BIOTECHNOLOGIA ROŚLIN

BIOTECHNOLOGIA ROŚLIN - Dziedzina nauki, która wykorzystuje procesy biologiczne do uzyskiwania różnorodnych bioproduktów w warunkach laboratoryjnych.

Obejmuje różne subdyscypliny m.in.:

• Kultury tkankowe (kultury in vitro),

• Techniki wykorzystujące rekombinację DNA w celu uzyskania Genetycznie Modyfikowanych Organizmów GMO na drodze transformacji genetycznej (transgeneza).

ROŚLINNE KULTURY TKANKOWE KULTURY IN VITRO

Aseptyczne kultury komórek, tkanek, organów i ich części wyizolowanych z oślin macierzystych prowadzone in vitro (łac. w szkle) na syntetycznych pożywkach, w ściśle określonych pod względem fizycznym i chemicznym warunkach.

Cele prowadzenia kultur tkanowych:

1. badanie podstawowe z zakresu fizjologii, biochemii, biologii molekularnej

2. masowe namnażanie roślin

3. doskonalenie roślin hodowlanych odmian

4. produkcja metabolitów wtórnych

W kulturach in vitro wyróżniamy 3 grupy czynników:

I. Warunki zewnętrzne - temperatura, oświetlenie i wilgotność)

II. Właściwości biochemiczno-fizjologiczne i genetycznie uprawianego obiektu

III. Czynniki odżywcze i stymulatory oraz właściwości fizyczne podłoża - POŻYWKA

Ad. I.

FITOTRON

Ad. II.

Obiektami używanymi w kulturze in vitro są EKSPLANTATY (ang. explant) - wyizolowane fragmenty roślin umieszczone na podłożu (pożywce) o odpowiednio dobranym składzie.

Najlepsze tkanki merystematyczne.

Rośliny eksplantatów:

• pierwotne (np. fragment ogonka liściowego)

• wtórne (przekładane z płytki na płytkę)

EKSPLANTATY

• Nasiona, zarodki lub ich fragmenty

• Fragmenty siewek, liścieni, korzeni, pierwszych liści

• Organy roślinne lub ich fragmenty

• Pojedyncze komórki

• Protoplasty

Materiał na eksplantaty dobiera się w zależności od celu pracy.

Kondycja rośliny macierzystej - źródło eksplantatów - (zdrowa, młoda, żywotna, cechuje się intensywnym wzrostem i rosnąć w optymalnych dla niej a jednocześnie kontrolowanych warunkach środowiskowych)

Wybór eksplantatu:

• Wiek tkanek, organów z których są one wycinane

(eksplantaty z młodych organów > potencjał rozwojowy)

• Lokalizacja w roślinie

• Wielkość

• Termin izolacji

• Orientacja na pożywce

DEZYNFEKCJA EKSPLANTATU - usunięcie drobnoustrojów zasiedlających powierzchnię materiału roślinnego (bakterie, grzyby).

Podstawowe etapy dezynfekcji:

1. Umycie pod bieżącą wodą z dodatkiem detergentu

2. Dezynfekcja powierzchniowa w warunkach sterylnych przy użyciu m.in. wodnych roztworów alkoholu etylowego, podchlorynu wapnia - Ca(OCl)₂ lub sodu NaOCl, chlorku rtęci - HgCl₂ (sublimatu). W praktyce wykorzystuje się często gotowe preparaty handlowe zawierające związki chloru np. ACE, Clorox, Domestos, rzadziej chloraminę. W szczególnych przypadkach dodatkowo stosujemy fungicydy: Benlate lub antybiotyki, np. rifampicyna, streptomycyna oraz środki zmniejszające napięcie powierzchniowe i ułatwiające penetrację powierzchni materiału roślinnego (płyn do mycia naczyń, preparat Tweed).

3. Kilkakrotnie przepłukiwanie autoklawowaną wodą destylowaną celem usunięcia roztworów dezynfekujących.

Patogenne mikroorganizmy endofityczne (wirusy, bakterie, grzyby) - kolonizują całe wnętrza rośliny (patogeny systemiczne) lub tylko określone miejsca np. zranienia (patogeny lokalne).

ZWALCZANIE:

• Metody chemiczne (chemioterapia, antybiotyki, fungicydy)

• Metody fizyczne (termoterapia)

Zabiegi odkażające przeprowadza się przed pobraniem eksplantatu (traktuje się całą roślinę) i powtarza po izolacji eksplantatu.

STERYLIZACJA NIE MOŻE OSŁABIAĆ LUB WYNISZCZAĆ EKSPLANTATU PONIEWAŻ POWODUJE TO JEGO ZAMIERANIE LUB NIEZDOLNOŚĆ REGENERACJI.

