PRELEKCJA 1

ZASADY BADANIA BAKTERIOLOGICZNEGO

Zasady pobierania materiału:

1. Czas pobierania: próbki pobrać przed rozpoczęciem leczenia środkami drobnoustrojowymi. Jeżeli przeprowadzamy badanie kontrolne po leczeniu, należy je wykonać co najmniej po 3 dniach od zakończenia podawania chemioterapeutyków.

2. Przygotowanie pola zabiegu: skórę w miejscu wkłucia, przy pobieraniu krwi, pmr i płynów z jam ciała, należy starannie odkazić preparatem jodowym i 70% alkoholem. W innych przypadkach oczyścić miejsce pobrania jałowym wacikiem zwilżonym jałowym roztworem NaCl.

3. Objętość próbki: odpowiednia ilość materiału do badania:

- krew, mocz, żółć ropa - 3-10ml

- pmr - 1-2ml

4. Sposób pobierania: Materiał muszą pobierać osoby wyszkolone, które powinny posługiwać się jasnym opisem każdej szczegółowej metody. Jeśli materiał pobiera sam chory (plwocina, mocz, kał) należy mu dostarczyć jasną instrukcję sposobu prawidłowego postępowania i unikani a zanieczyszczeń.

5. Transport: Jak najszybciej dostarczyć materiał do laboratorium. Jałowe szczelnie zamknięte pojemniki lub podłoża transportowe oraz termosy. Dokładne opisane.

Przy podejrzeniu zapalenia płuc luba zapalenia opon oprócz materiałów specyficznych zawsze pobieramy krew na posiew

Posiew moczu to posiew ilościowy, dla tego trzeba trzymać próbkę w niskiej temperaturze żeby bakterie nie namnożyły się przed badaniem ( chyba że używamy Uromedium - jest to podłoże, po wlaniu moczu dajemy do cieplarki)

Tab. Sposoby pobierania i transportu materiału do badania mikrobiologicznego

MATERIAŁ	SPOSÓB POBIERANIA	SPOSÓB TRANSPORTU	Temp.
Krew	Zdezynfekować miejsce wkłucia, 10-20ml, najlepiej wieczorem (szczyt gorączki). Przed antybiotykoterapią, lub na krótko przed kolejną dawką antybiotyku.	Posiew na podłoża płynne	35-37st C
PMR	Zdezynfekować miejsce nakłucia lędźwiowego, pobrać 1-2ml. Na hodowlę: posiew na podłoże od razu przy łóżku chorego	Szczelna jałowa probówka (penicylinówka), lub podłoże meningomedium. Badanie: ocena biochemiczna i pleocytozy	35-37st C
Mocz	Dokładnie obmyć miejsce ujścia cewki, strumień środkowy, po nocy, 3ml	Jałowy pojemnik transportowy lub uromedium	4st C
Kał	Z masy kałowej pobrac próbkę wielkości orzecha laskowego z 3 miejsc przede wszystkim zmienionych (krew, śluz, ropa) Jeśli stolec jest płynny 1-2ml	Jałowy pojemnik transportowy	pokojowa
Ropa	Do strzykawki lub na wymazówkę (głównie bawełniana, czasem nasączona węglem, aktywnym). Na szkiełko pierwszy wymaz (obecna dominująca bakteria i naciek leukocytów), drugi wymaz na podłoże transportowe. W starej ropie nie ma żywych bakterii!	Strzykawka z igłą wkłutą w jałowy gumowy korek, lub podłoże transportowe	Pokojowa
Plwocina	Wykrztuszać rano, przed śniadaniem, po przepłukaniu jamy ustnej przegotowaną wodą. Ciemny pojemnik, bo prątki gruźlicy są wrażliwe na UV. Mieszkanka lityczna by ułatwić odksztuszanie	Jałowy pojemnik o szerokiej szyjce	Pokojowa
Wymaz z gardła	Szpatułką uciskać język, a jałową wymazówką pobrać wydzielinę z tylnej ściany gardła oraz migdałków. Pacjent na czczo. Płukanie ust ciepłą wodą.	Podłoże transportowe	Pokojowa
Wymaz z noso-gardła	Po przez kanał nosowy wprowadzić do tylnej ściany gardła wymazówkę zawierającą alginian wapnia i wykonać ruch obrotowy	Podłoże transportowe	Pokojowa
Wymaz ze spojówek	Pierwsza wymazówka preparat bezpośredni, druga na hodowlę. Odwijamy górną tarczkę. Nie dotykamy rzęs.
Wymaz z ropnia otorbionego	- macamy żeby wyczuć torebkę - dezynfekcja skóry 3 razy (odpowiednie stężenie i czas) - nakłuwamy brzeg ropnia (tam są żywe bakterie) - aspiracja całej treści (od razu leczenie) - zawsze siejemy w kierunku tlenowych i beztlenowych bakterii - zabezpieczamy strzykawkę by nie dopuścić tlenu - jełki badanie nie od razu, to ropę dajemy na podłoże do krwi (trzeba opisać, także lokalizację ropania)

Przy podejrzeniu zakażenia bakteriami beztlenowymi należy przestrzegać specjalnych zaleceń, aby z dużym prawdopodobieństwem uzyskać hodowlę czynnika etiologicznego, unikając zanieczyszczeń florą fizjologiczną.

