^{dr A. Ekiel}

PRELEKCJA 4

Gronkowce

Charakterystyka:

- Gram(+), tworzą skupiska groniaste

- katalazo-dodatnie

- nie wytwarzają przetrwalników

- nie wykazują ruchu

- głównie tlenowce ale mogą żyć jako względne beztlenowce

- halofity - tolerują zawartość 10% NaCl w podłożu

- występują na skórze i błonach śluzowych ludzi, innych ssaków i ptaków

- posiada kwasy tejchojowe w ścianie komórkowej (s. aureus - rybitolowy kw. Tejchojowy, S. epidermidis - glicerolowy kwas tejchojowy)

- w peptydoglikanie występują mostki pentaglicynowe przyłączone do tetrapeptydów związnych z kwasem muraminowym (mostki czynią gronkowce wrażliwymi na lizostafinę)

Flora bakteryjna skóry:

a) Propionibacterium:

- P. acnes

- P. granularis

- P. avium

b) Corynebacterium hofmanni

c) Staphylococcus:

- S. aureus

- S. epidermidis

- S. hominis

- S. saprophyticus

- S. capitis

Gronkowce koagulazo(+):

- Staphylococcus aureus

Gronkowce koagulazo(-):

- Staphylococcus epidermidis

- S. haemolyticus

- S. saprophyticus

- S. lugdunensis

- S. warnerii

- S. capitis

- S. hominis

- S. cohnii

- S. simulans

- S. auricularis

S. aureus - czynniki zjadliwości:

a) białko A:

- białko powierzchniowe kowalencyjnie związane z warstwą peptydoglikanu u 90% szczepów S. aureus

- wiąże region Fc immunoglobulin blokując opsonizację, nie blokując jednak aktywacji dopełniacza

b) polisacharydowa otoczka

c) inwazyny:

- enzymy ułatwiające penetrację

- hialuronidaza, fibrynolizyny, nukleazy, proteazy, ligaza, koagulaza, kolagenazy

d) hemolizyny:

- powodują lizę erytrocytów

e) leukocydyny:

- niszczy wielojądrzaste leukocyty i makrofagi

f) adhezyny

g) TSST-1

- egzotoksyna pirogenna odpowiedzialna za zespół wstrząsu toksycznego

h) eksfoliatyny:

- rozszczepiają warstwę ziarnistą skóry, co powoduje złuszczanie powierzchniowych warstw naskórka

- toksyny te są immunogenne

- 2 typy: jeden kodowany przez plazmid, drugi przez chromosom

i) enterotoksyny

- enterotoksyna-A - odpowiedzialna za gronkowcowe zatrucie pokarmowe (objawy: wymioty i biegunka), enterotoksyny B-F są podobne do enterotoksyny A

j) receptory wiążące glikoproteiny macierzy, fibronektynę, kolagen, lamininę, fibrynogen, sialoproteinę, witronektynę

k) czynnik skupienia komórek - CF

Podział egzotoksyn gronkowcowych:

1. egzotoksyny pirogenne:

- enterotoksyny

- TSST-1

→ działają jako superantygeny reagując nieswoiście zarówno z cząsteczkami MHC II makrofagów jak i z łańcuchem b receptora TCR limfocytów T; reakcja ta skutkuje masowym uwolnieniem cytokin do krwiobiegu, co może doprowadzić do wstrząsu

2. leukocydyna

3. toksyny eksfoliatywne (epidermolityczne)

Staphylococcus aureus:

- 30% zdrowych ludzi jest jego nosicielami

- składnik mikroflory fizjologicznej skóry (nozdrza, okolica okołoodbytnicza, linia graniczna między czołem a owłosioną skórą głowy)

- drogi przenoszenia: poprzez bezpośredni kontakt (ręce), rzadziej drogą powietrzną, na cząsteczkach kurzu

Postacie kliniczne pierwotnych chorób wywoływanych przez S. aureus:

1. Zakażenia skórne (ropny charakter, występuje miejscowa martwica):

a) liszajec:

