6. Technika PCR i jej wykorzystanie

PCR - łańcuchowa reakcja polimeryzacji (ang. polymerase chain reaction) to prosta metoda powielania wybranej sekwencji DNA, oparta na jego naturalnej zdolności do replikacji.

Reakcja PCR do swojego zajścia wymaga trzech, następujących po sobie etapów, które stanowią jeden cykl:

1. Denaturacja DNA - przebiega w temperaturze 92-95°C, której działanie pozwala na całkowite odseparowanie dwóch nici w helisie DNA.

2. Przyłączanie starterów - przebiega w temperaturze 37-72°C, która zależy od składu nukleotydowego starterów

3. Wydłużanie przyłączonego startera następuje w 72°C od jego końca 3`-OH przez kolejne dołączanie do syntetyzowanej nici jednego z czterech obecnych w roztworze dATP, dTTP, DTP lub DTP przy udziale katalizatora reakcji jakim jest polimeraza Taq.

Czas trwania poszczególnych etapów należy opracować doświadczalnie dla badanego taksonu lub badanego fragmentu DNA.

Powtórzenie wielokrotnie cyklu prowadzi do zwielokrotnienia ilości badanego DNA.

Dopiero w cyklu 3 pojawiają się produkty o zdefiniowanej przez odcinki starterowe długości.

Czynniki mające wpływ na przebieg reakcji PCR:

1. Czynniki chemiczne:

• Matrycowy DNA - Matryca powinna być wolna od związków chemicznych, protein, lipidów, węglowodorów, soli nieorganicznych czy związków chemicznych będących inhibitorami reakcji (EDTA, polifiryna, heparyna)

• Bufor reakcyjny i jony Mg²⁺ - jony Mg²⁺, dodawane do reakcji w postaci MgCl₂ wpływają znacząco na aktywność polimerazy, zwiększają temperaturę topnienia dwuniciowego DNA jak również tworzą rozpuszczalne kompleksy z dNTP

• Trójfosforany deoksyrybonukleotydów (dNTP) - optymalne stężenie używanych do reakcji dNTP jest zależne od stężenia starterów, stężenia jonów magnezu oraz długości odcinka jaki podlega syntezie. Nukleotydy są podstawowym budulcem nowych nici DNA, dlatego musi być ich w roztworze odpowiednio dużo by możliwe było zsyntetyzowanie dostatecznie dużej ilości produktu końcowego

• Startery - czyli krótkie fragmenty DNA (oligonukleotydy) syntetyzowane pozaustrojowo. Zasadniczo są to cząsteczki DNA o długości 14-40 nukleotydów, których sekwencja jest komplementarna do rejonów otaczających (flankujących) badany fragment DNA

• Polimeraza DNA_Taq - może rozpoczynać syntezę nowej nici na jednolicowej matrycy tylko wówczas, gdy istnieje krótki dwuniciowy odcinek DNA. Taki region powstaje w miejscu przyłączenia starterów, od końca 3`-OH startera enzym rozpoczyna syntezę komplementarnej do matrycy nici.

2. Czynniki fizyczne

• Denaturacja - przyjmuje się, iż działanie temperatury 95°C przez 2-3 minuty wystarcza do całkowitej denaturacji genomowego DNA. Natomiast wydłużenie tego czasu może powodować znacznyc spadek aktywności polimerazy i w konsekwencji obniżenie wydajności reakcji PCR, dlatego długość trwania etapu denaturacji powinna być możliwie skrócona

• Przyłączanie starterów - w reakcji PCR zależy głównie od: temperatury i zawartości zasad w oligonuklotydzie.

• Ilość cykli

Metoda PCR może być wykorzystywana do:

• Wykrywania określonych genów lub odcinków genów w DNA

• Wykrywania nosicielstwa mutacji powodujących choroby genetyczne

• Wykrywania obecności w genomie wirusowego lub prowirusowego DNA

• Zwielokrotnienie wybranych fragmentów DNA do sekwencjonowania i tworzenia bibliotek genowych

Zastosowanie:

PCR może być używany do amplifikacji specyficznych sekwencji na DNA izolowanym nawet z pojedynczej komórki. Ma to ogromne znaczenie przy :

- analizowaniu mutacji związanych z szeregiem chorób genetycznych

- diagnostyce chorób dziedzicznych

- ustalaniu ojcostwa w sądownictwie

- ustalaniu pochodzenia śladów krwi , włosów itp. w kryminalistyce

- namnażaniu DNA z mumii egipskich czy szczątków wymarłych organizmów

- wykrywania we krwi obecności wirusów takich jak np. HIV.

Rodzaje PCR :

RAPD-PCR - polega na amplifikacji przypadkowo wybranych fragmentów genomu dzięki zastosowaniu krótkich starterów (około 10 nukleotydów) o losowo dobranej sekwencji.

RT-PCR - PCR połączona z odwrotną transkrypcją czyli materiałem wyjściowym do namnażania jest mRNA a nie jak zazwyczaj DNA.

PCR in situ - nowa technika pozwalająca na przeprowadzenie reakcji w tkance bez naruszania jej struktury np. na preparacie mikroskopowym.

PCR ILOŚCIOWA - za pomocą pomiaru intensywności reakcji barwnych jesteśmy w stanie zmierzyć po określonej liczbie cykli ilość powstałego produktu. Jest to szczególnie istotne dla substancji występujących w bardzo niewielkich ilościach. Można w ten sposób szacować poziom ekspresji genu kodującego konkretne białko mierząc ilość mRNA.

---