Tab: METODY POBIERANIA MATERIAŁU DO HODOWLI BAKTERII BEZTLENOWYCH

OUN	PMR głównie mętny, zawartość ropnia, bioptat tkanek
Tk. okołozębowe, uszy, nos, zatoki	Aspirat lub bioptat z ropni po odkażeniu powierzchni za pomocą PVP/jodu i alkoholu, aspiraty pobrane igłą i chirurgiczne
Dolne drogi oddechowe	Aspiraty przeztchawicze, punktaty przezskórne płuc, materiał z torakotomii i bronchoskopii (dwudrożny cewnik)
Jama brzuszna	Płyn z punkcji, materiał z ropni, z operacji, żółć (pod kontrolą USG, igła)
Drogi rodne	Laparoskopia, materiał z zabiegów chirurgicznych, materiał z macicy odessany po odkażeniu ujścia
Drogi moczowe	Nakłucie nadłonowe
Kości i stawy	Aspiraty z jam stawowych (przy ropnym zapaleniu stawów), aspiraty z przepłukiwania jam kostnych po zabiegach
Tk. miękkie	- rany otwarte: głęboka aspiracja lub biopsja z dna rany po starannym odkażeniu powierzchni za pomocą PVP/jodu i alkoholu - przetoki: aspiracja za pomocą strzykawki i małych plastykowych cewników po odkażeniu ujścia - głębokie ropnie, beztlenowe zakażenie tkanek, zakażenia na tle zaburzeń naczyniowych (niedokrwienie, stopa cukrzycowa), zgorzel gazowa: aspiracja igłą po odkażeniu powierzchni, próbki pobrane chirurgicznie, przepłukiwania, biopsja - odleżyny i inne zmiany powierzchniowe: staranne oczyszczenie pola odkażenie i aspiracja ropy z głębokich zachyłków lub głęboka biopsja tkanek brzegu zmiany

Metody wykrywania drobnoustrojów:

- bezpośrednie: bakterioskopia, hodowle (podłoże sztuczne dla bakterii, komórkowe dla wirusów ricetsi i chlamydii), badanie antygenem ii, badanie DNA, RNA

- pośrednie: badanie obecności swoistych przeciwciał

Bakterioskopia - wykazanie obecności bakterii, barwienie metodą grama, jeśli są dodatnie (niebieskie) jeśli są ujemne (czerwone).

Bakterie o prostych wymaganiach odżywczych do hodowli wymagają prostych podłoży o odpowiednim składzie soli i buforów, węgiel czerpią z cukrów i mleczanów, a azot z azotynów i amoniaku.

Bakterie o wysokich wymaganiach odżywczych wymagają dodatkowo witamin, puryn i pirymidyn

Podłoża

- Pożywki to płynne, półpłynne lub stałe mieszaniny różnych związków chemicznych, w których lub na których rozmnażają się bakterie

- podział ze względu na zawartość jest historyczny ( syntetyczny, półsyntetyczny i naturalny)

- obecnie dzielimy je ze względu na konsystencję

- kolonie powstają tylko na stałym podłożu

- podłoża dzielimy też ze względu na ilość/jakość składników:

• Proste (agar bulion zwykły)

• Wzbogacone (agar krwawy)

• Wybiórczo namnażające: są to pożywki, na których rośnie ograniczona ilość bakterii, a wzrost innych jest hamowany. Wykorzystywane są w nich cechy charakterystyczne szukanego szczepu: jeśli na przykład gatunek X rośnie przy wysokim stężeniu jakieś substancji, których dla innych gatunków jest śmiertelny, można zastosować pożywkę z daną substancją. W większości wypadków nie da się ograniczyć wzrostu tylko do jednego szczepu, można jednak znacznie zawęzić zakres.

• Wybiórczo różnicujące: są to podłoża, na których różnicuje się bakterie ze względu na ich metabolizm. Jeżeli jeden z gatunków wytwarza enzym, którego nie wytwarza inny szczep rosnący na danym podłożu, można je zróżnicować ze względu na obecność (lub brak) katalizowania reakcji przez ten enzym. Jeśli wyników reakcji nie widać gołym okiem, stosowany jest dodatkowo wskaźnik informujący o zajściu przemiany chemicznej. Bardzo często dane podłoże jest równocześnie pożywką wybiórczo-namnażającą.