- najczęściej wywołuje go typ fagowy 71 S. aureus (rzadziej: S. epidermidis i paciorkowce)

- bardzo zakaźne powierzchowne zakażenie

- występują różnej wielkości pęcherze zawierające przejrzysty lub żółtawy płyn, pokrywające się następnie strupami

- najczęściej na kończynach w miejscach urazów lub ukąszeń

b) zapalenie mieszków włosowych:

- ograniczona forma zakażenia skóry

- etiologia: S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa

c) czyrak

d) jęczmień:

- mały czyrak na brzegu powieki

e) ropnie i czyrak mnogi:

- mnogie, połączone ropnie obejmujące mieszki, gruczoły potowe i otaczającą tkankę

- najgroźniejsze - ryzyko bakteriemii

- najczęstsze na skórze szyi i karku

2. Zakażenia głębokie:

a) zapalenie szpiku i kości:

- S. aureus jest najczęstszym czynnikiem etiologicznym, szczególnie u dzieci

b) zapalenie płuc:

- w płucach powstają ropnie

- najczęściej u osłabionych pacjentów, jako powikłanie grypy lub po aspiracji ciała obcego

c) ostre zapalenie wsierdzia:

- występuje u narkomanów i po przeszczepach zastawek

- występuje miejscowy wzrost bakterii na zastawkach serca (w tzw. wegetacjach)

- wczesne zapalenie zastawek - najczęściej spowodowane przez S. epidermidis

- późne (po upływie 2 miesięcy) zapalenie - najczęściej przez Streptococcus viridans

d) zapalenie stawów

e) posocznica i ropnie narządów wewnętrznych

3. Choroby wywołane toksynami gronkowcowymi:

a) gronkowcowe zapalenie złuszczające skóry - SSSS:

- występuje najczęściej u dzieci poniżej 5 roku życia

- skórne objawy są spowodowane zakażeniem szczepem S. aureus wytwarzającym eksfoliatyny

- powstają liczne, duże pęcherze (w końcu pękające), oddalone od miejsca pierwotnego zakażenia

b) liszajec pęcherzowy:

- również wywołuje go toksyna eksfoliatywna wydzielana przez S. aureus

- lżejszy przebieg od SSSS, powstaje kilka dużych pęcherzy, które mogą pękać

c) płonica gronkowcowa:

- nie złuszczająca się rumieniowa wysypka - przypomina wysypkę płoniczą

- w przeciwieństwie do płonicy paciorkowcowej - język i podniebienie rzadko są zajęte w płonicy gronkowcowej

d) gronkowcowe zatrucia pokarmowe:

- gwałtowne wymioty i biegunka kilka godzin po spożyciu skażonego pożywienia (ciastka z kremem, mięso) zawierającego enterotoksyny gronkowcowe (głównie enterotoksynę A)

- enterotoksyny są oporne na ciepło i proteazy, żywe gronkowce nie są potrzebne, by powstały objawy

- zatrucie ustępuje 24-48 godzin przy odpowiednim nawodnieniu

e) TSS:

- zespół wstrząsu toksycznego

- choroba gorączkowa, która może doprowadzić do niewydolności narządów i śmierci

- objawy: wymioty, biegunka, rumieniowa wysypka na skórze, bóle mięśni, spadek RR

- głównym czynnikiem sprawczym jest toksyna TSST-1, ale TSS może wywołać każdego rodzaju egzotoksyna pirogenna

Występowanie w ludzkiej populacji:

20% - nosiciele S. aureus

60% - nosicielstwo okresowe (okresowa kolonizacja)

20% - osoby oporne na kolonizacje

Nosicielstwo/kolonizacja przez Staphylococcus aureus nie wymagają leczenia za wyjątkiem niektórych sytuacji zawodowych.

Walka z nosicielstwem musi być racjonalna i systematyczna, gdyż rekolonizacja po zaprzestaniu leczenia jest regułą.

