Ćwiczenie 7 (16.04.2010)

''Detekcja zakażeń w hodowlach komórkowych techniką PCR"

Przygotowanie teoretyczne do ćwiczeń:

- typy hodowli komórkowych, sterylizacja, praca w warunkach jałowych;

- zakażenia w hodowlach komórkowych (wirusowe, bakteryjne, mikoplazmą);

- techniki detekcji zakażeń mykoplazmą (PCR, luminescencja, mikroskopia fluorescencyjna).

W czasie ćwiczeń przeprowadzona zostanie łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) z wykorzystaniem starterów dla genu 16s rRNA, występującego wyłącznie u Mycoplasma sp. DNA prokariotyczne i eukariotycznie nie ulega w tej reakcji amplifikacji. Wynik pozytywny reakcji, produkt o długości ok. 270 pz potwierdza obecność w hodowli kontaminacji mycoplazmą.

Materiały:

- zebrane media hodowlane, znad komórek kontrolnych i traktowanych UV (z poprzednich ćwiczeń);

- odczynniki do hodowli (RPMI, DMEM-F12);

- sterylna woda do reakcji PCR;

- 10 x reaction Buffet;

- primer/nucleotide mix;

- polimeraza (5U/µl).

Wykonanie:

Sekcja	Materiał	Rodzaj preparatu
1/7	Medium znad komórek kontrolnych: K	z poprzednich ćw.
2/8	Medium znad komórek traktowanych UV czas: 0h	z poprzednich ćw.
3/9	Medium znad komórek traktowanych UV czas: 1h	z poprzednich ćw.
4/10	Medium hodowlane RPMI	Odczynnik do hodowli
5/11	Medium hodowlane DMEM-F12	Odczynnik do hodowli

1. Zebrane medium odwirować i przenieść 100µl do nowej probówki.

2. Inkubować 5 w 95ºC.

3. Szybko zwirować (max. 5 sec.), w celu osadzenia na dnie pozostałości po komórkach.

4. Złożyć 25 µl mieszaniny reakcyjnej wg kolejności:

H2O milliq.	17,8 µl
10 x Reaction Buffer	2,5 µl
Primer/Nucleotide mix	2,5 µl
Matryca (supernatant)	2 µl
Polimeraza	0,2 µl

Całość składać na lodzie! Próbówki podpisać nr sekcji.

5. Profil termiczny reakcji PCR:

1 cykl	94 ºC	2 min
39 cykli	94 ºC	30 sec
	55 ºC	30 sec
	72 ºC	30 sec
hold	4 ºC	∞

6. Po skończonej reakcji do 5 µl próby dodać 6 x LB DNA, a wyniki reakcji sprawdzić na żelu agarozowym 1,5 % w 0,5 x TBA. Warunki elektroforezy jak w ćw.2








1.100 bp DNA Ladder

2. negative control

3. positive control

4. inhibited sample

5. negative sample

6. positive sample, weak contamination

7. positive sample, strong contamination




1 2 3 4 5 6 7

---