Etapy izolacji DNA

• Izolacja DNA jest wstępnym i

podstawowym etapem w wielu
procedurach stosowanych w biologii
molekularnej, mającym zawsze
krytyczne znaczenie dla ich dalszego
przebiegu.

• Podstawowym celem jest uzyskanie

preparatu DNA o wysokiej czystości i
niskim stopniu degradacji.

• Wybór najwłaściwszej metody izolacji zależy

od:

1. Rodzaju analizowanego kwasu nukleinowego.
2. Organizmu z jakiego przeprowadzamy

izolację( zwierzęta, rośliny, bakterie, wirusy).

3. Rodzaju materiału z jakiego przeprowadzamy

izolację ( rodzaj tkanki, stopień przetworzenia,

organ).

4. Oczekiwanych rezultatów ( plon, czystość,

czas przeznaczony na oczyszczanie).

5. Docelowego przeznaczenia materiału ( PCR,

klonowanie, znakowanie, blotowanie, Real

Time- PCR, synteza cDNA).

Pierwszy etap izolacji DNA

• Pierwszym etapem jest fizyczne

zniszczenie struktury tkankowej i
komórkowej materiału biologicznego
tzw. homogenizacja. Często wykonuje
się to poprzez rozcieranie materiału
biologicznego w ciekłym azocie
( kryształki lodu niszczą ściany
komórkowe i inne struktury).

Drugi etap izolacji DNA

• Drugim etapem izolacji DNA jest

otworzenie komórek, z których otrzymuje
się DNA. Często idealna procedura lizy
komórek jest kompromisem między
metodą na tyle inwazyjną, by uszkodzić
materiał z którego dokonujemy izolacji i
jednocześnie na tyle delikatną by nie
zniszczyć materiału genetycznego
komórki.

• DNA w komórce występuje w różnych strukturach

otoczonych błoną ( jądro komórkowe,
mitochondria, chloroplasty). Ponadto jest
związane z różnymi białkami histonowymi i
niehistonowymi.

• Aby zniszczyć błony komórkowe i białka do

buforów ekstrakcyjnych dodaje się różne
detergenty: np. SDS (dodecylosiarczan sodu),
CTAB ( bromek heksadecylotrimetyloamoniowy),
izotiocyjanian guanidyny.

• Te detergenty umożliwiają też eliminację

enzymów nukleolitycznych, które mogłyby
zniszczyć uwolniony DNA.

Typowe procedury lizy komórkowej

składają się z etapów zawierających:

• Mechaniczne uszkodzenia (np.

ucieranie, liza hipotoniczna)

• Traktowanie chemiczne (np.. Liza

detergentem, sole chaotropowe,
redukcja tiolowa)

• Trawienie enzymatyczne (np.

proteinaza K)

• Z pewnego typu materiałem etap ten

jest łatwy: homogenizowaną próbkę
komórek zwierzęcych otwiera się po
prostu przez dodanie detergentu
takiego jak SDS czyli dodecylosiarczan
sodu, który rozbija błony komórkowe,
uwalniając zawartość komórki.

• Wszystkie błony biologiczne mają

podobną ogólną budowę i zawierają
cząsteczki tłuszczów i białek
utrzymujących się razem przez
oddziaływania niekowalencyjne.

• Cząsteczki

tłuszczów są
zorganizowane
w ciągłą,
podwójną
warstwę, w
której
„zawieszone”
są cząsteczki
białek.
Cząsteczki
tłuszczów
składają się z
hydrofilowych
głów i
hydrofobowyc
h końcówek-
ogonów.

• Detergent ma podobną budowę co warstwa

lipidowa, dzięki temu możliwe jest

wychwytywanie przez niego tłuszczów

wchodzących w skład błony komórkowej i

błony jądrowej.

• Komórki roślinne mają mocne ściany i

dlatego wymagają ostrzejszego
traktowania. Komórki te zwykle
najpierw zamraża się, a następnie
rozciera w moździerzu, co jest
najefektywniejszym sposobem
zniszczenia ich celulozowych ścian.

• Komórki bakteryjne np. Escherichia coli

można poddać lizie przez połączone
działanie enzymatyczne i chemiczne.
Używanym enzymem jest lizozym,
otrzymywany z białka jaja, który
rozrywa

Związki polimerowe bakteryjnej

ściany komórkowej, a składnikiem
chemicznym jest kwas
etylenodiaminotetraoctowy-EDTA.
Jest to związek chelatujący jony
magnezu i przez to zmniejsza
integralność błony komórkowej.
Rozerwanie błony komórkowej przez
dodanie następnie detergentu
powoduje rozpad komórki.