Diagnostyka:

1. badanie mikroskopowe

2. hodowla:

- rosną szybko na podłożach wzbogaconych w warunkach tlenowych (w beztlenowych też)

- zdolność do wzrostu w warunkach hamujących wzrost innych bakterii (7,5% NaCl, 40% żółć)

- agar z krwią - przeznaczony do izolacji gronkowców z materiałów nie skażonych inną florą

- przy skażeniu materiału innymi bakteriami zalecane podłoża wybiórcze (czynnik warunkujący wybiórczość: 7-10 % NaCl, polimyksyna, 40% żółć)

- agar z solą i mannitolem jest wybiórczy i różnicujący dla poszczególnych gat. Staphylococcus

3. identyfikacja:

- test na koagulazę - enzym wytwarzany przez S. aureus, który aktywuje trombinę powodując natychmiastowe ścinanie kropli osocza

Leczenie:

- leczenie empiryczne: penicylinazooporne penicyliny (oksacylina, flukloksacylina) lub I generacja cefalosporyn

- wankomycyna - leczenie zakażeń MRSA

- u uczulonych na beta-laktamy - cefalosporyny, erytromycyna, klindamycyna

- większość szczepów oporna na penicylinę

Różnicowanie gronkowców:

Cecha	S. aureus	S. epidermidis	S. saprophyticus
Kolor kolonii	Żółty lub biały	biały	Biały lub bladopopielaty
Hemoliza	+	+/-	-
Wydzielanie koagulazy	tak	nie	nie
Fermentacja mannitolu	tak	nie	tak
Wrażliwość na bacytracynę	wrażliwy	wrażliwy	oporny

S. saprophyticus

- wywołuje zakażenia układu moczowego oraz zakażenia oportunistyczne.

S. epidermidis (rzadziej inne CNS):

- zakażenia odcewnikowe

- zakażenia związane ze stosowaniem biomateriałów (BAI - biomaterial associated infections)

"zakażenie gronkowcowe związane z polimerem" - zakażenie wszczepionych ciał obcych z polimeru.

Gronkowcowe zakażenia szpitalne:

- sepsa

- zapalenie wsierdzia

- zakażenia miejsca operowanego

- zapalenie kości i stawów

- zapalenie płuc

- pourazowe zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych

- ropnie wielonarządowe w wyniku krwiopochodnego wysiewu

- ropień sutka

- SSSS, TSS, zatrucia pokarmowe

CNS:

Postaci kliniczne zakażeń:

- bakteriemia

- zapalenie kości po wszczepie protezy stawowej

- infekcje OUN związane z zastosowaniem zastawki i odpływów PMR

- zakażenia po przeszczepie narządów

- czynnik etiologiczny 30% zakażeń noworodków na oddziałach intensywnej terapii

U osób z grup ryzyka należy go traktować jako istotny czynnik epidemiologiczny zakażenia:

54% - CNS

4% - MSSA

1% - MRSA

Kontaminacja biomateriału w momencie jego implantacji lub w następstwie przejściowej bakteriemii:

a) adhezja:

- odwracalna - zachodząca przy udziale sił fizycznych

- nieodwracalna - wynikająca z obecności adhezyn oraz wytwarzania śluzu integralnie związanego z komórką bakteryjną

b) formowanie biofilmu:

- biofilm - wielokomórkowa struktura (organizm bakteryjny) pokrywająca powierzchnię zasiedlonej tkanki lub biomateriału, dysponująca siecią przepływających sygnałów dla regulacji ekspresji genowej i różnicowania komórek

Dojrzewanie biofilmu:

- poprzez podziały komórek bakteryjnych oraz dołączanie komórek pochodzących z zewnątrz

System Quorum Sensing:

- działa jako system komunikacyjny przy dużym zagęszczeniu bakterii

- bakterie wytwarzają różnorodne czynniki sygnałowe

- zachodzi też komunikacja na linii bakteria-tkanka

CNS:

- śródkomórkowy antygen polisacharydowy PIA

- Ica A, D, C

- białko baA (?) - aktywność N-acetylotransferazy

Biofilm a patogenność:

a) chroni komórki bakteryjne przed mechanizmami obronnymi gospodarza:

- utrudnia fagocytozę

- ogranicza opsonizację

- zaburza chemotaksję

- ??