Dobór substancji dezynfekujących, ich stężenie, czas działania i odczyn roztworu zależy od rodzaju materiału roślinnego - dobór indywidualny w zależności od potrzeb.

LABORATORIUM KULTUR IN VITRO

Szkło laboratoryjne jest sterylizowane przez ok 20 min. w autoklawie przy 0,2 MPa i temp 134°C.

Ad. III.

• MAKROELEMENTY

• MIKROELEMENTY

• WITAMINY

• ŹRÓDŁO WĘGLA - CUKIER - (sacharoza, maltoza, glukoza)

• REGULATORY WZROSTU

Pożywki zestalone są AGAREM lub AGAROZĄ

pH=5-6

Warunki sterylizacji - AUTOKLAW; 20 min; temp 121°C, 0,1 MPa

Makroskładniki

• Pierwiastki: N, P, K, Ca, Mg, S dodawane w stosunkowo dużej ilości w postaci soli nieorganicznych

• Niezbędne m.in. do:

• Budowy białek strukturalnych i enzymatycznych

• Budowy kwasów nukleinowych

• Aktywacji procesów syntezy oraz prawidłowej gospodarki wodnej

• Warunkują właściwą budowę i przepuszczalność błon

• Działanie cytoszkieletu

• Budowę chlorofilu

Mikroskładniki

• Pierwiastki: Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo, Al., I, Cl dodawane są do pożywek w postaci związków nieorganicznych w mniejszych ilościach.

• Regulują one:

• Metabolizm komórkowy

• Zróżnicowanie się komórek

• Pobieranie i transport wody oraz asymilatów

• Wchodzą w skład białek strukturalnych i enzymatycznych

• Są niezbędne do syntezy chlorofilu i prawidłowego funkcjonowania chloroplastów.

Witaminy

• Są to związki organiczne, które w niewielkich ilościach katalizują lub pośredniczą w wielu reakcjach enzymatycznych komórek.

• Do najczęściej używanych witamin należą:

• Tiamina (B₁)

• Kwas nikotynowy (B₃) PP i

• Pirydoksyna (B₆)

• Często także dodawany jest mio- inozytol (mezoinozytol) - prekursor witamin.

Inne witaminy (C i E) dodawane w określonych typach kultur odgrywają rolę przeciwutleniaczy (opóźniają utlenianie tkanek eksplantatu, zapobiegając ich brązowieniu).

Źródło węgla

• Węglowodany, źródło węgla, podstawowy składnik niezbędny do budowy związków organicznych. Pod tym względem komórki roślinne w kulturach in vitro są heterotrofami. Tylko nieliczne linie komórkowe na pożywkach pozostają autotroficzne, tzn. asymilują CO₂ w procesie fotosyntezy.

• W warunkach in vitro głównie wykorzystuje się disacharydy (sacharoza, maltoza) i monosacharydy (glukoza, fruktoza, galaktoza). Niekiedy stosuje się także inne źródła węgla, m.in. arabinozę, ksylozę czy rafinozę.

• Dobór odpowiedniego węglowodanu zależy od reakcji eksplantatu.

DODATKI DO POŻYWEK

• Aminokwasy (głównie glicyna)

• Antybiotyki

• Związki pochodzenia naturalnego np.

• ekstrakt drożdżowy - YE (ang. yeast extract),

• mleczko kokosowe - CM (ang. coconut milk), czyli płynne bielmo orzecha kokosowego,

• wyciągi z siewek.

• Węgiel aktywowany - AC (ang. activated charcoal) absorbuje wydaliny I wydzieliny komórkowe z pożywki, mające negatywny wpływ na wzrost I rozwój materiału roślinnego.

POŻYWKI - podział ze względu na zestaw substancji chemicznych:

• Pożywki bogate - znajdują zastosowanie w kulturach protoplastów, komórek, merystemów, eksplantatów z różnych organów roślinnych a także w kulturze kalusa. Przykładami pożywek bogatych są:

• MS - Murashige'a i Skooga (1962)

• B5- Gamborga i innych (1968)

• Pożywki średnio bogate - zawierają zwykle połowę mniejsze stężenie makroelementów, czasem również i witamin od pożywek bogatych

• Pożywki ubogie - zawierają makroelementy w zwykle czterokrotnie niższym stężeniu aniżeli pożywki bogate oraz różne kombinacje mikroelementów i witamin

Pożywki

• NIEZDEFINIOWANE

• ekstrakt drożdżowy

• mleko kokosowe

• ZDEFINIOWANE

• MS - Murashige'a i Skooga (1962)

• B5- Gamborga i innych (1968)

Pożywki - podział ze względu na stopień zestalenia)

Płynne

Łatwośc infekcji i koniecznośc napowietrzania

Kultury lepiej się rozwijają, łatwa wymiana na pożywkę o odmiennym składzie, łatwo przenikaą substancje selekcjonujące

