Biologia molekularna, sylabus 2 bloku tematycznego

Molekularna organizacja informacji genetycznej i jej zaburzenia

Genom

• genom jądrowy, genom mitochondrialny, NORs, geny mozaikowe, monocistronowy mRNA, rodziny wielogenowe, pseudogeny, fragmenty genów, geny w genach, retropozycja, formy reliktowe genów, sekwencje SINE, sekwencje LINE, satelitarny DNA, DNA minisatelitarny, DNA mikrosatelitarny, obszar 3'UTR, obszar 5'UTR, sekwencje unikatowe DNA, sekwencje tandemowe DNA, sekwencje LTR DNA, sekwencje telomerowe, paradoks wielkości C, modele kondensacji chromatyny (patrz sylabus 1 bloku tematycznego), chromatyna płciowa, ciałko Barra, pałeczka dobosza, lionizacja, ciałko Y (chromatyna Y), chromosomy A i B (nie dotyczy klasyfikacji denverowskiej), chromosomy płci, minichromosomy, liczby - x, n i 2n chromosomów;

Cytogenetyczna nomenklatura chromosomów człowieka

• klasyfikacja chromosomów człowieka (Denver, 7 grup), chromosomy metacentryczne, chromosomy submetacentryczne, chromosomy akrocentryczne, indeks ramion chromosomu, indeks centromerowy, idiogram, histogram, kariotyp, kariogram, zapis wyników badań cytogenetycznych (numeracja prążków, wykaz skrótów, zapis aberracji chromosomowych, zapis loci genów);

Polimorfizm genetyczny

• polimorfizm pojedynczych nukleotydów [SNP = single nucleotide polymorphism];

• polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych [STRP = short tandem repeat polymorphism];

• polimorfizm sekwencji minisatelitarnych [VNTR = variable number tandem repeats];

Metodyka analiz cytogenetycznych: techniki hodowli komórkowych - limfocytów, fibroblastów, amniocytów, komórek trofoblastu, indukowana transformacja blastyczna

• fitohemaglutynina (faseolina), kolchicyna, kolcemid, szok hipotoniczny (chlorek sodu), kariogram, uzyskiwanie amniocytów przez amniopunkcję, otrzymywanie komórek trofoblastu metodą aspiracji;

Metody analizy chromosomów:

• barwienia absorbcyjne i fluorescencyjne, techniki - GTG, HRT, QFQ, RHG, CBG;

• Ag-NOR, CMA, DAPI;

• prążki G, prążki Q, prążki R, prążki C, prążki N, prążki T, heterochromatyna konstytutywna, regiony jąderkotwórcze;

Metoda hybrydyzacji in situ i jej pochodne

• technika FISH, multiplex FISH (=M-FISH), SKY-FISH, Fiber FISH, porównawcza hybrydyzacja genomów, CGH, Array CGH, sonda molekularna (sondy - specyficzne, centromerowe, malujące), fluorochrom;

Analiza chromosomów w cytometrze przepływowym

• histogram, ocena zawartości DNA, ocena stosunku par AT/GC w poszczególnych chromosomach;

Aberracje chromosomalne strukturalne i ich efekty (translokacje, insercje, inwersje, izochromosomy, delecje, duplikacje, chromosomy koliste i dicentryczne)

• fuzja centryczna, inwersja pericentryczna (eucentryczna), inwersja paracentryczna (acentryczna), delecja (deficjencja) terminalna i interstycjalna, następstwa aberracji chromosomowych strukturalnych, translokacja insercyjna, translokacje robertsonowskie zrównoważone i niezrównoważone, translokacja wzajemna, genetyczna jakość gamet produkowanych przez osobniki z translokacjami (odrębnie translokacje - wzajemna, robetsonowska, insercyjna), supresja crossing over pzez inwersję;

Aberracje liczbowe (euploidia, aneuploidia)

• aneuploidie (trisomie, monosomie, tetrasomie, nullisomie), euploidie (poliploidie): autopoliploidie, allopoliploidie, kariotypy aneuploidii, kariotypy euploidii,