- zmniejsza penetrację przeciwciał

b) sprzyja przetrwaniu bakterii

c) stymuluje powstawanie nowych cech zjadliwości

d) sprzyja zwiększaniu stężenia bakterii w miejscu zakażenia

e) sprzyja przemieszczaniu się bakterii

Rodzaje oporności na antybiotyki beta-laktamowe:

a) oporność enzymatyczna - beta-laktamazy

b) oporność receptorowa - zmiany w strukturze PBP prowadzące do zmniejszenia lub utraty powinowactwa antybiotyków beta-laktamowych

PBP - białka będące miejscem docelowym dla penicylin i innych beta-laktamów (są to m.in. enzymy uczestniczące w budowie ściany komórkowej)

Badanie lekooporności gronkowców:

1. oznaczanie wytwarzana penicylinaz:

a) test cefinazowy:

- krążek z nitrocefiną

b) metoda dyfuzyjno-krążkowa:

- krążek z penicyliną (10 IU)

- w związku z wysokim odsetkiem szczepów wytwarzających penicylinazy (w niektórych ośrodkach nawet 90%) można pominąć rutynowe oznaczanie wrażliwości na penicylinę

2. określanie metycylinooporności:

a) metoda dyfuzyjno-krążkowa

- krążek z cefoksytyną (30 ug) lub krążek z oksacyliną (1 ug)

b) metoda przeglądowa z oksacyliną (dla S. aureus):

- podłoże MHA z oksacyliną w stężeniu 6 ug/ml i dodatkiem 4% NaCl

c) testy polegające na wykrywaniu białka PBP 2a - produktu genu mecA, warunkującego oporność na metycylinę

d) metody genetyczne - wykrywanie genu mecA - pozostają „złotym standardem”

3. identyfikacja i interpretacja kliniczna fenotypów oporności na linkosamidy, makrolidy i streptograminy B

a) metoda dwóch krążków:

- nakładamy krążki z erytromycyną i klindamycyną w odległości 15-26 mm od krawędzi krążków

4. badanie wrażliwości na glikopeptydy:

a) metoda dyfuzyjno-krążkowa (krążek z wankomycyną) oraz metoda przeglądowa z wankomycyną (BHIA z 6 ug/ml VA)

b) oznaczanie wartości MIC oraz metoda przeglądowa z wankomycyną (BHIA z 6 ug/ml VA)

c) metody referencyjne:

- metoda mikrorozcieńczeń w bulionie

- metoda rozcieńczeń w agarze

- Etest

MRSA:

- gronkowiec złocisty oporny na metycylinę

MSSA:

- gronkowiec złocisty wrażliwy na metycylinę

MRCNS:

- oporny na metycylinę gronkowiec koagulazo-ujemny

MSCNS:

- wrażliwy na metycylinę gronkowiec koagulazo-ujemny

HA-MRSA:

- szczepy MRSA izolowane z zakażeń szpitalnych

CA-MRSA:

- szczepy MRSA izolowane z zakażeń pozaszpitalnych

Metycylinooporność:

- szczepy gronkowców oporne na metycylinę (MRSA, MRSNS) są oporne in vivo na wszystkie antybiotyki beta-laktamowe (tj. penicyliny, penicyliny skojarzone z inhibitorami beta-laktamaz, cefalosporyny, karbapenemy).