• Specjalne

Identyfikacja

Po wyhodowaniu kolejnym etapem jest identyfikacja bakterii co do gatunku oraz określenie wrażliwości na antybiotyki

- wrażliwość badamy za pomocą metody krążkowo-dyfuzyjnej (krążki z antybiotykami o odpowiednim stężeniu)

Mikroflora powietrza

- Czas życia w powietrzu zależy od: gatunku, wilgotności, temperatury i nasłonecznienia

- saprofityczna mikroflora powietrza:

• ziarniaki Micrococcus, Sarcina wytwarzające barwniki, gronkowce białe, pałeczki Alcaligenes, tlenowe laseczki przetrwalnikujące Bacillus

- w pomieszczeniach zamkniętych i w powietrzu atmosferycznym:

• zarodniki grzybów strzępkowych Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Botritis, Rhizopus, Mucor, drożdże Rhodotorula, Torulopsis, Candida

- bakterie chorobotwórcze występują stosunkowo rzadko w atmosferze, ale często w pomieszczeniach zamkniętych (siedziby ludzi i zwierząt, szpitale)

- bakterie chorobotwórcze:

• gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus), pałeczka ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosa), paciorkowce z rodzaju Enterococcus i Streptococcus

• źródło jama nosowo-gardłowa, zakażone rany, bielizna szpitalna

- Shigella sp., Salmonella sp., Clostridium sp. - zakłady produkcyjne, zakłady zbiorowego żywienia

Dreszcze : stan gdy bakterie Gram(-) rozpadają się i wydzielają endotoksyny

Zakażenie odcewnikowe: gronkowiec skórny zakaża wenflony. Do badania przesyłamy krew, fragment cewnika i czasem wymaz. Jeśli wynik jest dodatni, to powtarzamy badanie by potwierdzić, że gronkowiec był z krwi, a nie ze skóry.

Bulion z żółcią: dur brzuszny, salmonella

Jeśli podłoża są płynne mętne, to by sprawdzić czy coś na nich rośnie musimy co jakiś czas przesiać na podłoże stałe albo zamontować urządzenie mierzące prężność CO2

tab. Rodzaj materiału pobieranego do badań mikrobiologicznych w zależności od lokalizacji zakażenia

Lokalizacja zakażenia	Rodzaj materiału	Domniemany patogen
Górne drogi oddechowe
nos, zatoki	wymaz z jamy nosowo-gardłowej, popłuczyny z zatok, aspirat	S.pneumoniae, H.influenzae, M.catarrhalis, Streptococcus beta-hemolizujący
gardło, krtań	wymaz z tylnej ściany gardła, wymaz z migdałków, wymaz z jamy nosowo-gardłowej	Streptococcus beta-hemolizujący grupy A (ine rzadziej)
OUN
	Aspiraty podtwardówkowe, PMR, krew, wymaz z gardła (nosicielstwo)	Neisseria meningitidis, H.influenzae, S. pneumoniae, paciorkowce grupy A I B, pałeczki G(-): Enterobacteriaceae, Listeria
Posocznia, endocarditis, rana pępkowa
	Krew, PMR (noworodek)	Streptococcus, w tym z grupy B (noworodki), S.aureus, S.pneumoniae, H.influenzae, Listeria monocytogenes, pałeczki G(-) Enterobacteriaceae, Salmonella, Pseudomonas, beztlenowce
Dolne drogi oddechowe
Oskrzela, płuca	Plwocina (?), krew, aspiraty śródtchawicze, BAL, sczotka z osłoną podczas bronchoskopii	S.pneumoniae, H.influenzae, M.catarthalis, Klebsiella pneumoniae, S.aureus, inne pałeczki Gram(-), Legionella, Fusobacterium, Prevotella spp
Przewód pokarmowy
Dolny odcinek		Campylobacter ieiuni/coli
J.cienkie	Kał	Salmonella spp
J. grube	Wymaz z odbytu	Shigella spp., E.coli (szczepy toksyno twórcze)
Układ płciowy
Mężczyźni	Wymaz z cewki moczowe, wydzielina z prostaty	N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis
Kobiety	Wydzielina z szyjki macicy, wymaz z cewki, wymaz z odbytu	Gardnerella vaginalis, N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Trichomonas vaginalis *HSV-wirus, ale też badamy go cytologicznie (wymazy z pochwy)
Drogi moczowe
	Mocz-środkowy strumień przez cewnik lub aspirat nadłonowy	E.coli i inne Gram (-): Proteus, Klebsiella, Enterococcus, P.aeruginosa, Staphylococcus saprophyticus, S.epidermidis, rzadko-S.aureus, candida

BUDOWA BAKTERII

Morfologia bakterii:

1. Ogólna charakterystyka:

- kształty:

