Laboratorium V biologia, z góry, Rok II, Fizjologia roślin

ĆWICZENIE 5

Wybrane zagadnienia z fizjologii roślin

Literatura zalecana:

Solomon, Berg, Martin, Ville. 2000. Biologia. MULTIKO Warszawa:

Czubaj A. (red.) 1999. Biologia. PWRiL Warszawa

Pytania i zagadnienia:

Na czym polega plazmoliza i deplazmoliza? Co ja powoduje? Etapy rozwoju rośliny. Budowa nasienia rośliny okrytozalążkowej. Wpływ czynników środowiska na kiełkowanie oraz na zachowanie przez nasiona zdolności do kiełkowania. Oddychanie tlenowe: etapy i ich efekt energetyczny (bez szczegółowego przebiegu). Barwniki występujące w chloroplastach i ich budowa chemiczna. Od jakich czynników środowiska zależy zawartość chlorofilu w roślinie? Co to jest feofityna? Etapy fotosyntezy: lokalizacja w komórce roślinnej i ich efekt (bez szczegółowego przebiegu). Zależność intensywności fotosyntezy od czynników środowiska.

ZADANIA

1. Obserwacja plazmolizy i deplazmolizy w komórkach skórki z łuski spichrzowej cebuli

zwyczajnej (Allium cepa)*

Plazmoliza polega na odwodnieniu wakuoli i cytoplazmy, i w konsekwencji kurczeniu się protoplastu, na skutek umieszczenia komórki w roztworze hipertonicznym (o stężeniu soli większym niż w soku komórkowym). Deplazmoliza jest zjawiskiem odwrotnym i zachodzi wówczas, gdy splazmolizowana komórka znajdzie się w roztworze hipotonicznym (o stężeniu soli mniejszym niż w soku komórkowym). Wówczas woda wnika do komórki i przywraca pierwotny stan cytoplazmy i wakuoli, oraz ciśnienie wewnątrz komórki (turgor). Oba opisane zjawiska są efektem procesu osmozy. Osmoza polega na przechodzeniu wody przez błonę półprzepuszczalną z roztworu o mniejszym stężeniu do roztworu o większym stężeniu związku osmotycznie czynnego (np. soli NaCl).

Wykonanie:

Wykonaj preparat przyżyciowy z zabarwionej wodnym roztworem czerwieni obojętnej skórki z łuski spichrzowej cebuli. W tym celu kawałek zabarwionej skórki (ok. 1 cm²) umieść w kropli roztworu fizjologicznego i przykryj szkiełkiem nakrywkowym
Obserwuj wykonany preparat używając obiektywów o powiększeniach: 10x - 40x
Wykonaj rysunek kilku sąsiednich komórek zaznaczając:

ścianę komórkową,
cytoplazmę (tworzy cienką ziarnistą warstewkę przylegającą do ściany komórkowej),
wodniczkę (jest duża, centralnie położona oraz zabarwiona czerwienią obojętną i przez to wyraźnie oddzielona od cytoplazmy),
jądro komórkowe,
jąderko (mogą być dwa).

Wykonaj drugi preparat z zabarwionej skórki, ale tym razem umieść ją w 10 %
roztworze NaCl
Obserwuj proces plazmolizy
Wykonaj rysunek kilku splazmolizowanych komórek. Zwróć uwagę na odstawanie cytoplazmy od ściany komórkowej, oraz na widoczne w splazmolizowanej komórce cienkie nitki cytoplazmy łączące się ze ścianą komórkową i z podobnymi nitkami w sąsiedniej komórce. Dzięki tym połączeniom wszystkie komórki budujące roślinę tworzą fizycznie jedną całość.
Wykonaj trzeci preparat umieszczając skórkę z poprzedniego preparatu (drugiego) w wodzie wodociągowej
Obserwuj proces deplazmolizy

Pytania:

Czy błona cytoplazmatyczna (plazmalemma) i błona otaczająca wakuolę (tonoplast), są błonami półprzepuszczalnymi ? Uzasadnij na podstawie obserwacji

Czy ściana komórkowa ma właściwości błony półprzepuszczalnej ? Uzasadnij

Jakie znaczenie biologiczne może mieć zjawisko osmozy ?

Dlaczego jądro komórkowe stało się gorzej widoczne po zadziałaniu roztworu soli ?

Dlaczego w obserwowanych komórkach roślinnych nie ma chloroplastów ?