Półpłynne

Stałe - zestalone agarem lub agarową

SCHEMAT OTRZYMYWANIA ROŚLIN W KULTURACH PROTOPLASTÓW

A - izolacja protoplastów

B - wolne protoplastów

C - odtwarzanie ściany komórkowej

D - pierwszy podział

E - agregaty komórkowe

F - kalus

H - regeneracja pędów

H - ukorzenianie pędów

I - roślina

PROTOPLAST - komórka roślinna bez ściany komórkowej

KULTURY PROTOPLASTÓW prowadzi się m.in. celem:

• Badań biochemiczno-fizjologicznych

• Selekcji

• Modyfikacji genetycznych

• Fuzjonowania (łączenia) z innymi protoplastami

FUZJONOWANIE PROTOPLASTÓW

Fuzja - to połączenie się (zlewanie) protoplastów pochodzących z różnych komórek. W

kulturach in vitro możliwe jest przeprowadzenie fuzji pomiędzy protoplastami komórek somatycznych pochodzącymi od tej samej rośliny lub różnych roślin tego samego lub różnych gatunków.

Fuzja in vitro. HYBRYDYZACJA SOMATYCZNA (krzyżowanie somatyczne) pozwala ominąć naturalne bariery (przed- i pozygotyczne) zapobiegające krzyżowaniu się roślin pomiędzy gatunkami, rodzajami czy rodzinami.

• CEL

Otrzymywanie mieszańców somatycznych czyli komórek i zregenerowanych z nich roślin, które powstały w wyniku fuzji protoplastów komórek somatycznych pochodzących od różnych osobników odmiennych gatunków.

Ułatwia także różnorodne modyfikacje genetyczne roślin rozmnażanych wegetatywnie, roślin sterylnych, z naturalnym długim cyklem życiowym czy badanie mechanizmów infekcji wirusowej.

• ETAPY

1. Bezpośredni kontakt błon protoplastów (neutralizacja ujemnego ładunku powierzchniowego błon),

2. Czasowa destabilizacja błon (zmiana przepuszczalności, pofałdowanie, tworzenie się porów)

3. Wytworzenia połączeń (tzw. mosty błonowe lub molekularne) między cytoplazmami stykającymi się protoplastów

4. Zlanie się cytoplazmy wraz z organellami

5. Odtworzenie i otoczenie produktu fuzji wspólną błoną komórkową.

W wyniku FUZJI PROTOPLASTÓW powstają:

• Heterokariony - po połączeniu komórek somatycznych pochodzących od różnych osobników (różnych komponentów fuzji) powstaje hybryd, mieszaniec jądrowy.

• Homokariony - efekt połączenia protoplastów tego samego komponentu fuzji.

Ostatecznie po FUZJI mogą powstać następujące kombinacje połączeń:

• Symetryczny mieszaniec jądrowy - ma kompletne jądra obu komponentów (powstaje stosunkowo rzadko),

• Asymetryczny mieszaniec jądrowy - powstaje w wyniku eliminacji chromosomów lub ich fragmentów. Asymetria może być swoista (dotyczy tylko jednego genomu) lub nieswoista (dotyczy obu jąder).

• Cybrydy - mieszańce cytoplazmatyczne, zawierające jądro tylko jednego osobnika, a cytoplazmę drugiego lub jądro jednego, a cytoplazmę obu osobników użytych do fuzji.

FUZJĘ PROTOPLASTÓW można przeprowadzić dwiema metodami:

Fuzja chemiczna - stymulatorem procesu jest glikol polietylenowy (PEG) w połączeniu z dużym stężeniem jonów wapnia oraz dimetylosulfotlenek (DMSO). Po krótkiej inkubacji w mieszaninie, protoplasty przemywa się roztworem zawierającym jony wapnia i wprowadza pożywkę, następuje odtworzenie ściany komórkowej oraz kolejne fazy rozwoju komórek.

Fuzja fizyczna - (elektrofuzja) wykorzystuje impulsy elektryczne do łączenia się protoplastów. Mieszaninę protoplastów umieszcza się w naczyniu pomiędzy dwiema elektrodami.

W pierwszym etapie, pod wpływem prądu zmiennego protoplasty ustawiają się wzdłuż linii pola elektrycznego tworząc charakterystyczne sznury, a ich błony stykają się ze sobą.

W drugim etapie, w wyniku krótkotrwałego impulsu prądu stałego następuje elektroporacja błon.

OTRZYMYWANIE ROŚLIN HAPLOIDALNYCH

Rośliny haploidalne - rośliny, które mają zredukowaną do połowy liczbę chromosomów w komórkach somatycznych.