Molekularne podłoże mutagenezy

Mutacje spontaniczne i indukowane

• definicja mutagenu, klasy mutagenów, mutagenne działanie: promieniowania UV i o wysokiej energii, kwasu azotowego (deaminacja), metanosulfonianu metylu (metylacja), benzopirenu (tworzenie adduktów), bromku urydyny (interkalacja), psorolenów (indukowanie kowalencyjnych połączeń pomiędzy niciami polinukleotydowymi i w obrębie pojedynczej nici) i analogów zasad, mutageny biologiczne;

Mutacje punktowe

• insercja, delecja, substytucja, inwersja sekwencji DNA w obrębie genu, mutacje w obrębie promotora genu;

Wybrane przykłady mutacji punktowych:

• dystrofia mięśniowa Duchenne'a/Beckera: DMD (Xp21.1), dystrofina;

• hemofilia: geny czynników VIII (Xq28) i IX (Xq27), czynniki VIII (hemofilia A) i IX hemofilia B) krzepliwości krwi;

• achondroplazja: FGFR3 (4p16), białko FGFR3 (receptor czynnika wzrostu fibroblastów);

• rodzinna hipercholesterolemia: LDLR (19p13), LDLR (receptor lipoprotein niskiej gęstości);

• zespół Marfana: FBN1 (15q21.1), fibrylina 1;

• Osteogenesis imperfecta: zazwyczaj COL1A1 (17q21.33), COL1A2 (7q21.3), łańcuchy prokolagenowe kolagenu I;

• choroba von Willebranda: VWF (12p13.3), białko czynnika von Willebranda (VWF);

• mukowiscydoza: CFTR (7q31.2), białko CFTR;

• zespół Hurler: IDUA (4p16.3), enzym alfa L-iduronidaza;

• fenyloketonuria: PAH (12q22-24), enzym hydroksylaza fenyloalaniny;

• hemoglobinopatie (wybrane): geny globinowe (chromosomy 11 i 16), łańcuchy globinowe hemoglobin/hemoglobiny A1;

Mutacje dynamiczne, przykłady:

• zespół łamliwego chromosomu X (=FRAXA), FMR1, FMRP, (CGG)_n^*

• dystrofia miotoniczna (=DM), kinaza proteinowa dystrofii miotonicznej, DMPK (Dystrophy Myotonic Protein Kinase), białko DMPK, (CTG)_n ^*

• choroba Huntingtona, HD, huntingtyna, (CAG)_n;^*

Mutacje miejsc cięcia na granicy intron-egzon

• sekwencje miejsca rozpoznawania, akceptorowego;

Insercja transpozonów

Przyczyny mutacji sekwencji aminokwasowych produkowanego polipeptydu

• mutacje zmiany sensu = missense mutations;

• nonsensowne = nonsense mutations;

• zmiany ramki odczytu = frame shift mutations;

• ciche = silent mutations (w sensie mutacje synonimowe);

Mechanizmy naprawcze:

• bezpośrednie usunięcie uszkodzenia, naprawa z udziałem metylotransferaz (MGMT, samobójcza DNA-metylotransferaza), naprawa z wycięciem nukleotydu (nucleotide excision repair = NER, białka uczestniczące w procesie: białka XPA (xeroderma pigmentosum, complementation group A), XPC (xeroderma pigmentosum, complementation group C), endonukleazy XPF, XPG, helikazy XPB, XPD, polimeraza DNA, ligaza DNA), naprawa z wycięciem zasady (base excision repair = BER, białka uczestniczące w procesie: glikozydazy DNA, endonukleazy AP, polimeraza DNA, ligaza DNA), naprawa błędnie sparowanych zasad (mismatch repair = MMR), naprawa pęknięć dwuniciowych - z udziałem i bez udziału sekwencji homologicznych (non-homologous end joining, NHEJ, ligaza DNA, białka kompleksu - białka Ku, kinaza DNA-PKcs = DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit, białko XRCC4

• );

• prokariotyczne systemy naprawy DNA - fotoreaktywacja (fotoliaza), system SOS (białka RecA, LexA)

Niestabilność genomu (chromosomal instability)