CA-MRSA:

- nowym problemem diagnostycznym i epidemiologicznym jest pojawianie się szczepów MRSA w środowisku pozaszpitalnym czyli CA-MRSA

- szczepy te charakteryzują się heterogennym poziomem oporności na antybiotyki beta-laktamowe, co niesie z sobą ryzyko nierozpoznania tego mechanizmu w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej a co za tym idzie - niepowodzeń terapeutycznych

- szczepy CA-MRSA poza opornością na antybiotyki beta-laktamowe związaną z metycylinoopornością, są wrażliwe na różne antybiotyki innego typu, podczas gdy szczepy HA-MRSA są zwykle wielolekooporne

- w przeciwieństwie do HA-MRSA, większość szczepów CA-MRSA posiada gen leukocydyny Panton-Valentine (PVL - Panton-Valentine leucocidin)

- PVL należy do cytotoksyn powodujących martwicę tkanek i lizę leukocytów

- obecność w genomie CA-MRSA genów PVL uznaje się za marker informujący nas, że mamy do czynienia ze szczepem pozaszpitalnym odmiennym od klonów szpitalnych!!

CA-MRSA - klinika:

- najczęściej powodują pierwotne zakażenia skóry i tkanek miękkich oraz martwicze zapalenie płuc, któremu często towarzyszy bakteriamia

- w przeciwieństwie do HA-MRSA, zakażenia CA-MRSA występują u osób młodych i bez czynników ryzyka

- 75% przypadków martwiczego zapalenia płuc wywołanego przez CA-MRSA kończy się zgonem, średnia przeżywalność wynosi 4 dni, często jest ono wynikiem powikłań pogrypowych

Gronkowce skórne i koagulazo-ujemne szybciej nabierają oporności.

MRSA stanowi 10-25% gronkowców.

MRSA:

- dobrze zaadaptowane do przeżycia w warunkach szpitalnych, są bardzo łatwo przekazywane z pacjenta na pacjenta w obrębie oddziałów szpitalnych oraz pomiędzy szpitalami

- kolonizują osoby w wieku podeszłym oraz poważnie chore

- HaMRSA - Pol1 - najczęstszy

- HaMRSA - Pol2

Glikopeptydy - są skuteczne w leczeniu MRSA; zaburzają one syntezę ściany komórkowej bakterii

- wiążą się z warstwą peptydoglikanu a następnie swoiście z końcową amino-acylo-D-alanylo-D-alaniną rosnącego peptydoglikanu

Metycylinooporność:

- homogenna - wszystkie komórki są niewrażliwe

- heterogenna - 2/3 komórek jest niewrażliwych, ale reszta jest wrażliwa

VRSA:

- oporny na wankomycynę S. aureus

- mechanizm oporności polega na wytwarzaniu zmienionych prekursorów peptydoglikanu (D-Ala-...)

VISA:

- średnio wrażliwy na wankomycynę S. aureus

- polega na wiązaniu docelowego antybiotyku zanim osiągnie miejsce docelowego działania

hVISA:

- S. aureus średnio wrażliwy na wankomycynę, o heterogennej ekspresji oporności inaczej: S. aureus z obniżoną wrażliwością na wankomycynę

Zdarzają się pojedyncze przypadki VRSA u pacjentów z grup ryzyka (cukrzycą, niewydolnością nerek)

Nowe opcje terapeutyczne w leczeniu zalażeń o etiologii VRSA, VISA, VRSA :

- streptograminy (chinupristyna B, dalfopristyna A)

- linezolid

- telitromycyna (ketolidy)

- tigecyklina (glicylcykliny - pochodne minocykliny)

- daptomycyna - nowy lek z grupy lipopeptydów, do stosowania parenteralnego

Wskazania:

- leczenie powikłanych zakażeń skóry i tkanek miękkich, bakteriemii i infekcyjnego zapalenia wsierdzia wywołanego przez Staphylococcus spp. i Streptococcus spp. z wyjątkiem S. pneumoniae!