Metody:

1. Eliminacja chromosomów w zarodkach powstałych w wyniku krzyżowań międzygatunkowych lub międzyrodzajowych (powszechnie stosowana u zbóż)

2. Androgeneza - sporofityczny rozwój gametofitu męskiego

1. kultury pylnikowe

2. kultury izolowanych mikrospor

Mikrospor - niedojrzałe ziarno pyłku

3. Ginogeneza - sporofityczny rozwój z haploidalnych komórek woreczka zalążkowego

1. kultury niezapylonych zalążków i zalążni

2. kultury zapylonych zalążków i zalążni

Zapylenie - przeniesienie ziarna pyłku na znamię słupka.

KULTURY MIKROSPOR I PYLNIKÓW

Kultury te pozwalają uzyskiwać rośliny haploidalne (mające gametyczną liczbę chromosomów w komórkach somatycznych). Eksplantatami są izolowane pojedyncze jednojądrowe mikrospory lub całe pylniki, zawierające mikrospory.

Proces uzyskiwania roślin haploidalnych z mikrospor i pylników określa się jako ANDROGENEZĘ IN VITRO

Po przeniesieniu na pożywkę eksplantaty rozwijają się bezpośrednio w haploidalne zarodki przybyszowe (zarodki gametyczne) lub kalus haploidalny.

Z zarodków rozwijają się rośliny, natomiast z kalusa mogą powstać zarówno przybyszowe zarodki, jak i zawiązki pędu czy korzeni.

Rośliny haploidalne są niepłodne, zatem ich pojedynczy zestaw chromosomów musi być podwójny (np. kolchicyną). W rezultacie powstają podwójne haploidy - DH (ang. double haploid), płodne rośliny będące homozygotami.

Największą zdolnością do androgenezy charakteryzują się gatunki należące do rodzin Solanaceae, Gramineae i Cruciferae (ok. 240 gat.).

Schemat otrzymywania roślin homozygotycznych na drodze haploidyzacji

1. komórka somatyczna rośliny diploidalnej, 2n chromosomów

-> mejoza

2. przykładowa kombinacja alleli w komórce gametofitu, 1n chromosomów

-> kultura gametofitu in vitro

3. komórka somatyczna, haploida, 1n chromosomów

-> diploidyzacja

4. podwojony haploid, komórka somatyczna, 2n chromosomów

KULTURY NIEZAPŁODNIONYCH ZALĄŻKÓW LUB CAŁYCH ZALĄŻNI

Kultury tego typu są wykorzystywane do uzyskania roślin haploidalnych.

Po przełożeniu na pożywki w zalążkach lub zalążniach dochodzi do rozwoju niezapłodnionej komórki jajowej, synergidy lub antypody w haploidalny zarodek gametyczny lub haploidalny kalus, który następnie jest zdolny do wytworzenia zawiązków pędu czy korzeni.

Proces regeneracji roślin z haploidalnych komórek woreczka zalążkowego określa się jako gynogenezę in vitro (uzyskano u 16 gat.). Również w tym wypadku konieczne jest podwajanie liczby chromosomów, aby otrzymać płodne rośliny homozygotyczne DH.

Oceny stopnia ploidalności uzyskanych roślin można dokonać na podstawie:

• Liczby chromosomów w komórkach

• Pomiaru niektórych cech morfologicznych i cytologicznych (długość aparatów szparkowych, liczba chloroplastów w komórkach szparkowych, wielkość ziaren pyłku)

• Zawartości DNA jądrowego i plastydowego

REGULATORY WZROSTU - fitohormony

Hormonami roślinnymi określa się endogenne substancje organiczne transportowane w roślinie od miejsca wytworzenia do miejsca, gdzie ich niewielka ilość wywiera swoiste efekty fizjologiczne.

Warunkiem odpowiedzi (reakcji) komórki na sygnał (cząsteczkę hormonu) jest obecność w niej swoistego białka receptorowego, które wiąże dany hormon w sposób specyficzny i odwracalny.

Każdy regulator wzrostu i rozwoju ma szeroki zakres oddziaływania na rośliny, zależny od stężenia oraz współdziałania z innymi substancjami endo- i egzogennymi.

Oddziaływanie to na eksplantaty roślinne in vitro można scharakteryzować następująco:

1. Te same regulatory roślinne mogą:

1. działać różnie nie tylko na eksplantaty z grup oddalonych taksonomicznie, ale także na odmiany i klony tego samego gatunku

2. działać niejednakowo na eksplantaty z tej samej rośliny, ale pochodzące z różnych tkanek i organów

3. działać odmiennie nawet na eksplantaty z tej samej części rośliny, jeśli pobrano je w różnych etapach rozwoju osobistego.

2. Kolejne podanie różnych regulatorów daje odmienny efekt niż podanie ich równoczesne.

3. Wzrastająca koncentracja regulatora może wywoływać nasilanie się jakiegoś efektu, a po przekroczeniu progu ilościowego może spowodować zmianę efektu.

