Ilościowe oznaczanie zawartości białka w roztworze metodą Bradforda i pomiaru absorbancji w nadfiolecie.

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodami kalorymetrycznym pozwalającymi na ilościowe oznaczenie zawartości białka w roztworze, takimi jak:

• metoda microbiuretowa

• metoda Lowry'ego

• metoda Bradforda,

• a także przez pomiar absorbancji w nadfiolecie.

Podczas ćwiczenia zostanie oznaczone stężenie mysiego translacyjnego czynnika inicjacyjnego - 4E (eIF4E) w roztworze dwoma metodami: metodą Bradforda oraz metodą pomiaru absorbancji w nadfiolecie.

Metoda Bradforda wykorzystuje zdolność wiązania barwnika błękitu brylantowego Coomassie G-250 (ang.Coomasie Brillant Blue) z białkiem. W środowisku kwaśnym widmo absorpcji barwnika charakteryzuje się maksimum przy 465 nm, natomiast po związaniu białka maksimum przesuwa się w stronę fal dłuższych i występuje w przy 595 nm. Mając wyznaczoną krzywą kalibracyjną dla wzorcowego białka (np. BSA, IgG) można określać zawartość białka w badanej próbce poprzez pomiar zmiany absorbancji w 595 nm roztworu barwnika po dodaniu do niego badanej próbki.

Rys. Widmo absorpcji odczynnika Bradforda przed (----) i po dodaniu BSA (12 μg/ml)(----).

Większość białek dzięki obecności aminokwasów aromatycznych tryptofanu i tyrozyny, wykazuje maksimum absorbancji przy około 280 nm co pozwala na oznaczenie zawartości białka w roztworze przez bezpośredni pomiar absorbancji w nadfiolecie.

Przed przystąpieniem do ćwiczenia należy zapoznać się:

1. z zasadami ilościowego oznaczania białka metodą: microbiretową, Lowry'ego, Bradforda i pomiaru absorbancji w nadfiolecie na podstawie dostępnej literatury np.: i inni: „Ćwiczenia z Biochemii” red. L. Kłyszejko-Stefanowicz ,J. Walory, M. Pilarek, M. Kalinowska, H. Jaworska-Deptuch „Biochemia, ćwiczenia laboratoryjne”

2. własnościami spektralnymi aminokwasów aromatycznych

Przed ćwiczeniem odbędzie się kolokwium wstępne obejmujące następujące zagadnienia:

1. Stężenia roztworów: procentowe, molowe

2. Siła jonowa buforów, pH

3. Prawo Lamberta-Beera, molowy współczynnik ekstynkcji (ε)

4. Podstawowe informacje na temat budowy i właściwości aminokwasów i białek

Wyznaczanie parametrów kinetycznych w reakcji utleniania alkoholi katalizowanej przez dehydrogenazę alkoholową.

Celem ćwiczenia jest wyznaczenie parametrów kinetycznych jakimi są K_m i V_max dla reakcji utleniania alkoholi etylowego, benzylowego, 1-propanolu lub 1-butanolu przez dehydrogenazę alkoholową (EC 1.1.1.1) wyizolowaną z drożdży. Enzym ten, należący do grupy oksydoreduktaz, katalizuję reakcje utleniania alkoholi pierwszorzędowych do odpowiednich aldehydów, bądź reakcje odwrotną: redukcji aldehydu do alkoholu. Proces ten przebiega stereospecyficznie. W obydwu tych procesach wymagany jest odpowiedni kofaktor (NAD⁺, NADH).

Wykonanie ćwiczenia

Grupa wykonująca ćwiczenie będzie badać szybkość reakcji enzymatycznej w stałych warunkach dla różnych stężeń substratu (z zakresu gdzie szybkość reakcji zależy od stężenia). Grupa powinna przeprowadzić pomiary kinetyczne dla etanolu i innego wybranego alkoholu pierwszorzędowego (pięć różnych stężeń dla każdego alkoholu). Wyznaczone szybkości należy zastosować do wyznaczenia K_m i V_max metodą Lineweavera-Burka, a otrzymane wyniki przedyskutować.

Przebieg reakcji będzie monitorowany spektrofotometrycznie przez zmiany absorbancji pochodzącej od odpowiedniej formy kofaktora.

Przed przystąpieniem do ćwiczenia należy przyswoić sobie następujące pojęcia:

1. Ogólne wiadomości na temat budowy i funkcji enzymów

2. Model Michaelisa-Mentena

3. Metody wyznaczania stałej Michaelisa (K_m) i szybkości maksymalnej (V_max) ze szczególnym uwzględnieniem metody Lineweavera-Burka.