Zaburzenia chromosomowe (zespoły)^*

• Pradera-Williego - geny kandydackie w etiologii PWS: SNRPN (small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N, 15q11.2), MKRN3 (makorin ring finger protein 3, wcześniej gen opisywany kodem ZNF127 = zinc finger protein 127, białko palca cynkowego 127, 15q11-q13), NDN (necdin [mouse] homolog, 15q11.2-q12), MAGEL2 (MAGE-like 2, wcześniej gen opisywany kodem NDNL1 = necdin-like protein 1, 15q11-q12);

• Angelmana - geny kandydackie w etioloii AS: UBE3A (ubiquitin protein ligase E3A, 15q11.2), ATP10A (ATPase, class V, type 10A, wcześniej gen opisywany kodem ATP10C, 15q11.2);

• Di George'a - TBX1 (T-box 1, 22q11.21, wady serca, hipoplazja grasicy, rozszczep wargi i podniebienia, utrata słuchu, brak funkcjonowania przytarczyc),UFD1L (ubiquitin fusion degradation 1 like, 22q11.2), COMT (catechol-O-methyltransferase, 22q11.21), HIRA (HIR histone cell cycle regulation defective homolog A, 22q11.21) - brak produktów trzech ostatnich genów zaburza różnicowanie łuków skrzelowych;

• Williamsa-Beurena- geny obecne w regionie krytycznym - 7q11.23: ELN (elasin, elastyna, cechy dysmorficzne twarzy, wady układu sercowo-naczyniowego), LIMK1 (LIM domain kinase 1, zaburzenie funkcji poznawczych), RFC2 (replication factor C [activator 1] 2, 40kDa, niedobór wzrostu, zaburzenia rozwojowe), GTF2I (general transcription factor IIi), STX1A (syntaxin 1a, ekspresja ograniczona do tkanki nerwowej), BAZ1B (bromodomain adjacent to zinc finger domain, 1B), CLIP2 (CAP-GLY domain containing linker protein 2, UWAGA: wcześniej gen opisywany pod nazwą CYLN2 = cytoplasmic linker protein 2 i pod tą nazwą opisany jest w dostępnej na stronie internetowej prezentacji), NCF1 (neutrophil cytosolic factor 1), GTF2IRD1 (GTF2I repeat domain containing 1), FZD9 (frizzled family receptor 9, UWAGA: we wcześniejszych opisach gen występował pod nazwą FZD3 i tak jest przedstawiony w prezentacji dostępnej na stronie internetowej, co może powodować błędną interpretację - gen FZD3 obecny jest bowiem w ramieniu krótkim chromosomu 8), EIF4H (eukaryotic translation initiation factor 4H, UWAGA: we wcześniejszych opisach gen występował pod nazwą WSCR1 = Williams-Beuren syndrome chromosomal region 1 protein, i pod tą nazwą wskazany jest w prezentacji dostępnej na stronie internetowej;

• Wolfa-Hirschorna, WHSC1 (Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1, 4p16, cechy dysmorficzne twarzy), LETM1 (leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1, 4p16.3, napady padaczkowe), MSX1 (msh homeobox 1 = HOX7, 4p16.2, agnezja zębów, także rozszczep wargi i podniebienia), w patogenezie zespołu sugerowany jest też udział PAX6 (4p16.1)

• Cri du chat - CTNND2 (catenin (cadherin-associated protein), delta 2, 5p15.2, ekspresja ograniczona do wczesnego rozwoju układu nerwowego, opóźnienie umysłowe), SEMA5A (transmembrane domain [TM] and short cytoplasmic domain, [semaphorin] 5A, semaforyna 5A, 5p15.31, prawopodonme zaburzenia w rozwoju OUN, u myszy homolog tego genu reguluje przestrzenny kierunek rozwoju wypustek aksonalnych oraz migrację prekursorów neuronalnych w rozwoju kory mózgowej; UWAGA: w prezentacji dostępnej na stronie internetowej gen opisany jest pod starszą nazwą SEMAF = semaforyna F, nazwa tutaj wskazana jest aktualnie obowiązującą, patrz HUGO Gene Nomenculature Comittee (HGNC) database); TERT (telomerase reverse transcriptase, 5p15.33, zmiany wynikające z zaburzenia resyntezy telomerów); w obszarze krytycznym 5p obecne są sekwencje powtarzane, co prawdopodobnie stanowi o jego niestabilności;