4. Różne regulatory, także z różnych grup, mogą powodować taką samą reakcję morfogenetyczną eksplantatów pobranych z różnych tkanek albo z roślin należących do różnych grup taksonomicznych.

5. Reakcja eksplantatu na regulatory roślinne jest w znacznym stopniu modyfikowana przez środowisko, np. zawartość składników mineralnych i organicznych w pożywce, cechy fizyczne pożywki, skład atmosfery w naczyniu, temperaturę czy oświetlenie.

6. Działanie regulatorów roślinnych zależy od wieku kultur, ponieważ wraz z liczbą pasaży zmienia się wrażliwość eksplantatu na regulatory, co jest wynikiem zmieniającej się ekspresji/represji niektórych genów lub akumulacji niektórych metabolitów.

7. reakcja morfogenetyczna eksplantatu na regulatory rozwoju następuje po różnym okresie, a długość okresu oczekiwania na reakcję jest zależna od stężenia i rodzaju regulatora, rodzaju eksplantatu, jego początkowej wrażliwości i innych czynników.

8. Większość regulatorów rozwoju nie pozostaje w komórkach i tkankach w postaci, w jakiej została podana do pożywki, ale przynajmniej częściowo jest metabolizowana do form nieaktywnych fizjologicznie.

Do roślinnych regulatorów wzrostu i rozwoju stosowanych w kulturach in vitro należą następujące hormony:

• Auksyny

• Cytokininy

• Gibereliny

• Kwas abscysynowy

• Etylen

AUKSYNY

• Syntetyzowane są przede wszystkim w młodych częściach roślin, wierzchołkach pędó, młodych liściach i owocach;

• Stymulują wzrost wydłużeniowy komórek, tworzenie korzeni, indukują powstawanie owoców partenokarpicznych, uczestniczą w regulacji dominacji wierzchołkowej;

• W kulturach in vitro auksyny inicjują podziały komórkowe, w konsekwencji dochodzi do wytworzenia kalusa, powodują również elongację komórek oraz stymulują tworzenie korzeni, a także indukuja somatyczną embriogenezę;

• W kulturach in vitro wykorzystywane są zarówno auksyny występujące naturalnie jak i syntetycznie.

1. Naturalne:

IAA (kwas indolilo-3-octowy),

IBA (kwas indolilo-3-masłowy)

2. Syntetyczne:

NAA (kwas alfa-naftylo-1-octowy),

2,4-D (kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy),

pikloram (kwas 4-amino-3,5,6-trichloropikolinowy),

dicamba (kwas 2-metoksy-3,6-dichlorobenzoesowy)

CYTOKININY

• Miejscem syntezy cytokinin są wierzchołki korzeni, kambium, rozwijające się liście, pąki, owoce oraz kiełkujące nasiona.

• Stymulują podziały komórkowe i opóźniają starzenie oraz stymulują kiełkowanie nasion; powodują ustępowanie spoczynku pąków; znoszą dominację wierzchołkową; hamują tworzenie i wzrost korzeni.

• W kulturach in vitro cytokininy wykorzystywane są w celu indukcji podziałów komórkowych, inicjacji merystemów pędowych, znoszenie dominacji wierzchołkowej (co umożliwia wyrastanie pąków bocznych), zahamowanie tworzenia korzeni oraz opóźnienia procesów starzenia.

1. Naturalne:

Trans-zeatyna

2iP (6(yy, dimetyloalliloamino)-puryna)

2. Syntetyczne:

Kinetyna

BA (6-benzyloaminopuryna)

TDZ (tidiazuron - N-(1,2,3-tiodiazolo-5yl); N-fenylomocznik)

PBA (tetrahydropyranylo-benzyloadenina)

Decydujące znaczenie w realizacji KIERUNKU ROZWOJU (pędów lub korzeni) ma proporcja pomiędzy zawartością auksyn a cytokinin.

maleje stężenie auksyn = wzrasta stężenie cytokinin

AUKSYNY CYTOKININY

Wysokie Wytwarzanie korzeni przez sadzonki Niskie

Somatyczna embriogeneza

Wytwarzanie korzeni przez kalus

Stężenie Inicjacja kalusa u roślin dwuliściennych Stężenie

Powstawanie pędów bocznych

Niskie Namnażanie pędów bocznych Wysokie

GIBERELINY

• Syntetyzowane w wierzchołkach korzeni, rozwijają się w liściach, nasionach, owocach

• Działanie ich polega na stymulacji wzrostu wydłużeniowego, umożliwiają uzyskanie normalnego wzrostu i pokroju karłowatym mutantom. Uczestniczą również w regulacji ustępowania spoczynku nasion, indukują kwitnienie roślin dnia długiego, stymulują rozwój kwiatów płci męskiej i niekiedy mogą wywoływać powstawanie owoców partenokarpicznych;

• W kulturach in vitro są wykorzystywane rzadziej niż auksyny i cytokininy. Stosowane w celu indukcji elongacji pędów lub przerwania spoczynku izolowanych zarodków.