• kulisty (ziarniaki, ziarenkowce) :

• coccus - pojedyncze

• diplococcus - pary

• streptococcus

• tetracoccus

• staphyloccoccus

• sarcina (pakiety)

• cylindryczny (pałeczki (bacterium), laseczki(bacilli - tloenowe, slostridia - beztlenowe))

• spiralne (krętki (treponema, leptospiry, borreilia), przecinkowce, śróbowce)

• nieregularne (maczugowce i prątki)

- pleomorfizm to zmienny kształt bakterii

- ziarniaki których komórki dzielą się w dwóch płaszczyznach tworzą czworaczki, a te, które dzielą się w trzech płaszczyznach tworzą sześcianki

- bakterie spiralne dzielimy na: przecinkowce, śrubowce, krętki (giętka ściana komórkowa i ciasne spiralne owiniecie rzęsek)

- 0,4 - 1 um szerokości i 0,5 - 10 um długości

2. Cytoplazma:

woda, jony, niskocząst metabolity, wysokocząst polimery kwasów nukleinowych, substy zapasowe, bb, rybosomy

3. Nukleoid:

• Replikacja DNA jest semikonserwatywna

• Białka inicjujące replikacją + gyraza - topoizomeraza2 i polimeraza RNA kierują inicjacją

• Nukleoid jest przyczepiony do mezosomu lub ściany komórkowej

• Miejsca w których geny strukturalne znajdują się obok swoistych miejsc biorących udział w regulacji aktywności genów strukturalnych to operatory

• Operon: sekwencja genów pod kontrolą jednego operatora

• Haploid (podwójna spirala w dwóch nici DNA)

4. Pozachromosomowe czynniki dziedziczenia:

• Plazmidy: koliste cząstki Dna, autonomiczna replikacja, determinują cechy które zwiększają możliwość przeżycia komórek w określonych warunkach

• Transpozony: fragmenty DNA podatne na translokację, różne geny w tym determinujące oporność

• Bakteriofagi

5. Rybosomy

• 23S + 5S = 50S, 16S = 30S

• Agregaty to polirybosomy

• Synteza białek (transkrypcja, translacja)

6. Błona cytoplazmatyczna

• Transport elektronów

• Synteza i transport prekursorów peptydoglikanu, kwasów tejchojowych i składników błony

• Wydzielanie enzymów i toksyn

• Regulacja segregacji DNA do kom potomnych

• Synteza układów transportowych

• Przenoszenie receptorów i innych bb

• 70% białko, 30% fosolipidy i znikoma ilość węglowodanów

• Transport aktywny dzięki permeazom

• PBP czyli białka wiążące penicyliny są to enzymy które odgrywają rolę w biosyntezie peptydoglikanu oraz są miejscem docelowego działania antybiotyków betalaktamowych

• Receptory: udział w chemotaksji i aerotaksji (w kier optymalnego stęż tlenu)

7. Mezosomy:

wpuklenia błony, przyczep nukleoidu, liczne enzymy w tym cytochromy

8. Ściana komórkowa:

• Peptydoglikan=mureina nie występuje u gromady Tenericutes (mykoplazmy) oraz Mendosicutes klasy Archeobaceria oraz u bakterii sololubnych (Halobacterium)

• Takson Methanobacterium należący do Archeobacteria w składzie muraminy nie zawiera kw. muraminowego, lecz kw talosaminouronowy - to tzw. Pseudomureina

• U Chlamydia nie ma też kw muraminowego

• Cząst peptydoglikanu: duża, dwa łańcuchy polisacharydowe, połączone za pomocą mostków peptydowych, każdy łańcuch jest zbud z dwucukrów: N-acetyloglukozaminy i kwasu N-acetylomuraminowego, który zaś połączony jest z tetra peptydem (łączy położone obok siebie łańcuchy)

• U bakterii Gram-dodatnich- grubość ściany - (20 - 80 nm), skład ściany - (60 - 100% z peptydoglikanu tworzącego trójwymiarową sieć).

• U wszystkich Gram-dodatnich występują polimery N-acetyloglukozoaminy i kwasu N-acetylomuraminowego, mogą różnić się długością mostków peptydowych i składem aminokwasowym.

• Peptydoglikan - u bakterii Gram-dodatnich może być hydrolizowany przez lizozym (obecny w płynach ustrojowych: łzy, ślina) także jest w białku jaja kurzego. Hydrolizuje on (lizozym) glikozydowe wiązania między kwasem N-acetylomuraminowym, a N-acetyloglikozo-aminą. Zachodzi wtedy liza komórki bakteryjnej. Mureina tworzy siatkę trójwymiarową.

• Kwasy tejchojowe - to polimery w długiej cząsteczce. W jej skład wchodzi rybitol tzn. alkohol z 3-węglowym cukrem. Polimery są połączone ze sobą fosfodwuestrowymi wiązaniami.