• Downa - geny, wobec których istnieje wysokie prawdopodobieństwo, że mogą wpływać na poszczególne cechy zespołu Downa: MX1 (myxovirus [influenza] resistance 1, 21q22.3, związany z opóźnieniem umysłowym oraz wybranymi cechami morfologicznymi - skośne szpary powiekowe, płaski nos, pobrużdżony język, szerokie dłonie, klinodaktylia 5 palca, hipotonia mięśniowa, niski wzrost, plamki Brushfielda w tęczówce), RCAN1 (regulator of calcineurin 1, obocznie - DSCR1 = Down syndrome critical region gene 1, 21q22.1-22.2, wady serca (ubytek przegrody przedsionkowo-komorowej), opóźnienie umysłowe), GATA1 (GATA binding protein 1, Xp11.23, ostra białaczka megakarioblastyczna), SOD1 (superoxide dismutase 1, 21q22.11, nadekspresja może powodować przedwczesne starzenie się oraz osłabienie odpowiedzi immunologicznej), COL6A1 (collagen type 6, alpha 1, kolagen typu VI, łańcuch alfa 1, 21q22.3, choroby serca), DYRK1A (dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1, 21q22.13, opóźnienie umysłowe), APP (amyloid beta precursor protein, 21q21.3, wczesna choroba Alzheimera); etiopatogenezę trisomii tłumaczy się w oparciu o dwie hipotezy: 1) jako prostą konsekwencję ekspresji genów obecnych w dodatkowym chromosomie (a gene dosage effect), 2) jako wtórny efekt nadekspresji części genów, zaburzający ekspresję innych genów, zarówno na chromosomie dodatkowym, jak i na innych chromosomach (developmental instability hypothesis); w dodatkowym chromosomie 21 jedynie 9-13% genów podlega prawidłowej ekspresji, ekspresja jego pozostałych genów jest ograniczona (efekt kompensacji; obszar krytyczny - 21q22.2, 21q22.3); argumentem na rzecz drugiej z hipotez może być związek, obserwowanej w tkankach płodów z rozpoznanym zespołem Downa, nadekspresji genu RCAN1 (regulator of calcineurin 1, 21q22.12, w pracach, które wykorzystałem gen opisywany starszą nazwą - DSCR1 = Down syndrome critical region gene 1) z inhibicją ścieżki sygnalizacyjnej calcineuryny i wyciszaniem ekspresji genu NFATC (nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic, calcineurin-dependent 1, 18q23), co zaburza różnicowanie i rozwój pierwotnych

• komórek śródbłonkowych (angiogenezę);

• Edwardsa - podobnie jak w przypadku innych trisomii, etiopatogeneza zespołu Edwardsa tłumaczona może być wypadkową ekspresji części genów obecnych na dodatkowym chromosomie (podwyższona ekspresja dotyczy ok. 12% genów obecnych na chromosomie 18, odnośnie pozostałych genów dodatkowego chromosomu - proszę pamiętać o efekcie kompensacyjnym) i wyciszania ekspresji innych genów - z udziałem produktów tych pierwszych; w pozyskiwanych przyżyciowo komórkach płodów z rozpoznanym zespołem Edwardsa (amniocyty, komórki kosmówki) notowano ograniczenie transkrypcji genów CITED2 (Cbp/p300-interacting transactivator, with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain, 2; 6q24.1, wyciszanie ekspresji tego genu wiązane jest z ograniczaniem wzrostu łożyska, zaburzeniem wzrostu płodu i wrodzonymi wadami serca), LSS (lanosterol synthase (2,3-oxidosqualene-lanosterol cyclase, 21q22.3) i EBP (emopamil binding protein [sterol isomerase], Xp11.23-Xp11.22; enzymy będące produktami dwóch ostatnich genów uczestniczą w szlaku syntezy cholesterolu, ograniczanie transkrypcji tych genów skutkuje znaczącym obniżeniem stężeń 7-dehydrocholesterolu i cholesterolu w surowicy chorych, co obserwuje się także w zespole Smitha-Lemliego-Opitza, z którym zespół Edwardsa ma cechy wspólne (porównywalne obrazy kliniczne);