GA3 - kwas giberelinowy

KWAS ABSCYSYNOWY (ABA)

• Syntetyzowany w liściach, nasionach, korzeniach i owocach;

• Indukuje spoczynek w pąkach i nasionach, hamuje kiełkowanie nasion, hamuje wzrost, indukuje zamykanie szparek, przyspiesza procesy starzenia oraz opadanie organów.

• W kulturach in vitro wykorzystywany jest do regulacji przebiegu somatycznej embriogenezy; umożliwia prawidłowe wykształcenie zarodków somatycznych; znalazł zastosowanie w inhibicji przedwczesnego kiełkowania zarodków i indukcji odporności na ich dehydratację.

ETYLEN

• W kulturach in vitro obserwuje się wpływ zarówno pozytywny (np. stymulacja wzrostu tkanki kalusowej lub wzrostu wydłużeniowego, zwiększona produkcja somatyczna zarodków) jak i negatywny (uprawa zamknięta) (np. zahamowanie wzrostu, zmniejszenie liczby wytwarzanych zarodków, nieprawidłowy rozwój).

Regeneracja i rozwój roślin w kulturach in vitro

TOTIPOTENCJA - ZDOLNOŚĆ OD ODTWORZENIA CAŁEJ ROŚLINY Z POJEDYNCZEJ KOMÓRKI.

Każda żywa komórka nawet zróżnicowana, zawiera pełną informację genetyczną, która w odpowiednich warunkach może zostać uruchomiona i doprowadzić do regeneracji poszczególnych organów bądź całej rośliny. Warunkiem wyzwalającym totipotencję jest pozbawienie komórki korelacyjnego wpływu organizmu macierzystego. W praktyce polega to na wyizolowaniu i przeniesieniu komórek na pożywkę zawierającą odpowiednią kombinację roślinnych regulatorów wzrostu i rozwoju.

KOMPETENCJA - ZDOLNOŚC KOMÓRKI DO ODBIORU SYGNAŁÓW I REAGOWANIA NA NIE ZA POMOCĄ ODPOWIEDNICH RECEPTORÓW.

TOTIPOTENCJA I KOMPETENCJA KOMÓREK ROŚLINNYCH MOGĄ ULEC ZMIANIE W TRAKCIE TRWANIA KULTURY IN VITRO.

MORFOGENEZA ROŚLIN IN VITRO - przekształcenia, które prowadzą do powstania wielokomórkowego organizmu wraz ze skomplikowanym układem tkanek i organów.

Morfogeneza roślin in vitro może się odbywać w wyniku:

• Organogenezy

• Somatycznej embriogenezy

ORGANOGENEZA - wytwarzanie określonych organów.

W kulturach in vitro obserwujemy:

• Organogenezę pędową (pedogenezę)

• Organogenezę korzeniową (ryzogenezę)

Kierunek organogenezy - a więc, to czy powstaną pędy, czy korzenie - zależy od proporcji między auksynami i cytokininami. Przewaga auksyn decyduje o formowaniu się korzeni, natomiast przewaga cytokinin - o tworzeniu pędów.

Organogeneza bezpośrednia - wytworzenie organów bezpośrednio na eksplantacje.

Eksplantat (komórka lub komórki kompetentne) -> organ

Organogeneza pośrednia - wytworzenie organu jest poprzedzone przez stadium kalusa; organy powstają z tkanki kalusowej.

Eksplantat -> kalus (komórka/komórki o indukowanej kompetencji) -> organ

KALUS - jest tkanką niejednorodną (niestabilną genetycznie) i nie wszystkie komórki mają jednakowe zdolności rozwojowe.

POŚREDNIA ORGANOGENEZA NIE DAJE JEDNORODNOŚCI ROŚLIN

EKSPLANTAT PIERWOTNY

->

Odróżnicowanie komórek DEDYFERENCJACJA

->

KALUS

->

Powtórne różnicowanie odmłodzonych komórek REDYFERENCJACJA

->

TWORZENIE ORGANÓW

SOMATYCZNA EMBRIOGENEZA - kierunek morfogenezy in vitro, w którym z roślinnych komórek somatycznych formują się zarodki przybyszowe nie połączone wiązkami przewodzącymi z tkanką macierzystą. Zarodki powstają z komórek, które nie są produktem fuzji gametycznej.

BEZPOŚREDNIA - zarodki tworzą się bezpośrednio z komórek eksplantatu.