• Kwasy tejchojowe (2 postacie): ribitolowy, glicerolowy.

• Kwas tejchojowy - rybitolowy jest zwykle związany z grupą 6-hydroksylową kwasu-N-acetylomuraminowego (nazywany jest inaczej kwasem tejchojowym ściany komórkowej).

• Kwas tejchojowy - glicerolowy - zawsze połączony z glikolipidami błony (nazywamy inaczej lipotejchojowy).

• Rola kwasów tejchojowych nie została dokładnie poznana. Przypuszczalnie biorą udział w regulacji przechodzenia jonów przez warstwę peptydoglikanu (maja bowiem ładunek ujemny).

• W ścianie mogą także być kwasy mykolowe (wolne kwasy tłuszczowe) np. Corynebacterium, Mycobacterium. Różnica w ich strukturze (kw. mykolowych) jest kryterium do identyfikacji i klasyfikacji.

• W ścianie są także białka związane kowalencyjne lub niekowalencyjne nie tworzące struktury błonowej.

• Występują ponadto mutanty Bacillus subtilis i S. aureus nie mające kwasów tejchojowych, są one zdolne do życia jednak występuje u nich zaburzenie procesu podziału komórek. Podobną sytuację można obserwować w przypadku Streptococcus pneumoniae. U tego gatunku zamiast choliny (innegoskładnika kwasów tejchojowych) występuje etanoloamina. W związku z tym w podziale komórek nie tworzą się dwoinki ale długie łańcuchy.

• Ściana bakterii Gram- ujemnych - ma bardziej złożoną budowę, skład : peptydoglikan (mureina) błona zewnętrzna : fosfolipidy, białka, glikilipid (lipopolisacharyd) (LPS)

• Warstwa mureiny jest cieńsza w porównaniu z Gram-dodatnimi drobnoustrojami (5 - 10% masy ściany komórkowej) tworzy dwuwymiarową siatkę.

• Jest bardziej elastyczna (jednak na tyle mocna aby utrzymać kształt komórki, jak również ochronić ją przed osmatyczną lizą). W mureinie brak mostków wiążących krzyżowo, dlatego mostki peptydowe łączące łańcuchy glikanu wiążą bezpośrednio grupę karboksylową D-alaniny jednego łańcucha z wolną grupą aminową kwasu dwuaminopimelinowego łańcucha przyległego.

• W odróżnieniu od Gram-dodatnich 50% tetrapeptydów zakończonych jest wolną D-alaniną.

• Mureina z błoną cytoplazmatyczną jest połączona poprzez wiązania jonowe, natomiast z błoną zewnętrzną przez lipoproteinę (lipoproteina mureinowa). Funkcja lipoproteiny - to utrzymanie na miejscu innych białek błony zewnętrznej. Część białkowa kowalencyjnie jest związana z mureiną, a lipidowa znajduje się w błonie zewnętrznej przyczepiona przy pomocy hydrofobowych wiązań między lipoproteina, a fosfolipidami błony zewnętrznej.

9. Błona zewnętrzna:

• Fosfolipidy - dwie warstwy z których części hydrofobowe znajdują się naprzeciw siebie. Błona zewnętrzna nie przepuszcza składników hydrofobowych jest ponadto oporna na działanie detergentów dlatego też wiele bakterii Gram-ujemnych rośnie w ich obecności. Zwiększenie przepuszczalności błony powodują związki chelatujące np. EDTA (staje się przepuszczalna dla antybiotyków i detergentów). Dla cząstek hydrofilowych błona zewnętrzna odznacza się duże przepuszczalnością.

• Białka główne - (70% ogółu białek w błonie zewnętrznej) powiązane są z LPS, ze sobą jak i z lipoproteina mureinowa. W związku z powyższym tworzy się stabilna struktura.

• Lipopolisacharydy (LPS - to długie heteropolimery zbudowane z trzech strukturalnie odmiennych regionów które są powiązane ze sobą wiązaniami kowalencyjnymi. Są nimi : lipid A (I), oligocukier rdzeniowy (II) i wielocukier o swoistości antygenowej 0, jest on antygenem somatycznym (III).

• Oligosacharyd rdzeniowy - podobny jest u wszystkich bakterii Gram-ujemnych w związku z tym określony grupowo swoisty antygen (antygen wspólny) wykazany u Escherichia coli 014.

• LPS bakterii Gram-ujemnych wykazuje właściwości toksyczne w stosunku do ssaków. Z uwagi na znajdujący się w LPS toksyczny czynnik (wielocukier i/lub lipid A) będący integralną częścią ściany komórkowej nazwano go endotoksyną inaczej toksyną lipopolisacharydową.

