Izolacja plazmidowego DNA z E. Coli metodą Maxi „prep”
Odczynnik I : 0,9 g glukozy
2,5 ml 1 M ?
2 ml 0,5 M EDTA
Dopełnić wodą do 100 ml
Odczynnik II : 17,6 ml wody
400 ụl 10 M NaOH
2 ml 10% SDS
(w tej kolejności)
Inkubowano bakteryjną kulturę w 37 st C w 100 ml minimalnej pożywki LB z ampicyliną
Zawiesinę przelano do falkonów i wirowano 4000 rpm/ 10 min/0st C
Po wirowaniu odlano supernatant i dodano odczynnika I (50 ml) i zworteksowano i znowu wirowano (10 min w tych samych warunkach)
Odlewamy supernatant i zawieszamy w 4 ml odczynnika II
Dajemy na 5 min do temp 0 stC (lodówka lub lód)
Dodajemy 3 ml octanu potasu do całej zawartości falkonu
Inkubujemy 20 min w temp. 0 stC
Wirujemy przez 15 min
Przesączamy do nowych falkonów (na 15 ml) przez sączek i watę (sączek w lejek plus w środek wata) na końcu wydusić sączek
Dodajemy 0,6 objętości izopropanolu, mieszamy dlekatnie przewracając falkon i inkubujemy 10 min w temperaturze pokojowej
Nastepnie wyrównujemy wagowo zawartości i wirujemy przez 15 min prz 3500 rpm
Zewamy supernatant a osad zawieszamy w 150 ụl buforu TE (mieszamy pipetmanem) i przenosimy do ependorfa
Dodajemy 420 ụl octanu amonu i inkubujemy 15 minut w temperaturze pokojowej i wirujmy 10 min przy 14000 rpm (max wirówki)
Supernatant przenosimy do nowych ependorfów
Dodajemy 0,6 objętości izopropanolu mieszamy worteksem i inubujemy 10 minut w temperaturze pokojowej
Wirujemy 10 min-14000 rpm
Odlewamy supernatant i zawieszamy osad w 200 ụl buforu TE (zlewaliśmy z 2 ependorfów do jednego żeby zagęścic )
Dodajemy 10 ụl RNAzy (10 mg/ml)
Inkubujemy 20 minut w temperaturze pokojowej
Dodajemy taką samą objętośc mieszaniny fenol-chloroform(1:1)(zbieramy dolną warstwę mieszaniny) Mieszanina ta jest w ciemnym miejscu pod wyciągiem, worteksujemy i wirujemy na wolnym rozruchu na wirówce
Odciągamy górną warstwę do nowego ependorfa uważając aby nie pobrac dolnej!!
Mierzymy objętośc pipetą i dodajemy 1/10 objętości octanu sodu i 2,5 objętosci 96% zimnego etanolu (pamiętamy zę ependorfy są na 1,5 ml więc możemy dodac mniej etanolu np. 1 ml)
Inkubujemy 20 minut w temp. -70 oC
Wirjemy 10 min/14000 rpm
Odlewamy supernatant i zawieszamy w 500 ụl 70% zimnego etanolu (jak nie ma to trzeba sporządzic), nie worteksujemy
Wirujemy 2 min/14000 rpm
Wylewamy supernatant, oby lepiej go usunąc stusujemy short spin(krótkie wirowanie)
Suszymy osad w 37 oC 5 minut
Dodajemy 100 ụl buforu TAE (bufor do elektroforezy)
Nanosimy na żel: Leader (barwnik niebieski) 6 ụl
Roztwór DNA 2 ụl (najpierw na parafilm nanosimy Leadera a nastepnie
DNA i mieszam psem i pobieramy 8 ụl i dajemy do kieszonki w żelu)
Elektroforeza : 100V przez około 40 min i oglądamy po UV
Info: żel do elektroforezy 0,8%, przygotowac 50 ml (0,4 g agarozu rozpuścic w buforze TAE 1 krotnym i dodac 3 ụ bromku etydyny, przygotowac w mikrofalówce)