Eksplantat -> zarodek

POŚREDNIA - w trakcie procesu występuje faza kalusa, tkanki z której komórek regenerowane są zarodki.

Eksplantat -> kalus -> zarodek/zarodki

Indukcja somatycznej embriogenezy zachodzi najczęściej pod wpływem auksyn.

MIKROROZMNAŻANIE

MIKROPROPAGACJA, KLONOWANIE IN VITRO

Polega na wyłożeniu na pożywkę w warunkach in vitro eksplantatu z którego na drodze indukowanej morfogenezy uzyskujemy namnożone rośliny identyczne z tą od której pochodził eksplantat.

Przy wykorzystaniu tej metody należy uwzględnić:

• Metoda musi gwarantować wysoki stopień identyczności genotypowej i genotypowej (brak mutacji i długo utrzymujących się zmian epigenetycznych)

• Powinna być opłacalna w porównaniu z mnożeniem tradycyjnym.

Istnieją 3 sposoby mikrorozmnażania:

1. Poprzez wyłożenie na pożywkę merystemów, pąków wierzchołkowych i/lub bocznych (pachwinowych, kątowych), znajdujących się na roślinie matecznej.

Wydajność tej metody zależy od liczby paków które u danego gatunku tworzą się na pędzie.

Zaletą metody jest jednolitość genetyczna roślin potomnych z rośliną mateczną (stabilność genetyczna), ponieważ w procesie morfogenezy nie uczestniczy tkanka kalusowa.

2. Poprzez indukowanie w kulturze pędów przybyszowych (tj. pędów, których zaczątki w eksplantacje nie występowały) wyrastających bezpośrednio z eksplantatu, lub kalusa na nim utworzonego.

W przypadku indukowania pędów przybyszowych powstają one często w kalusie (po kilku pasażach).

U niektórych gatunków można je uzyskać bezpośrednio w wyniku podziałów komórek warstwy subepidermalnej, które tworzą merystemy pędowe a następnie pąki na fragmentach liści, cebul, łusek.

Ten sposób mikrorozmnażania pozwala na otrzymanie licznych roślin (zależnie od zdolności morfogenetycznych kalusa).

Wadą jest możliwość wystąpienia niestabilności genetycznej z powodu pośrednictwa Klausa oraz spadek zdolności morfogenezy w miarę pasażowania.

3. Przez indukowanie, najczęściej na kalusie przybyszowych zarodków somatycznych.

SOMATYCZNA EMBRIOGENEZA przebiega w 2 fazach:

Faza I

• Indukcji - następuje pod wpływem auksyn powodujących odróżnicowanie komórek i ich podziały.

Komórki potomne nie rozdzielają się ale tworzą zgrupowania zwane jako masa zarodkowa. Podlega ona intensywnym podziałom nie zmieniając kierunku rozwojowego do czasu usunięcia auksyny z pożywki.

Faza II

• Różnicowanie - w masie zarodkowej przeniesionej na pożywkę bez auksyny następuje rozwój zarodków poprzez stadium globularne, sercowate, torpedy.

• Dla prawidłowego kiełkowania zarodki powinny wykształcić funkcjonalne merystemy pędowe i korzeniowe co dokonuje się w procesie ich dojrzewania, a sprzyja temu zwiększona ilość sacharozy i dodatek ABA w pożywce.

Technika mikrorozmnażania obejmuje następujące etapy:

1. Założenie i stabilizacja kultury

• Dezynfekcja materiału roślinnego

• Wycinanie eksplantatów i wykładanie na pożywki

• Indukcja wzrostu pędu lub kalusa

• Etap kończy się z chwilą wytworzenia pędów lub kalusów zdolnych do organogenezy

2. Namnażanie pędów

• Celem jest uzyskanie pożądanej liczby pędów, więc w zależności od wydajności namnażania polega na wykonaniu odpowiedniej liczby pasaży (może stanowić najdłuższy okres kultury)

• W zależności od gatunku, a nawet genotypu w składzie pożywki uwzględnia się cytokininy, auksyny, gibereliny.

3. Ukorzenianie

• Pędy powstając w wyniku rozkrzewiania oddziela się od eksplantatu inicjalnego i przenosi na pożywkę stymulującą ukorzenianie co osiąga się najczęściej poprzez dodatek auksyn (u niektórych gatunków ukorzenianie następuje pod koniec pasażu namnażania). Stymulacja ukorzeniania zachodzi także pod wpływem retardantów, floroglucynolu, witaminy D, aminokwasów.

4. Adaptacja do warunków in vivo

• Ponieważ rośliny z kultur in vitro charakteryzują się:

• znacznym uwodnieniem tkanek

• słabym zdrewnieniem

• niecałkowicie wykształconą tkanką okrywającą

• niefunkcjonalnymi aparatami szparkowymi

• Dlatego też są podatne na wysychanie i porażenie przez choroby i szkodniki.