• Antygen somatyczny - jest to najbardziej zewnętrzna część LPS będąca polimerem powtarzających się jednostek oligocukrów utworzonych przez 2 lub 8 reszt jednocukrowych.

• Lipid A - zbudowany jest z dwucukru : D-glikozaminylowego. Lipid A hamuje dyfuzję związków hydrofobowych np. kwasów żółciowych, niektórych antybiotyków i detergentów przez błonę zewnętrzną.

• Endotoksyna - wywołuje wiele objawów chorobotwórczych m.inn.: wstrząs endotoksyczny (wstrząs septyczny), miejscowe reakcje skórne, gorączka (pirogenność), leukocytoza, obniżenie ciśnienia krwi indukcja nieswoistej odporności na zakażenie, wiele innych.

• Znikome tj. nanogramowe ilości endotoksyny będą w wyjałowionych roztworach do wlewów dożylnych mogą być powodem u pacjentów efektu pirogennego. Konieczne jest dlatego badanie płynów infuzyjnych pod względem obecności endotoksyny.

10. Inne:

• Do zewnętrznej powierzchni ściany komórkowej mogą przylegać wydzielone przez bakterie substancje o charakterze polimerów. W przypadku gdy substancje te tworzą grubą warstwę otaczającą pojedynczą komórkę lub parę komórek nazywa się ją otoczką. Otoczki są zbudowane z polisacharydów. Polisacharydy mają niskie powinowactwo do barwników i dlatego nie widać ich w metodach stosowanych rutynowo. Można wykazać ich obecność w metodzie tzw. negatywnej. Na ciemnym tle "halo" widać je niezabarwione. Można także wykazać ich obecność w metodach serologicznych np. -odczyny : pęcznienia otoczek, aglutynacji, immunofluorescencyjnej, a także aglutynacji lateksowej.

• Funkcja otoczek to ochrona komórki przed wysychaniem. Są z reguły dobrym antygenem, indukują wytwarzanie swoistych przeciwciał biorących udział w niszczeniu bakterii. Bakterie wytwarzające otoczki rosną na podłożach z zawartością np. cukru, surowicy, w atmosferze CO₂ w postaci śluzowatych kolonii typu S, M. Ich odmiany bezotoczkowe tworzą kolonie R-szorstkie. Na powierzchni komórki mogą znajdować się inne substancje, które nie są warstwą komórkową. Nazywane są mikrootoczką, glikokaliksem, śluzem lub egzopolisacharydem.

- Rzęski :

• narząd ruchu bakterii, są to długie, w środku puste, spiralnymi filamentami (nici). Ich długość jest kilka razy większa niż długość komórki, a średnica w granicach 12-20 nm. Rozmiary te są mniejsze od zdolności rozdzielczej, mikroskopu świetlnego dlatego nie mogą być widoczne w rutynowym barwieniu preparatów, jedynie przy użyciu odpowiedniej bejcy, które doprowadza do powiększania średnicy rzęsek. W mikroskopie świetlnym można obserwować ruch drobnoustrojów w tzw. kropli wiszącej.

• wytwarzanie jest cechą gatunkową zależną także od warunków środowiska np. Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica i Yersinia pseudotuberculoris nie wytwarzają w temperaturze 37°C, a są obecne w temperaturze niższych (22°C - 30°C).

• Ważną cechą taksonomiczną bakterii jest ich rozmieszczenie i liczba.

• Umiejscowienie rzęsek : dookoła komórki (wkołorzęse = peritricha) na jednym biegunie (czuorzęse = lophotricha) na obu biegunach po 1 rzęsce (dwurzęse = ditricha) jedna rzęska na biegunie (jednorzęse = monotricha).

• Rzęski wychodzą z cytoplazmy komórki. Rzęska przymocowana jest za pomocą ciałka podstawnego (w postaci haczyka, pierścienia albo płytki). Różni się ono budową u bakterii Gram-ujemnych (2 pary pierścieni), i Gram-dodatnich (1 para pierścieni). Pierścienie te pełnia rolę tulejki, przez którą przechodzą nici rzęski (filamenty). Rzęski zbudowane są z białka tzw. flageliny (białko rzęskowe), która jest immunogenem (antygenem H).

• Bakterie za pomocą rzęsek poruszają się dzięki ich ruchowi obrotowemu przypominającemu ruch śruby okrętowej. Występuje u bakterii zjawisko chemotaksji tzn. poruszanie się w kierunku substancji odżywczych lub uciekanie od substancji szkodliwych. Ruch komórki zależy od kierunku, w którym obraca i rzęska np. jeżeli odwrotny do kierunku wskazówek zegara - komórka porusza się po linii prostej, jeśli zgodnie to "koziołkuje" w miejscu. Jeśli płynie do substancji odżywczej ruchu po linii prostej są dłuższe, fazy koziołkowania są krótsze, jeśli oddala się od substancji wabiącej i zbliża się do szkodliwej wzmagają się fazy koziołkowania, aż do momentu ustalenia odpowiedniego kierunku.