• Detergent zawarty jest w tzw. buforze

ekstrakcyjnym, w skład którego wchodzi
EDTA, który dzięki wiązaniu jonów
magnezu obniża aktywność DNazy, której
kofaktorem jest magnez. Oraz Tris/HCl,
który zapewnia roztworowi odpowiednią
pojemnosć buforową ( niskie lub wysokie
pH uszkadza DNA).

• Często w jednym etapie procedury rozrywa

się błony komórkowe i inaktywuje
wewnątrzkomórkowe nukleazy (jeden
roztwór zawiera detergent i silnie
chaotropowe sole inaktywujące enzymy).

• Detergent wiążąc tłuszcze i białka błony

komórkowej, umożliwia uwolnienie genomowego

DNA (rys 3). Od momentu rozerwania błony

komórkowej i błon otaczających organelle

rozpoczyna się etap OCZYSZCZANIA DNA.

Trzeci etap izolacji DNA

•

Kolejnym etapem jest usunięcie zdegradowanych
wcześniej elementów komórkowych. Do usunięcia:

1.

Białek stosuje się trawienie proteinazą K, oraz ekstrakcję
fenolem i chloroformem

2.

Lipidów wykorzystuje się ekstrakcję chloroformem,
wykonywaną bezpośrednio po działaniu fenolem, gdyż
chloroform oprócz białek i lipidów usuwa również resztki
fenolu.

3.

Polisacharydów wytrąca się DNA metodą CTAB.

4.

Polifenoli, które w postaci utlenionej tworzą wiązania
kowalencyjne z DNA, stosuje się PVP (poliwinylopirolidon)

5.

RNA stosuje się trawienie RNazą, lub wytrącanie z
wykorzystaniem LiCl.

Czwarty etap izolacji DNA

• Przedostatnim etapem jest oddzielenie

DNA od związków użytych w poprzednich
działaniach. Składniki takie jak detergenty,
sole czy inhibitory po spełnieniu swojej
funkcji muszą być dokładnie usunięte aby
DNA mógł być użyty później do badań np.
z enzymami restrykcyjnymi, kinazami czy
polimerazami.

• Aby to osiągnąć wytrąca się DNA w etanolu

lub izopropanolu dodając octan amonu lub
sodu by zwiększyć wydajność wytrącania.

Piąty etap izolacji DNA

• Ostatnim etapem jest przygotowanie

wyekstrahowanego DNA do przechowywania.

• DNA przechowywany jest w postaci roztworu

wodnego lub w buforach typu TE, zawierających Tris-

HCl odpowiadający za utrzymanie stałego pH

roztworu, EDTA wiążący kationy dwuwartościowe

magnezu, cynku, manganu, wapnia- chroni DNA przed

działaniem enzymów których jony te są kofaktorami.

• DNA w buforach TE należy przechowywać w

temperaturze +4°C lub -20°C.

• DNA można również przechowywać w 70% roztworze

etanolu w temperaturze pokojowej i dopiero przed

użyciem np. do PCR zalać go buforem.

Automatyczna izolacja DNA

• Skonstruowano również wiele

urządzeń do automatycznej
izolacji DNA tzw. ekstraktorów
DNA, które zawierają kilka
naczyń ekstrakcyjnych
umieszczonych na
wytrząsarce z kontrolowaną
temperaturą. Naczynia do
ekstrakcji zawierają otwór do
podawania odczynników
organicznych i alkoholu oraz
otwór spustowy na zużyte
odczynniki. DNA zbierany jest
na filtrach membranowych.

Rys. 5 Easy MAG aparat do
automatycznej izolacji kwasów
nukleinowych.

Zalety stosowania

ekstraktorów

• Zapewnienie jałowych warunków

pracy i sterowanie urządzenia
komputerem

• Znaczne skrócenie czasu trwania

izolacji

• Eliminacja konieczności pracy z

substancjami szkodliwymi (fenol,
chloroform)

Bibliografia

• R. Słomski „Przykłady analiz DNA”
• T. A. Brown „Genomy”
• J. Bradley „Genetyka medyczna”
• M. Somma „Analiza próbek

spożywczych na zawartość Genetycznie
Modyfikowanych Organizmów”

• www.molcell.amu.edu.pl