• Z tego powodu w okresie adaptacji należy je chronić przed wysychaniem i zakażeniami wykorzystując szklarnie, mnożarki, pokoje wzrostowe o ustalonych warunkach temperatury, światła i wilgotności.

Metody eliminowania wirusów

• Kultura in vitro merystemów wierzchołkowych

• Chemioterapia

• Termoterapia

• Krioterapia

Ad. Kultury merystemów wierzchołkowych

Fragmenty merystemów (0,2-1,0 mm długości) izoluje się z:

• Pąków wierzchołkowych

• Lub bocznych

Kultury merystemów inkubuje się w pomieszczeniu w temp 8-22stC, przy doświetlaniu ciągłym światłem, stosując pasaże na świeżą pożywkę co 3-4 tygodnie. Duże znaczenie ma przygotowanie roślin do przeniesienia ze szkła do doniczek (pasaż na pożywkę ukorzeniającą, o zwiększonej zawartości auksyny, zmniejszonym stężeniu soli mineralnych oraz bez sacharozy). Zabieg ten ułatwia roślinom podjęcie fotosyntezy i powrót do samożywności. Po czym otrzymujemy roślinę odpowiednią do wysadzenia na podłoże glebowe.

Po przeprowadzeniu pierwszego testowania i wyeliminowania roślin podejrzanych o zawirusowanie otrzymujemy elitarny matecznik, który utrzymuje się w warunkach pełnego zabezpieczenia przed wtórną infekcją. Rośliny mateczne co 3 m-ce poddaje się regularnym kontrolom fitosanitarnym.

Ad. Chemioterapia in vitro

Antymetabolity należą do związków o wysokiej aktywności przeciwwirusowej. Są to substancje włączające się w metabolizm wirusów i wywołujące zmiany w kodzie genetycznym RNA wirusowego, hamując ich namnażanie się. Należą do nich analogi pirymidyn - uracyl, tiouracyl, bromouracyl oraz analogi puryn. Najczęściej są stosowane jako dodatek do pożywki dla kultury merystemów wierzchołkowych w celu zwiększenia skuteczności zwalczania wirusów.

Także niektóre surfaktanty wykazują właściwości podobne do antymetabolitów, np.: DEMEB (bromek dodecylo-N-metyloefedryny), i są stosowane jako dodatek do pożywki.

Ad. Termoterapia in vitro

Traktowanie eksplantatów wyłożonych na pożywkę (np. merystemów wierzchołkowych pędów, czy kalusa) podwyższoną temperaturą (36stC podczas dnia i 30stC w nocy przez 4-8 tygodni) eliminuje wiele wirusów, a nawet niektóre gatunki bakterii systemicznie zasiedlających tkanki przewodzące roślin.

Warunki terapeutyczne dobiera się eksperymentalnie, dla konkretnego gatunku rośliny i rodzaju wirusa, uwzględniając zakres temperatur tolerowanych przez roślinę; a jednocześnie mieszczących się pomiędzy optimum inaktywującym wirusa a maksimum tolerowanym jeszcze przez eksplantat.

Termoterapia in vitro, np. Vitis vinifera, dawała najlepsze rezultaty, kiedy traktowano podwyższoną temperaturą 36stC przez 6 tygodni ukorzenione już roślinki. Natomiast świeżo izolowane merystemy bardzo źle znosiły ten zabieg, zwłaszcza że należało do powtórzyć dwukrotnie, aby uzyskać całkowitą eliminację wirusów.

Ad. Krioterapia

Większośc wirusów toleruje niskie temperatury podczas krioprezerwacji eksplantatów. Tylko niewielka grupa termolabilnych wirusów roślinnych może być eliminowana przez mrożenie. Przykładem może być wirus szarki śliwy (PPV), który wyeliminowano stosując metodę kombinowaną, czyli izolację małych merystemów wierzchołkowych pędów (0,3-1mm) i krioterapię.

Izolowane merystemy Prunus wyłożono na 24 godziny do pożywki zawierającej 5% DMSO (dimetylo-sulfotlenek) i 2% proliny, po czym schłodzono do 4stC.

Następnie pasażowano je na 20-40min do mieszaniny kroprotektantów PVS2 (12,5% DMSO, 15% glikolu etylenowego, 25% glicerolu, 3% glikolu polietylenowego i 0,4 M sacharozy).

PO prakulturach merystemy poddano powolnemu schładzaniu (1stC/min) do temperatury -40stC, po czym zanurzono je wciekłym azocie (-169stC).

Następnego dnia merystemy odmrożono i wyłożono na pożywkę MS. Przeprowadzone po 4 miesiącach testowanie (metodą PCR) wykazało że 54% oślin zostało uwolnionych od wirusa szarki.

---