- Fimbrie (pile):

• nitkowate dodatki jedynie widoczne w mikroskopie elektronowym. Są proste i krótsze od rzęsek. Występują u bakterii Gram-ujemnych u Gram-dodatnich np. Streptococcus spp., Corynetobacterium spp. Zbudowane są z białka składającego się z podjednostek zwanych pillinami. Jako białko są swoistym immunogenem. Komórka może nie posiadać fimbrii jest wtedy nieufimbriowana, jeśli wytwarza je jest ufimbriowana.

• Typy fimbri : zwykłe i płciowe.

• Zwykłe - występują u bakterii Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae, rodzaju Pseudomonas i Haemophilus oraz u Neisseria gonorrhoae. Są wyznacznikiem chorobotwórczości bakterii. Ich wytwarzanie uwarunkowane jest najczęściej przez geny w chromosomie, rzadko przez plazmidowe.

• Płciowe - ich wytwarzanie zależne od genów w plazmidach (F, R, col). Fimbrie te maja kanał, przez który może przechodzić transpozonowy chromosomalny, plazmidowy lub bakteriofagowy DNA.

- Przetrwalniki (endospory):

• wytwarzane przez rodzaj Bacillus spp. i Clostridium spp. np. B. subtilis, B. anthracis, C. botulinum, C. perfingens, S. tetanii.

• Rola przetrwalników - przetrwanie w niekorzystnych warunkach życia (brak składników odżywczych, wody). Dzięki nim mogą bakterie te przeżywać setki lat (anabioza).

• Proces tworzenia przetrwalnika - proces sporulacji w warunkach doświadczalnych początek jego następuje po skończeniu logarytmicznej fazy wzrostu, na początku fazy stacjonarnej wtedy kiedy brakuje źródeł węgla i azotu, a gromadzą się metabolity.

• Proces (sporulacja), przebiega w wielu etapach. Następuje zagęszczenie cytoplazmy wokół jednego nukleoidu, tworzy się błona cytoplazmatyczna i warstwa peptydoglikanu tzn. osłon które otaczają tworzący się przetrwalnik. W nim zatrzymany zostaje proces metaboliczny tzw. "pauza metaboliczna".

• Przetrwalnik jest oporny na działanie szkodliwych dla niego czynników zewnętrznych na brak wody, podwyższona temperatura, promienie UV, brak składników odżywczych, zmiany pH. Z uwagi na obecność kwasu dipikolinowego nie niszczy go po 1 godzinne gotowanie w temp. 100°C. Proces kiełkowania tzw. przejście w formę komórki wegetatywnej nazywany jest germinacją. Leki infuzyjne, produkty spożywcze np. konserwy nieprawidłowo wyjałowione (tz. w temperaturze mniejszej 121°C) mogą zawierać przetrwalniki.

• Po wykiełkowaniu w konserwie powodują one wystąpienie tzw. bombażu, a lek nie może być podawany pacjentowi. Lek można jałowic także w procesie filtracji. Wymiary ednospor mogą być mniejsze od poprzecznego wymiaru komórki macierzystej lub większe np. Clostridium spp.

• Umiejscowienie przetrwalników w komórce jest: centralne, subcentralne lub biegunowe, a komórki mają kształt buławy lub wrzeciona. Cechą taksonomiczną jest umiejscowienie przetrwalnika a także jego wielkość. Od chorego mogą być izolowane między innymi z ropy, plwociny, kału, rany.

• Przetrwalniki są widoczne w mikroskopie świetlnym po wybarwieniu metodą np. Schaeffer-Fultona. Wybarwiają się na kolor podgrzanego barwnika.

- Ziarna cytoplazmy (ciałka wtrętowe):

• mają funkcje zapasowe są źródłem energii, mogą być otoczone cienką błoną.

• Ziarnistości mogą być zbudowane z polimeru kwasu p-hydroksymasłowego albo zawierają nieorganiczne fosforany. Ziarnistości wolutynowe występują u Corynebacterium diphtheriae (jako ciałka Ernsta-Babesa).

• Oglądane są w mikroskopie świetlnym po wybarwieniu metodą Neissera.

• Ziarnistości wybarwione są na kolor ciemnobrązowy, komórka wegetatywna na kolor żółty.

• Corynebacterium spp. - pałeczki Gram-dodatnie w preparacie układają się w postaci liter chińskich, I,Y,X,L Występują w wodzie, glebie, na skórze i błonach śluzowych.

• Corynebacterium diphtheriae izolowanych jest z gardła, pępka, rany.