*Cebula pospolita jest rośliną jednoliścienną z rodziny czosnkowatych. W sensie ogólnym nazwa „cebula” odnosi się do podziemnego pędu, który pełni funkcję spichrzową i przetrwalnikową. Cebula pospolita jako warzywo jest właśnie takim przekształconym pędem, o bardzo skróconej łodydze (tzw. piętce) i mięsistych liściach, a właściwie pochwach liściowych, o charakterystycznym smaku i zapachu.

2. Wpływ temperatury na kiełkowanie

Wyróżnia się 3 kardynalne punkty termiczne dla procesu kiełkowania: temperaturę minimalną, optymalną i maksymalną. Temperatura kiełkowania zależy od gatunku i jest związana z jego pochodzeniem. Nasiona większości gatunków kiełkują w temperaturze 15-30°C (optymalna). Optimum temperatury może podlegać wahaniom w trakcie kiełkowania. Dla roślin klimatu umiarkowanego jest ono na ogół niższe w pierwszej fazie kiełkowania niż w kolejnych. Minimalna temperatura kiełkowania jest zbliżona do 0°C.

Wykonanie:

Płytki Petriego (9) wysłać ligniną. Ligninę zwilżyć wodą destylowaną. Po trzy płytki opisać temperaturami inkubacji: 4°C, 25°C, 40°C.
Przygotować po trzy porcje po 10 nasion: ogórka, rzepaku i pszenicy. Nasiona każdego gatunku posiać na 3 płytki przeznaczone do inkubacji w różnych temperaturach.
Płytki inkubować przez tydzień w wymienionych wyżej temperaturach.
Po tygodniu policzyć nasiona, które wykiełkowały oraz zmierzyć długości korzenia. Dla każdego gatunku i każdej temperatury obliczyć procent nasion kiełkujących oraz średnią długość korzenia.
Wyniki zestawić w tabelach. We wnioskach określić wpływ temperatury na procent nasion kiełkujących oraz długość korzenia u różnych gatunków roślin.

Tab. Wpływ temperatury na kiełkowanie nasion

gatunek rośliny	procent nasion kiełkujących w różnych temperaturach
gatunek rośliny		4°C	25°C	40°C
ogórek
rzepak
pszenica

Tab. Wpływ temperatury na długość siewek korzenia

gatunek rośliny	średnia długość korzenia [mm] w różnych temperaturach
gatunek rośliny		4°C	25°C	40°C
ogórek
rzepak
pszenica

Wnioski:

.......................................................................................................................................................

3. Określenie intesywności oddychania roślin wyższych (nasiona grochu) poprzez oznaczanie ilości wydzielonego dwutlenku węgla

Do 2 kolbek Erlenmayera o pojemności 250 cm³ wprowadzić po 50 cm³ 0,02 N Ca(OH)₂ i natychmiast zamknąć korkiem.
W jednej przeprowadzone będzie doświadczenie, a drugiej tylko próba odczynnikowa. Następnie do woreczka z gazą włożyć 15 g kiełkujących nasion grochu i umieścić woreczek w jednej z kolb. Trzymając koniec woreczka zamknąć kolbę korkiem tak, aby woreczek zawisnął nad powierzchnią wodorotlenku wapnia.
Czas wiązania dwutlenku węgla przez wodorotlenek baru powinien wynosić 30 minut. Osad węglanu wapnia wytrąca się w reakcji:
Ca(OH)₂ + CO₂ = CaCO₃↓ + H₂O
Następnie należy zmiareczkować powstałą zawiesinę 0,02 N kwasem szczawiowym wobec fenoloftaleiny:
COOH COO\
Ca(OH)₂ + │ = │ Ca↓ + 2H₂O
COOH COO⁄
W trakcie doświadczenia zachodzącego w pierwszej kolbie przeprowadzić próbę odczynnikową w kolbie drugiej - zmiareczkować 50 cm³ wody wapiennej kwasem szczawiowym (wartość A).
Po upływie 30 minut oznaczyć ilość CO₂ w pierwszej kolbie (wartość B).

Ilość wydzielonego przez nasiona CO₂ w badanej próbie oblicza się z różnicy cm³ zużytego do miareczkowania kwasu szczawiowego (A-B). Różnica ta wyraża równoważną ilość ml 0,02 N kwasu węglowego związanego przez Ca(OH)₂ w CaCO₃. Ze względu na to, że 1 ml 0,02 N kwasu szczawiowego odpowiada 0,44 mg CO₂, obliczyć ilość wydzielanego CO₂ na 1g masy nasion na 1 godzinę. Wyniki podać w tabeli:

Masa nasion [g]

Miareczkowanie A [ml]

Miareczkowanie B [ml]

Różnica

(A-B) [ml]

Natężenie oddychania mg CO₂ (z 1g nasion)/godz.

