogólnieniu, immobilizacją enzymu można nazwać za- biegi umożliwiające wielokrotne jego użycie.

Jeden ze sposobów immobilizacji polega na unieruchomieniu enzymu na nośniku. Takie formy

enzymów w wielu przypadkach wykazują wyższą stabilność od natywnych enzymów, zarówno w

67

trakcie przechowywania jak i w warunkach samej reakcji bio- chemicznej. Jednakże największa

korzyść związana jest z możliwością ich wielokrotnego stosowania, w tym w procesach o charakterze

ciągłym (np. w reaktorze o działaniu ciągłym z immobilizowaną izomerazą glukozową produkuje się

wysoko fruktozowy syrop). Metody stosowane w immobilizacji enzymów mogą być również

wykorzystane w unieruchamianiu komórek zarówno martwych jak i żyjących. Unieruchomione

biokatalizatory (enzymy i komórki) są szczególnie obiecujące w zastosowaniu do procesów

przetwórstwa żywności. Chemiczne katalizatory nie mogą konkurować z enzymami, chociażby ze

względu na przepisy sanitarne obowiązujące w produkcji żywności. Najnowszym kierunkiem badań w

tym zakresie jest ko-immobilizacja enzymów, czyli jednoczesne unieruchomienie na wspólnym

nośniku dwu lub więcej enzymów przeznaczonych do katalizowania pojedynczego procesu.

Cena preparatów enzymatycznych jest bardzo zróżnicowana (od 3 $/kg w przypadku preparatu

glukoamylazy przeznaczonego do scukrzania dekstryn, aż do 1 miliona $/kg w przypadku czynnika

VIII enzymów trombolitycznych stosowanych w medycynie). Zależy ona od wiele czynników, w tym

tak oczywistych jak koszty produkcji (a głównie stopień oczyszczenia enzymu), ale także w dużej

mierze zależy od rynkowego zbytu, konkurencyjności i skuteczności działania (ich produktywności w

aplikacyjnych warunkach). Ogólnie biorąc, najdroższe są enzymy przeznaczone dla analityki, a najtańsze

stosowane masowo w różnych gałęziach przemysłu (tabela 3). Przyjmuje się ponadto, że koszt

aplikacyjny enzymów przemysłowych powinien stanowić 2-4 % kosztów całego procesu, co w pewien

sposób determinuje ich cenę.

Tabela 2 Wielkość produkcji enzymów i ich cena (adaptowane z Trampera, 1994)

Typ aplikacji Wielkość produkcji (tony) Cena ($/kg)

Analityka 10-3 - 1 106 - 109

Farmacja 1 - 102 102 - 105

Specjalna 1 - 102 102 - 105

Przemysł masowy 102 - 104 3 - 50

Potencjał aplikacyjny enzymów tkwi w specyficzności i ich katalitycznej wydajności, przy czym

działają one w umiarkowanych warunkach pH, temperatury i ciśnienia zapewniając wysoką

wydajność nawet w skomplikowanych reakcjach lub ich ciągach. Jednakże z aplikacyjnego punktu

widzenia dla każdego konkretnego procesu i enzymu w nim biorącego udział konieczna jest

skojarzona optymalizacja temperatury, pH środowiska reakcyjnego, stężenia reagentów oraz innych

parametrów technologicznych. Niepowodzenia napotykane niekiedy w stosowaniu enzymów w

krajowych technologiach, o których się nieraz słyszy, wynikać mogą z niepełnej wiedzy o

właściwościach samych enzymów, ich preparatów lub procesach, w których biorą udział.

68

ROZDZIAŁ 3. BIOCHEMIA GENÓW

RNA

Nukleotyd

DNA

Nukleozyd

H3PO4 H3PO4

ryboza deoksyryboza

zasady purynowe

i pirymidynowe

C

O

C

C C

OH

H

OH

H

HOH2C

H

H

OH

3'

4'

5'

2'

1' C

O

C

C C

OH

H

H

OH

H

HOH2C

H

H

3'

4'

5'

2'

1'

D-ryboza D-deoksyryboza

N

N

pirymidyna

N

N

N

N

1

1

2 2

3

3

4

4 5

6

7

9 8

H

5

6

puryna

N

N

NH2

O

H

cytozyna

N

O N

OH

N

O N

OH

CH3

H H

uracyl tymina

N

N N

N

NH2

H

N

N N

N

OH

H2N

H

adenina guanina

69

Biochemia ma olbrzymie znaczenie praktyczne dla wielu dziedzin życia codziennego, w tym

również w przemyśle spożywczym. Powstały nowe gałęzie przemysłu spożywczego oparte na

osiągnięciach biochemii (m.in. biotechnologia). Wielka rola przypada biochemii w unowocześnianiu

procesów technologicznych przemysłu spożywczego oraz w opracowaniu nowych metod przeróbki

surowców (a zwłaszcza wykorzystania enzymów). Dzięki temu udaje się zredukować do minimum

różnorodne straty zarówno ilościowe, jak i jakościowe, wynikające z procesów niepożądanych dla

technologii.

70

71

PISMIENNICTWO

Stryer L.: Biochemia, PWN, W-wa 1986

Gacesa P., Hubble J.: Enzyme technology. Open University Press, 1987.

Chaplin M.F., Bucke C.: Enzyme technology. Cambridge University Press, 1990.

Chmiel A., Biotechnologia, PWN, W-wa 1991

Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W.: Biochemia Harpera, Wyd. Lekarskie

PZWL, W-wa 1994

Tramper J. W: Applied Biocatalysis. ed.by Cabral J.M.,Best D.,Boross L., and Tramper J.,

Harwood Ac. Publish., 1994, s.1-45

Galas E.: Wiadomości chemiczne (1984), 11, 11-30

Galas E., Trzmiel T.: Kosmos (1989), 38, 15-24

72

dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD)

i jego fosforan (NADP)

P P

+

N

CONH2

OH HO

CH2O

O

O

OH OH

OH2C

( P )

N

N

N

N

NH2

dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD)

N

N N

NH

H3C

H3C

CH2

O

O

CHOH

CHOH

CHOH

CH2O P P adenozyna

C

Enzym-NH

CH2 CH2 CH2 CH2 CH

CH2

S

CH2

S

O

liponian

ubichinon (Q)

O

O

H3C

H3C CH3

( )n H

N

CH2

CH3 CH

HC CH

N

CH3

CH

CH2

N

HOOC CH2 CH2

H3C

Fe+3

CH3

HOOC CH2 CH2

HC CH

N

hemina (porfiryna)

O

OH OH

N

N

N

N

NH2

CH2 S CH2

CH3

CH2

CHNH2

COOH

+

adenozynometionina

N

N

N

N

OH

H2N

CH2 NH C NH

O

CH

COOH

CH2

CH2

COOH

H

H

kwas tetrawodorofoliowy (H4folian)

N

H3C N NH2

CH2

N

S

CH2

CH3

CH2 O P P

+

difosfotiamina (DPT)

H3C N

HO CH2OH

C

H O

pirydoksal

HN NH

O

S C

O

NH-Enzym

biotyna

adenozyno-5`-fosforan

koenzym A (CoA-SH)

P P O CH2 C

CH3

CH3

CH

OH

C

O

NH CH2 CH2 SH

Dodatek

S Lip<S__

---