• Pataua - brak jest jednoznacznie zdefiniowanych obszarów krytycznych na chromosomie 13, które w związku z jego trisomią tłumaczyłyby fenotyp zespołu Pataua, chociaż zwykle wskazuje się region leżący proksymalnie do paska 13q14 lub dystalnie do 13q22, przy czym obraz zmian wiązany jest raczej ze współdziałaniem obecnych tam genów, podlegających podwyższonej ekspresji, niż z prostym efektem ich nadekspresji; podwyższoną ekspresję genu esterazy D (ESD, esterase D, 13q14.1-q14.2) w tkankach nerki płodów z rozpoznanym zespołem Pataua można wiązać z wrodzonymi wadami tego narządu;

• Turnera (dokładnie Ullricha-Turnera) - niski wzrost chorych wiąże się z ograniczoną ekspresją genu homeotycznego SHOX (short stature homeobox), obecnego w 1 regionie pseudoautosomalnym (Xp22.33), więc nie podlegającemu wyciszeniu w prawidłowym kariotypie żeńskim.

• Klinefeltera - fenotyp zespołu tłumaczony jest ekspresją części genów obecnych na dodatkowym chromosomie X, które nie podlegają inaktywacji; ponad 10% genów obecnych na chromosomie X u mężczyzn podlega ekspresji w tkankach jądra, co, w przypadku dodatkowej ekspresji, pozwala tłumaczyć zmiany strukturalne tego narządu oraz zaburzenia hormonalne obecne w obrazie klinicznym zespołu Klinefeltera; przyspieszony wzrost chorych wiązany jest z nadekspresją genu homeotycznego SHOX, obecnego w 1 regionie pseudoautosomalnym (PAR1) Xp;

• 47,XXX - fenotyp kojarzony jest z nadekspresją genów, które nie podlegają wyciszeniu w dodatkowym chromosomie X (5-10% genów inaktywowanego chromosomu X, poza sekwencjami PAR1, PAR2 (pseudoautosomal regions - te obszary chromosomu nie podlegają inaktywacji!) zachowuje genetyczną aktywność; proszę nie stosować terminu zespół nadsamicy (superfemale syndrome), którym zespół był pierwotnie opisany w roku 1959, przypadki diagnozowane są jako 47,XXX lub (w angielskim) Triple X lub Triplo-X; kazuistycznie opisywane są w piśmiennictwie przypadki tetrasomii i pentasomii X, wiążące się z cechami dysmorficznymi, wadami wrodzonymi, w ostatnim przypadku też ze znaczącym niedoborem wzrostu;

• 47,XYY

• mężczyźni 46,XX

• imprinting genomowy (rodzicielskie piętno genomowe); delecje genów podlegających imprintingowi opisywane są w etiologii zespołów Pradera-Williego, Angelmana (15q11-q13), Beckwitha-Wiedemana (11p15), Russela-Silvera (chromosom 7) i dziedzicznej osteodystrofii Albrighta (chromosom 20); w przypadku dwóch pierwszych zespołów, których podłoże molekularne Was obowiązuje, wzorzec imprintingu na chromosomie 15 określany jest przez sekwencję IC (imprinting centre), obecną w locus genu SNRUF-SNRPN;

Jeżeli tematy tego akapitu wzbudzą czyjeś głębsze zainteresowanie, zapraszam do siebie, mogę udostępnić kopie prac oryginalnych. Z.P.

Elementy biotechnologii

Rekombinowanie i klonowanie DNA

• rekombinacja - homologiczna, umiejscowiona, niehomologiczna, konwersja genów; restryktazy (klasy I-III); wektory - ekspresyjne, klonujące, bifunkcjonalne, plazmidy, bakteriofagi, kosmidy, retrowirusy, adenowirusy, wirus opryszczki, YAC (yeast artificial chromosome, sztuczny chromosom drożdżowy), BAC (bacterial artificial chromosome, sztuczny chromosom bakteryjny), PAC (P1-derived artificial chromosome), MACs (mammalian artificial chromosomes, sztuczne chromosomy ssacze); biblioteki genomowe i cDNA; sonda genetyczna; elektroforeza żelowa;

Analiza i zastosowania klonowanego DNA

• elektroforeza kwasów nukleinowych;

Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR)

• RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ;

• PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR);

• Multiplex PCR;

• RFLP PCR;

• gniazdowy PCR, zagnieżdżony PCR (nested PCR);

Sekwencjonowanie kwasów nukleinowych

• metoda Sangera;

• metoda Maxama-Gilberta;

• pirosekwencjonowanie;

Organizmy modyfikowane genetycznie (GMO)

• rośliny transgeniczne, zwierzęta transgeniczne,

• ochrona środowiska przed genetycznie modyfikowanymi organizmami;

• wykorzystanie GMO w medycynie;

Metody wykrywania mutacji

• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms);

• SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism);

• ASO (Allele Specific Oligonucleotide hybridization);

• heterodupleksy: HA (lub HET = Heteroduplex Analysis, CMC = Chemical Mismatch Cleavage);

• DGGE ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis);

• mikromacierze DNA ( oligonukleotydowe, cDNA);

• Southern Blot (Southern Blotting);

• Western Blot (Western Blotting);

• Northern Blot (Northern Blotting);

Komórki macierzyste

• komórki totipotentne, pluripotentne, multipotentne, unipotentne, embrionalne komórki macierzyste, somatyczne komórki macierzyste, nisze komórek macierzystych, kliniczne zastosowania komórek macierzystych;

Terapia genowa

• podaż genu terapeutycznego, wektory - wirusowe i syntetyczne, strategie ex vivo i in vivo, komplementacja defektu genetycznego, hamowanie ekspresji zmutowanego genu, korekta zmutowanego genu, antysensy, rybozymy, siRNAs, naprawa mutacji z udziałem oligonukleotydów/fragmentów DNA, eliminacja niepożądanych komórek (metody eliminacji bezpośredniej i pośredniej), modyfikacja genetyczna komórek; kliniczne zastosowania terapii genowej.

Poziomy komunikacji międzykomórkowej

• ligand, receptor, receptory błonowe, białka G, transbłonowe receptorowe kinazy treoninowe, receptory śródplazmatyczne, wtórne przekaźniki (second messengers), czynniki transkrypcyjne, ścieżki sygnalizacyjne, autokrynia, parakrynia, endokrynia, justykrynia, crosstalk;

Ścieżka sygnalizacyjna Wnt/WNT

• Lrp 5/6, Axin, Apc, Gsk3, Frizzled, Tcf/Lef, Dsh = Dishevelled, Kremen1, Kremen2, Dkk, kanoniczna ścieżka Wnt i jej niekanoniczne warianty;

• FAP (ang. Familial Adenematous Polyposis Coli, rodzinna gruczolakowatość jelita grubego^*);

Ścieżka sygnalizacyjna Shh/SHH

• SHH (IHH, DHH, użyteczna wskazówka - wskazany w jednym z pytań testu blokowego Pointer Hedgehog = PHH nie istnieje - wyżeł to mój pies Z.P.), 25 kDa SHH-C, 20 kDa SHH-N, PATCHED, Smoothened, białka GLI, Dickkppfs, sFrps;

• nowotwory (PATCHED), polidaktylia (SHH, GLI2, GLI3, PATCHED);

Ścieżka sygnalizacyjna TGFβ

• BMPs, BMPR I, BMPR II, SMADs, SARA, HGS;

• nowotwory, nadciśnienie w zbiorniku płucnym (BMPR II);

Opracowanie: Zbigniew Pokora

8

* UWAGA - w stosunku do opisanych w sylabusie schorzeń/zespołów chorobowych obowiązuje wyłącznie znajomość ich podłoża dziedzicznego, ewentualnie molekularnego, jakość obrazu klinicznego nie będzie wymagana. Uwaga ta dotyczy wad rozwojowych i schorzeń genetycznych, które zostały zanaczone gwiazdkami, w przypadku schorzeń pasożytniczych (3 blok tematyczny) obowiązuje znajomość oznak/objawów w zakresie podstawowym.

from: http://genesandheredity.blogspot.com/2010/07/dna-genes.html

Warto pamiętać, że białka uczestniczące w wymaganych ścieżkach sygnalizacyjnych zostały opisane/zdefiniowane w sylabusie 1 bloku tematycznego.

Z.P.

Grudzień 2012

---