Dominika Szewczak

Agnieszka Troszczyńska

Biotechnologa II rok gr 3

Sprawozdanie

Cel ćwiczenia- zapoznanie się z metodą izolacji i identyfikacji plazmidów oraz wyizolowanie plazmidowego DNA z komórki bakteryjnej.

Plazmidy są to pozachromosomowe cząsteczki DNA występujące autonomicznie w cytoplazmie, zdolne do samodzielnej replikacji, niezależnej od chromosomu bakteryjnego.

Metodą izolacji plazmidowego DNA była liza alkaliczna. Metoda ta opiera się na denaturacyjnych właściwościach alkaliów (0,2 M NaOH) i jonowego detergentu (1% SDS). Metoda ta pozwala na uzyskanie w szybkim czasie czystego materiału, który może potem zostać użyty do dalszych analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania.

Pierwszym krokiem postępowania było zwirowanie 24 godzinnej hodowli bakteryjnej, którą w naszym przypadku była to hodowla Pseudomonas CF600. Następnie otrzymany osad zawieszono w buforze L1(Glukoza/Tris-HCl/EDTA).

• glukoza zapewnia odpowiednie ciśnienie osmotyczne w roztworze,

• Tris-HCl utrzymuje stałe pH (ok. 8),

• EDTA  jest związkiem chelatującym jony dwuwartościowe.

Roztwór rozpipetowano i dodano buforu L2. Zawarty NaOH w buforze L2 spowodował, że środowisko stało się zasadowe i DNA łatwo uległo denaturacji, a zawarty SDS w buforze wpłynął na oddysocjowania białek. Po pięciominutowej inkubacji dodano bufor L3. Dzięki zawartemu w nim octanowi potasu zaszła ponowna zmiana pH, tym razem na pH neutralne. Konsekwencją była renaturacja DNA plazmidowego, które renaturuje szybko ze względu na swoją kolistą budowę, a DNA chromosomowe nadal pozostało zdenaturowane, ponieważ renaturuje wolniej. Efektem procesu jest otrzymanie  interesującego nas DNA plazmidowego w roztworze, zaś DNA genomowy oraz białka i wszelkie inne zanieczyszczenia znajdują się w osadzie.

Kolejnym etapem był proces elektroforezy plazmidowego DNA w żelu agarowym. Technika ta pozwala na rozdział kwasów nukleinowych w żelu agarozowym. Elektroforeza polega na ruchu fazy rozproszonej względem fazy rozpraszającej zachodzącym pod wpływem przyłożonej zewnętrznej różnicy potencjałów elektrycznych. DNA jako anion wędruje w polu elektrycznym w kierunku elektrody dodatniej. Szybkość wędrówki w buforze zależy od: przyłożonego napięcia, stężenia żelu, kształtu cząsteczki i jej wielkości. Efektem elektroforezy są przedstawione poniżej elektroforegramy:

1. dla żelu I

2. dla żelu II

Wyniki:

Czynniki mające wpływa na ruchliwość elektroforetyczną miały znaczny wpływa na uzyskane przez nas wyniki. Biorąc pod uwagę wielkość naszego plazmidu należącego do szczepu Pseudomonas CF600 który jest plazmidem pVI150 czyli tzn. megaplazmidem możemy stwierdzić że większe plazmidy poruszają się wolniej. Dlatego jest on oddalony najmniej od miejsca zaaplikowania w stosunku do innych prób. Dodatkowo jest plazmidem degradacyjnym co oznacza, że koduje on białka pozwalające komórce gospodarza metabolizować związki fenolu i jego pochodne. Innymi czynnikami są: kształt cząsteczki, ładunek cząsteczki.

---