4. Rozdzielanie barwników metodą Krause'a

Zasada metody: Chlorofile oraz karoteny lepiej rozpuszczają się w benzynie, ksantofile w etanolu. Zastosowanie tych dwóch nie mieszających się ze sobą rozpuszczalników pozwala na oddzielenie ksantofili od pozostałych barwników.

Materiały: mrożone liście kilku gatunków roślin, moździerz z pistlą, lejek, sączek bibułowy, rozdzielacz, cylinder miarowy, kolba Erlenmayera, probówki chemiczne, 96% etanol, piasek kwarcowy, benzyna

Wykonanie:

Zwilżony kilkoma kroplami etanolu materiał roślinny rozetrzeć dokładnie w moździerzu z dodatkiem niewielkiej ilości piasku.
Dodać 8-10 cm³ etanolu.
Wymieszać i przesączyć przez sączek bibułowy do kolby Erlenmayera. 5 cm³ przesączu zawierającego barwniki chloroplastów przenieść do rozdzielacza.
Dodać 10 cm³ benzyny i 2 krople wody (zgromadzi się między benzyną i etanolem rozdzielając frakcje).
Wytrząsać 5 minut, następnie rozdzielacz zostawić do czasu rozdziału frakcji.
Zaobserwować dwie warstwy barwników, które następnie zlać do oddzielnych probówek.

5. Rozdział barwników metodą chromatografii bibułowej

Zasada metody: Chromatografia jest techniką rozdziału mieszanin substancji na poszczególne składniki dzięki różnicom ruchliwości tych składników na granicy dwóch faz: ruchomej i stacjonarnej. W chromatografii bibułowej fazą stacjonarną jest odpowiednio spreparowana bibuła. W pobliżu jej krawędzi nanosi się rozdzielaną mieszaninę substancji (start) zanurzając następnie tą krawędź w mieszanie rozwijającej (faza ruchoma). Bibuła stopniowo nasiąka mieszaniną rozwijającą. Rozdzielane substancje różnią się rozpuszczalnością w mieszaninie rozwijającej. Najszybciej przesuwa się wraz z czołem mieszaniny substancja najlepiej w niej rozpuszczalna, najwolniej - najgorzej rozpuszczalna.

Materiały: ekstrakt alkoholowy barwników chloroplastów, bibuła Whatman 1 o wymiarach 3 • 30 cm, cylinder o pojemności 100 cm³, suszarka, mieszanina benzenu i benzyny w stosunku 1:1

Wykonanie:

1,5 cm od krawędzi bibuły zaznaczyć ołówkiem linię startu.
Na linię nanieść kilkakrotnie kapilarą ekstrakt barwników susząc każdorazowo bibułę suszarką.
Gdy pasmo barwników osiągnie intensywnie zielony kolor bibułę umieścić w cylindrze (komora chromatograficzna) zawierającym mieszaninę rozwijającą linią startu w dół.
Bibuła powinna być zanurzona w mieszaninie rozwijającej na głębokość ok. 5 mm.
Cylinder przykryć szkiełkiem zegarkowymi i obserwować rozdział barwników.
Pasmo karotenów będzie wędrować niemal równocześnie z frontem mieszaniny rozwijającej, nieco wolniej ksantofile, następnie chlorofil a i b (chlorofil b najwolniej).

6. Ilościowe oznaczanie chlorofilu według metody Arnona

Materiały: mrożone liście, sączki bibułowe, lejki, pipety, probówki miarowe, lejki Büchnera, pompa wodna, aceton

Wykonanie:

1 g mrożonych liści pociąć w drobne kawałki, a następnie rozetrzeć w moździerzu z niewielką ilością piasku kwarcowego.
Dodawać stopniowo aceton do objętości 10-20 cm³.
Po dokładnym roztarciu liści homogenat przesączyć przez filtr bibułowy do osłoniętej folią aluminiową kolby miarowej.
Moździerz i materiał na sączku przemywać kilkoma cm³ acetonu do całkowitego odbarwienia.
Objętość przesączu uzupełnić do acetonem do 100 cm³ i dokładnie wymieszać.
Odczytać na spektrofotometrze ekstynkcję wobec acetonu przy długości fali 645 i 663 nm.
Stężenia chlorofilu a, b (a+b) obliczyć w oparciu o wzory Arnona:

chlorofil a:

12,7 A663-2,7A645•100 [mg•g^-1 świeżej masy]

chlorofil b:

22,9A645-4,67A663 [mg•g^-1 świeżej masy]

chlorofil (a+b): 20,3A645+8,02A663 [mg•g^-1 świeżej masy]

Wyniki:

A663=.......................................................