4. Sens fizyczny K_m i V_max.

5. Typy inhibicji enzymatycznej i ich wyznaczania metodą Lineweavera-Burka.

6. Budowa dehydrogenazy alkoholowej .

7. Rola kofaktorów.

8. Struktura oraz właściwości spektralne w UV-Vis: NAD⁺, NADH.

Polecana literatura.

Biochemia - L. Streyer

Ćwiczenia z biochemi - L. Kłyszejko-Stefanowicz.

Mile widziane sięgnięcie do literatury oryginalnej dotyczącej badań nad kinetyką enzymatyczną (bez trudu mogą być wyszukane w różnych bazach danych dostępnych w Internecie a następnie w bibliotekach.

Ćwiczenie stanowi kontynuację ćwiczenia z Chemii Fizycznej.

Analiza elektroforetyczna białek w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących.

Istotę zjawiska elektroforezy stanowi wędrówka w polu elektrycznym cząsteczek mających dodatni lub ujemny ładunek elektryczny i proces rozdzielania tych cząsteczek na skutek różnicy szybkości ich wędrowania w roztworze (elektroforeza swobodna) bądź w nośnikach (np.: elektroforeza bibułowa, elektroforeza żelowa). W biochemii najczęściej stosowanym rodzajem elektroforezy jest jej wariant żelowy. W przypadku rozdziału i oczyszczania białek stosowane są żele poliakrylamidowe.

Celem powyższego ćwiczenia jest zapoznanie się z elektroforezą białek w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS, która jest stosowana do oznaczania ich mas cząsteczkowych. Ćwiczenie obejmuje przygotowanie żelu piliakrylamidowego, próbek białkowych, rozdział elektroforetyczny oraz barwienie elektroferogramu.

Rys. Przykład rozdziału białek i analizy ich mas cząsteczkowych w 15 % żelu poliakrylamidowym wybarwionych metodą Coomassie Brilliant Blue.

Przed przystąpieniem do ćwiczenia należy zapoznać się z:

1. Istotą zjawiska elektroforezy

2. Elektroforezą bibułową

3. Elektroforezą żelową w szczególności elektroforezą białek w żelach poliakrylamidowych w tym :

• polimeryzacją żelu poliakrylamidowego

• metodą oznaczania mas cząsteczkowych białek

• technikami wybarwiania żeli

Literatura:

1. „Ćwiczenia z Biochemii” red. L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 1999 i następne

2. L. Stryer „Biochemia”, PWN, Warszawa 1997 i następne

3. J. Walory, M. Pilarek, M. Kalinowska, H. Jaworska-Deptuch „Biochemia, ćwiczenia laboratoryjne” WPW, Warszawa 2003

4. „Biofizyka dla biologów” red. M. Bryszewska i W. Leyko, PWN, Warszawa 1997

Frakcjonowanie wątroby szczura wg Schneidera i ilościowe oznaczenie w niej kwasów nukleinowych

Celem ćwiczenia będzie spreparowanie wątroby szczura laboratoryjnego w celu otrzymania frakcji kwasów nukleinowych, a następnie oszacowanie metodami kolorymetrycznymi ilości mg DNA i RNA w przeliczeniu na 100 mg wątroby.

Ćwiczenie zapoznaje studenta z podstawowymi metodami stosowanymi w preparatyce biochemicznej ( homogenizacja, wirowanie i pozyskiwanie supernatantu, ekstrakcja...), oraz sposobem wyznaczania stężenia przy pomocy krzywej kalibracyjnej ( kolorymetria ).

Metoda stosowana w ćwiczeniu będzie szybka i prosta, lecz posiadająca wadę - nierozdzielone składniki DNA i RNA, co ogranicza ilość stosowanych metod analitycznych.

Przed przystąpieniem do wykonywania ćwiczenia należy zapoznać się z opisem i zrozumieć celowość poszczególnych etapów frakcjonowania tkanki, oraz poznać ogólne wiadomości o budowie kwasów nukleinowych.

Opis ( wykonywany indywidualnie ) powinien zawierać oprócz krótkiej części opisowej , wyniki pomiarów absorbcji, wykres krzywej kalibracyjnej zależności absorbcji od mg DNA/RNA w próbce, oraz wyliczenie mg RNA/DNA w przeliczeniu na 100 mg wątroby,

Zagadnienia do kolokwium zaliczeniowego:

• ogólne wiadomości o budowie kwasów nukleinowych

• wiązanie glikozydowe

• podstawowe metody wyodrębniania kwasów nukleinowych z tkanek - zasadnicze różnice

• etapy frakcjonowania tkanki met. Schneidera ( jakie procesy tam zachodzą

• podstawy kolorymetrii

---