Oksazolidynony:

- chemioterapeutyki

- przedstawiciele: linezolid, eprezolid

- działają bakteriostatycznie

- ich mechanizm działania polega na hamowaniu syntezy białka na bardzo wczesnym etapie (kompleks inicjatorowy translacji w rybosomach bakteryjnych)

Lipopeptydy, glikopeptydy, glikolipidy:

- powodują depolaryzację błony cytoplazmatycznej i ucieczkę jonów potasu

Identyfikacja i interpretacja kliniczna fenotypów oporności na linkosamidy, makrolidy i streptograminy B - schemat algorytmu:

1. Szczepy wrażliwe na erytromycynę mogą być:

a) wrażliwe na linkomycynę/klindamycynę - nie stanowią one wtedy dużego problemu klinicznego

b) oporne na linkomycynę i na klindamycynę:

- taką oporność warunkuje L-fenotyp, mechanizm związany z genem oporności lin(A)

- w zakażeniach szczepami z tego rodzaju opornością nie należy stosować linkomycyny i klindamycyny!!

- przy wyniku wskazującym na L-fenotyp zaleca się powtórzenia badania w celu wykluczenia błędu

2. Szczepy oporne na erytromycynę mogą być:

a) oporne na linkomycynę i klindamycynę:

- taki fenotyp oporności określamy jako MLS b konstytutywny!!

- mechanizm oporności związany jest z genem erm

- w takich przypadkach nie powinno się stosować żadnych makrolidów, linkozamidów i streptogramin z grupy B!!

b) wrażliwe na linkomycynę i klindamycynę ze spłaszczeniem strefy zahamowania wzrostu:

- taki fenotyp odporności określamy jako MLSb indkukcyjny!!

- mechanizm oporności również związany z genem erm

- tu również nie powinno się stosować żadnych makrolidów, linkozamidów ani streptogramin grupy B!!

c) wrażliwe na linkomycynę i klindamycynę przy braku spłaszczenia strefy zahamowania wzrostu:

- ten fenotyp odporności określamy jako MSb

- mechanizm związny jest z genem msr(A)

- w takich przypadkach nie powinno się stosować makrolidów 14- i 15-węglowych ani streptogramin grupy B

Algorytm postępowania w przypadku oznaczania wrażliwości S. aureus na wankomycynę:

Rekomendowane testy:

1. metody automatyczne oraz przeglądowa z VA w podłożu (BHIA z 6 ug/ml VA) - możliwe wyniki:

a) VA MIC<2 ug/ml oraz brak wzrostu na płytce z VA:

-> wynik: VSSA

b) VA MIC<2 ug/ml oraz wzrost na płytce z VA nasuwa:

-> podejrzenie hVISA, VISA, VRSA

c) VA MIC>4 ug/ml oraz wzrost na płytce z VA również nasuwa:

-> podejrzenie hVISA, VISA, VRSA

2. metoda krążkowo-dyfuzyjna (mało wiarygodna w przypadku szczepów hVISA i VISA) oraz przeglądowa z VA w podłożu (BHIA z 6 ug/ml VA) - możliwe wyniki:

a) strefa dla VA > 14 mm oraz brak wzrostu na płytce z VA:

-> wynik: VSSA

b) strefa dla VA > 14 mm oraz wzrost na płytce z VA nasuwa:

-> podejrzenie hVISA, VISA, VRSA

c) strefa dla VA < 14 mm oraz wzrost na płytce z VA również nasuwa:

-> podejrzenie hVISA, VISA, VRSA

Za każdym razem, gdy wynik nasuwa podejrzeniu hVISA, VISA, VRSA należy:

- sprawdzić czystość hodowli

- potwierdzić identyfikację

- potwierdzić wartość MIC metodą referencyjną (metoda mikrorozcieńczeń w bulionie, rozcieńczeń w agarze, Etest - MHA 0,5 McFarlanda)

- zachować izolat, powiadomić zespół do spraw kontroli zakażeń

- wysłać izolat do laboratorium referencyjnego w celu potwierdzenia rozpoznania hVISA, VISA, VRSA

Barwienie metodą Grama - schemat:

1. fiolet krystaliczny

2. płukanie wodą

3. płyn Lugola

4. płukanie wodą

5. alkohol

6. płukanie wodą

7. fuksyna/safranina

6

---