A645=.......................................................

zawartość chlorofilu a = .......................................................

zawartość chlorofilu b = .......................................................

zawartość chlorofilu (a+b) = .......................................................

7. Fluorescencja chlorofilu

Chlorofil najsilniej pochłania promieniowanie niebieskie i czerwone (maksima adsorpcji chlorofilu a 430 i 660 nm, chlorofilu b 455 i 640 nm. Adsorpcja energii przez cząsteczkę chlorofilu powoduje jej wzbudzenie. Jeden z elektronów barwnika przechodzi z orbitalu podstawowego na orbital o wyższym poziomie energetycznym. W przypadku adsorpcji promieniowania niebieskiego stan wzbudzenia chlorofilu jest nietrwały. Elektron przechodzi na niższy stan wzbudzenia odpowiadający adsorpcji promieniowania czerwonego. Energia wzbudzenia na tym poziomie może opuścić cząsteczkę m. in. poprzez fluorescencję. Elektron wracając do stanu podstawowego emituje kwant promieniowania o energii mniejszej niż energia stanu wzbudzenia. Dlatego barwa promieniowania fluorescencyjnego chlorofilu ma zawsze barwę czerwoną (około 680 nm), niezależnie od rodzaju promieniowania, które spowodowało przejście chlorofilu w stan wzbudzony.

Wykonanie:

Acetonowy albo alkoholowy wyciąg barwników chloroplastowych wlać do probówki.
Wyciąg obejrzeć w świetle naturalnym.
Wyciąg naświetlić lampą UV, zaobserwować fluorescencję chlorofilu i jego barwę.
Zanotować wynik (zabarwienie w świetle naturalnym i UV), we wnioskach wyjaśnić przyczynę różnicy barw.

Wynik obserwacji:

.......................................................................................................................................................

Wnioski:

.......................................................................................................................................................

8. Właściwości chemiczne chlorofilu

Chlorofil jest estrem kwasu dikarboksylowego, chlorofiliny i dwóch alkoholi, fitonu i metanolu. Chlorofilina jest magnezoporfiryną zbudowaną z czterech pierścieni pirolowych, których atomy azotu wiążą kation magnezu. Pod wpływem kwasu zostaje on zastąpiony dwoma protonami. Powstaje wówczas feofityna, która pod wpływem światła reaguje inaczej niż chlorofil. Zastąpienie protonów kationami Cu, Zn lub Fe powoduje częściowe przywrócenie właściwości chlorofilu. W środowisku zasadowym chlorofil, jako ester, ulega zmydleniu z wydzieleniem fitolu i metanolu. Powstaje sól chlorofiliny, która pod wpływem światła reaguje jak chlorofil, różni się natomiast rozpuszczalnością w etanolu i w benzynie.

Wykonanie:

Do 2 probówek wlać po ok. 1 cm³ alkoholowego wyciągu barwników chloroplastowych.
Do pierwszej z probówek dodać kilka kropel 20% roztworu HCl i ostrożnie wymieszać. Sprawdzić barwę roztworu w świetle naturalnym i zdolność jego fluorescencji pod wpływem promieni UV.
Do tej samej probówki dodać ok. 1 cm³ 1% roztworu Cu(CH₃COO)₂.
Sprawdzić barwę roztworu w świetle naturalnym i jego fluorescencję.
Do 2 probówki z wyciągiem barwników wlać kilka kropel 20% roztworu NaOH. Ostrożnie zamieszać.
Sprawdzić barwę roztworu w świetle naturalnym i zdolność jego fluorescencji pod wpływem promieni UV.
Wyniki obserwacji zestawić w tabeli.

badana próbka	barwa roztworu	fluorescencja
wyciąg barwników
wyciąg barwników + HCl → feofityna
feofityna + Cu⁺² → miedzioporfiryna
wyciąg + NaOH