INŻYNIERIA GENETYCZNA

Temat: IZOLACJA DNA ROŚLINNEGO METODĄ MIKRO C-TAB

Zagadnienia:

• Etapy izolacji DNA z materiału roślinnego

• Rola CTAB w izolacji DNA

Głównym utrudnieniem podczas izolacji DNA z tkanek roślinnych jest obecność polisacharydów,

będących inhibitorami wielu enzymów stosowanych w pracach z DNA. Standardowe metody oczyszczania, takie jak: ekstrakcja fenolem, wytrącanie alkoholem, nie usuwają polisacharydów z roztworu DNA. Dla tkanek roślinnych opracowano specjalne procedury izolacji DNA oparte na działaniu CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) - bromku cetylotrimetyloaminowego. CTAB jest detergentem, który degraduje białka i błony komórkowe, a ponadto umożliwia oddzielenie DNA od polisacharydów. W obecności wysokiego stężenia NaCl (ponad 0,7M) CTAB tworzy kompleksy z DNA, które utrzymują się w roztworze. Po obniżeniu stężenia NaCl (poniżej 0,4 M) kompleksy CTAB/DNA ulegają wytrąceniu tworząc zawiesinę. Jej odwirowanie umożliwia oddzielenie kompleksów DNA/CTAB (osad) od polisacharydów (roztwór).

Przed przystąpieniem do pracy:

• Do buforu CTAB dodać β-merkaptoetanolu (do 1 ml buforu dodać 2μl β-merkaptoetanolu)

• Bufor ogrzać w termobloku do temp. 60^OC

• Etanol umieścić w zamrażarce w -20^OC

DZIEŃ I

1. Odważyć 0,2 g świeżej (lub zamrożonej) tkanki liściowej

2. Liście przełożyć do schłodzonego, sterylnego moździerza, zalać ciekłym azotem i utrzeć na proszek. Zanurzyć szpatułkę w ciekłym azocie w celu schłodzenia.

3. Proszek przełożyć za pomocą szpatułki do eppendorfa i zalać 1 ml ogrzanego buforu CTAB. Delikatnie wymieszać góra-dół.

4. Inkubować w 60°C przez 30 minut, delikatnie mieszając góra-dół co 10 minut

5. Do próbek dodać 600µl roztworu chloroform-alkohol izoamylowy (24:1), delikatnie wymieszać góra-dół (można przetrzymać próbki 15-30 min w lodówce)

6. Wirować 10-20 min,4 °C ,15000 obr.

7. Zdjąć za pomocą pipety fazę górną do nowego eppendorfa (około 600 µl)

8. Do zebranej fazy górnej dodać 500 µl roztworu chloroform-alkohol izoamylowy (24:1), delikatnie wymieszać góra-dół

9. Wirować 10 min,4 °C ,15000 obr.

10. Zdjąć za pomocą pipety fazę górną (około 600 µl) i szybkim ruchem wlać do eppendorfa ze schłodzonym 96% etanolem. Delikatnie wymieszać odwracając probówkę. Na tym etapie następuje wytrącanie DNA. DNA powinno być widoczne w postaci białego kłaczka.

11. Próbkę pozostawić w -20°C na noc.

DZIEŃ II

12. Próbkę wirować 10 min,4 °C ,15000 obr.

13. Zdjąć supernatant, osad przemyć 1 ml 70% etanolu

14. Wirować 3 min,4 °C ,15000 obr.

15. Powtórzyć punkty 13 i 14 jeszcze raz

16. Wysuszyć osad na powietrzu w temp. pokojowej przez 30 minut (lub 5-10 min w 37°C). Idealny osad powinien być bezbarwny i opalizujący.

17. Osad rozpuścić w 100 µl buforu TE w 50°C przez 15 min. (lub w 4 °C przez noc)

18. Połowę roztworu zamrozić. Do drugiej połowy dodać 1 µl RNazy (10mg/ml) i inkubować w 37°C przez 45 min. Preparat przechowywać w -20°C

19. Na żel 1% nanosić 20μl wyizolowanego DNA + 4 μl buforu obciążającego. Elektroforezę prowadzić przy 90V przez 20 minut (można później zwiększyć napięcie do 120V).

1

---