Ćwiczenie 3 (12.03.2010)
,,Indukcja i detekcja uszkodzeń oksydacyjnych w komórkach eukariotycznych (HPLC-ECD)"
Przygotowanie teoretyczne do ćwiczeń:
- wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC);
- detekcja UV-ViS i elektrochemiczna (ECD);
- modyfikacje zasad azotowych w kwasach nukleinowych (8-OH-dG i 8-OH-G);
- uszkodzenia oksydacyjne w DNA komórek nowotworowych po UV.
W trakcie ekspozycji komórek na promieniowanie UV dochodzi do zmian strukturalnych w obrębie DNA/RNA. Modyfikacjom ulęgają głównie zasady azotowe, w sąsiadujących nukleotydach mogą wytworzyć się wiązania, które są następnie usuwane przez kompleksy enzymatyczne fotoliaz. Zmiany mogą powstawać w obrębie samego pierścienia purynowego/pirymidynowego zasady azotowej, poprzez przyłączenie powstałego rodnika hydroksylowego. Poziom 8-OH-dG w wyizolowanym DNA może być markerem stresu oksydacyjnego w komórkach.
W trakcie ćwiczeń do identyfikacji oksydowanych pochodnych nukleozydowych wykorzystany zostanie system HPLC-High Performance Liquid Chromatography firmy ESA z detektorem elektrochemicznym Coulochem III, połączony z detektorem UV firmy WATERS.
MATERIAŁY I METODY:
- linie komórkowe (komórki kontrolne i traktowane promieniowaniem UV) HBL-100 (nowotwór piersi) i Me45 (czerniak);
- urządzenie emitujące promieniowanie UV z możliwością regulacji dawki [J/m2], w celu indukcji uszkodzeń w DNA;
- zestaw do izolacji DNA firmy A&A Biotechnology (izolacja wg protokołu B z ćwiczeń 1);
- bufor octanowy 40 mmol/l zawierający 0,1 mmol/l ZnCl2, pH=5.1;
- bufor Tris-HCl 1 mol/l, pH=8.5;
- nukleaza P1 (Sigma) z Penicillum Citrinum;
- fosfataza alkaliczna z E. Coli (Sigma);
- eluent do HPLC: octan sodu (100 mmol/l), metanol 5 % (v/v), pH=5.0;
- roztwory wzorcowe 8-hydroksy-2'deoksyguanozyny (8-OH-dG);
- roztwory wzorcowe 2'-deoksyguanozyny (dG).
WYKONANIE:
Indukcja uszkodzeń oksydacyjnych promieniowaniem UV:
- otrzymane szalki z komórkami opisać wg wzoru: K-kontrola; UV-0h; UV-1h;
- komórki, poza kontrolnymi, poddać napromienieniu dawką 2000J/m2;
- poprzez trypsynizację zebrać komórki z odpowiednich punktów czasowych, pozostałe inkubować w ciemności w 37ºC.
2. Izolacja DNA (wg protokołu B z ćwiczeń 1). Zebrane z kolumny DNA oznaczyć spektrofotometrycznie, przechowywać w -20 ºC do następnych ćwiczeń.
Przygotowanie wzorców.
- z otrzymanych roztworów wyjściowych 8-OH-dG i dG sporządzić po 500 µl mieszaniny dwóch wzorców o następujących stężeniach molowych:
8-OH-dG [nM] |
dG [µM] |
objętość końcowa |
33.3 |
100 |
500 µl |
16.15 |
50 |
500 µl |
8.3 |
25 |
500 µl |
4.02 |
12.5 |
500 µl |
Detekcja wzorców w przygotowanych mieszaninach za pomocą HPLC-ECD (krzywa kalibracyjna):
- po uruchomieniu i zaprogramowaniu zestawu do detekcji przystąpić do nastrzykiwania mieszanin na kolumnę (jednorazowo po 20µl).
UWAGA: przed nastrzyknięciem każda próbka powinna być przefiltrowana przez filtr o średnicy porów 22 µm, w celu uniknięcia zanieczyszczenia kolumny!!!
4. Analiza wyników pochodzących z detektorów UV-VIS oraz EC.
5. W wolnym czasie należy przygotować świeży eluent (1 litr na grupę, ustalić pH 5.0).
KONTYNUACJA NA KOLEJNYCH ĆWICZENIACH
Do wyizolowanego DNA dodać podwójną objętość 70% EtOH.
30 min wytrącać w -20 ºC.
Zwirować prze 30 min na max. obrotach w +4ºC.
Odrzucić alkohol, a osad suszyć na wolnym powietrzu.
Dodać ogrzanego do 37oC buforu octanowego dla nukleazy (48μl).
Inkubować 15 min. na termo mikserze.
Dodać 2μl nukleazy P1.
Wymieszać.
Inkubować 1h w 37oC, z wytrząsaniem.
Dodać Tris 1M o pH 8,5 (15μl), całość zworteksować.
Dodać fosfatazy alkalicznej (5,3μl).
Inkubować jak w pkt.9.
Wirować 1h, 12500rpm. (wirówka wcześniej schłodzona temp. 4oC)
Na kolumnę HPLC podawać po 20 μl ultrafiltratu, detekcje prowadzić przy ustawieniach aparatu:
Detektor ECD (Coulochem III):
potencjał elektrody osłonowej: 750 mV
potencjał elektrody ekranującej: 130mV
potencjał elektrody roboczej: 450mV
-czułość 20nA,
-elektrolit (5% metanol, 100mM octan sodu, pH=5,0)
-prędkość przepływu 1 ml/min
Detektor UV:
długość fali : 254nm