11. Protoplasty, sferoplasty, L postacie bakterii:

• Antybiotyki ß-laktamowe hamują tworzenie peptydowych, krzyżowych mostków w mureinie u bakterii Gram-dodatnich. Podobne właściwości (hamowanie syntezy mureiny) wykazują : wankomycyna, fosfomycyna, bacytracyna, cykloseryna. Także działanie liozymu powoduje rozerwanie połączeń glukozoamina, a kwas acetylomuraminowy. Komórki takie - bez mureiny u bakterii Gram-dodatnie nazywano protoplastami.

• Sferoplasty - wytwarzane podobnie komórki bez mureiny u bakterii Gram-ujemnych.

• Protoplasty i steroplasty są: wrażliwe na działanie ciśnienia osmotycznego środowiska.

• In vitro żyją w środowisku o wyższym ciśnieniu osmotycznym np. sole magnezu, albumina bydlęca, żelatyna, 20% sacharoza. Przeniesione do podłoża, które nie zawiera czynnika hamującego syntezę mureiny zmieniają swój kształt do wyjściowego (normalnych komórek).

• Postacie -L-bakterii są to sferoplasty i protoplasty hodowane in vitro i in vivo. Na podłożach stałych tworzą kolonie wrastające w podłoża o kształcie zbliżonym do "sadzonego jaja"

Fizjologia bakterii:

1.Wymagania odżywcze:

• Skł pokarmowe wchłaniane całą powierzchnią komórki bakteryjnej

• Oligotrofy: mogą pobierać pokarm wbrew gradientowi stężeń, przystosowane do środowiska ubogiego w pokarm

• Ektoenzymy: protezy, lipazy, nukleazy, enzymy rozkładające wielocukry - rozkładają zewnkomórkowo duże cząstki pokarmu

• Źródło węgla: cukry, alkohole, kw tłuszczowe, kw dwukarboksylowe i inne

• Źródło azotu: zw amonowe, azotany, aa (bakterie glebowe zużywają azot atmosferyczny)

• E.coli ma bardzo małe wymagania odżywcze, a Haemophilus spp są bardzo wymagające jeśli chodzi o rodzaj i ilość składników odżywczych

• Bakterie do wzrostu potrzebują metali: cynku, molibdenu, manganu, miedzi, kobaltu i innych

2. Metabolizm bakterii:

• Chemolitotrofy jako źródło węgla wykorzystują związki organiczny, zaś jako źródła energii - proste związki nieorganiczne (bakterie siarkowe, żelazowe), większość to bezwzględne beztlenowce

• Chemoorganotrofy czerpią energię ze związków organicznych (bakterie chorobotwórcze uzyskują energię z rozpadu cukrów)

• Wyjątki: np. Moraxella, nie rozkłada cukrów, ale aa, alkohole i kwasy organiczne

3. Zapotrzebowanie na tlen:

• Bezwzględne tlenowce: niektóre bakterie chorobotwórcze (Micrococcus spp, Pseudomonas spp.)

• Względne beztlenowce: najliczniejszcze grupa bakterii chorobotwórczych człowieka (E.coli, S.aureus)

• Beztlenowce:

• Ściśle bezwzględne beztlenowce (0,5% tlenu w atmosferze je zabija): Clostridium haemolyticum, C. novyi, Treponema denticola

• Umiarkowane bezwzględne beztlenowce (trochę większa tolerancja na tlen): flora fizjologiczna przewodu pokarmowego człowieka

• Mikroaerofile: wymagają tlenu jako końcowego akceptora elektronów, jednak jego stężenie w atmosferze powinno być obniżone do ok. 5% (Campylobacterj ieiuni, H. pylori - optimum wzrostu przy 5%O2, 10%CO2 i 85%N2)

• Neisseria meningitis, H.influenzae, N. gonorrhoeae, Brucella spp: potrzebują do 15% CO2 (tzw. Bakterie kapnofilne)

4. Wpływ czynników fizycznych na wzrost bakterii:

- T:

• Psychrofilne: 0-20 stC

• Mezofile: 35-37 stC (20-45 stC) (bakterie chorobotwórcze i flora fizjol)

• Termofilne 50-70stC (30-90 stC) (płuco rolnika - Micropolyspora faeni, wdychanie kurzu ze spleśniałego siana powoduje alergiczne zapalenie pęcherzyków płuc)

- pH:

• Dla większości bakterii chorobotwórczych optymalne 6,8-7,4

• Vibrio cholerae: 8,0

• Lactobacillus: 6,0

-Ciśnienie osmotyczne:

• Umieszczone w środowisku hipotonicznym: plazmoptyza

• Umieszczone w środowisku hipertonicznym: plazmoliza

• Halococcus, Halobacterium - żyją w Morzu Martwym, wymagają dużo NaCl i MgCl2

• S. aureus dobrze znosi 6,5% stężenie NaCl
  

---