Biologiczne układy koloidalne

Podział roztworów

• roztwory rzeczywiste (cząsteczki rozpuszczalne <1nm)

• roztwory koloidalne (cząsteczki 1-1000 nm)

• zawiesiny (cząsteczki rozpuszczalne >1000 nm)

Układ koloidalny

• Układ koloidalny (koloid, układ koloidowy) - niejednorodna mieszanina, zwykle dwufazowa, tworząca układ dwóch substancji, w którym jedna z substancji jest rozproszona (zawieszona) w drugiej. Rozdrobnienie (czyli dyspersja) substancji rozproszonej jest tak duże, że fizycznie mieszanina sprawia wrażenie substancji jednorodnej, jednak nie jest to wymieszanie na poziomie pojedynczych cząsteczek.

Właściwości

• W koloidach stopień dyspersji wynosi od 105 do 107 cm^-1

• Układ dyspersyjny jest układem koloidalnym, gdy rozmiary cząstek fazy rozproszonej (cząsteczek chemicznych lub ich agregatów) albo rozmiary nieciągłości układu koloidalnego są w zakresie od 1 nm do 1 ၭm.

Rodzaje koloidów

Typowy układ koloidalny (tzw. koloid fazowy) składa się z dwu faz:

• fazy ciągłej, czyli substancji rozpraszającej, zwanej też ośrodkiem dyspersyjnym albo dyspergującym

• fazy rozproszonej, czyli substancji zawieszonej (zdyspergowanej) w ośrodku dyspersyjnym i w nim nierozpuszczalnej (liofobowej, hydrofobowej).

• koloidy cząsteczkowe, gdzie fazą rozproszoną są makrocząsteczki, np. polimery tj. żelatyna, skrobia, białka - nie występuje wówczas wyraźna granica fazowa, bo cząsteczki rozpuszczalnika mogą wnikać do wewnątrz makrocząsteczki.

Większość koloidów cząsteczkowych powstaje w sposób samorzutny w wyniku rozpuszczania w rozpuszczalniku (koloidy liofilowe, hydrofilowe). Niektóre ich właściwości są inne niż właściwości koloidów fazowych.

Peptydy i białka

Fizyczne metody badań dostarczają informacji na temat:

- struktury makrocząsteczek

- ich konformacji przestrzennej

Pojęcia podstawowe

STRUKTURA - rozmieszczenie atomów w przestrzeni uporządkowane w sposób periodyczny

BAZA STRUKTURY - niezmienny zespół atomów, który periodycznie powtarzając się tworzy strukturę. Może składać się z jednego (w strukturach prostych) lub z wielu (w makrocząsteczkach) atomów

Poziomy uporządkowania struktury

Wewnętrzny - bazy struktury

Zewnętrzny - pomiędzy bazami

KONFORMACJA - względny rozkład atomów w przestrzeni wynikający z obrotu lub skręcenia wiązań kowalencyjnych

Fizyczne metody badania makrocząsteczek

• metody rentgenograficzne (analiza rentgenostrukturalna),

• metody hydrodynamiczne,

• metody optyczne

Analiza rentgenostrukturalna

Wykorzystuje zjawisko rozproszenia (dyfrakcji) promieni X przez kryształ

Dyfrakcję promieni X powodują tylko elektrony, stąd rentgenogram pozwala na uzyskanie mapy gęstości elektronowej

Wymaga substancji oczyszczonych, jednorodnych, występujących w postaci krystalicznej

Możliwa do zastosowania w badaniach struktur biologicznych dzięki zdolności do krystalizacji białek, kwasów nukleinowych i wirusów.

Atomy kryształu tworzą układy częściowo odbijających płaszczyzn - tzw. płaszczyzny sieciowe

Ponieważ rozkład refleksów promieniowania x zależy od parametrów geometrycznych sieci krystalicznej, analizę rentgenostrukturalną wykorzystuje się do badania struktury kryształów nisko- i wysokocząsteczkowych

Parametry położenia atomów w strukturze

Amplituda j-tego atomu:

gdzie: f_j - wielkość zależna od rodzaju atomu, a

၆ - kąt fazowy zależny od pozycji atomu

Amplituda promieni dyfrakcyjnych:

gdzie: - moduł amplitudyႽFႽ

oblicza się z równania I = ႽFႽ²

Analiza rentgenostrukturalna

Uzasadnienie stosowania promieniowania x:

Długość fali musi spełniać warunek Wulfa-Bragga:

gdzie: λ - długość fali, m - rząd odbicia, θ - kąt pomiędzy kierunkiem padania promieni a płaszczyzną kryształu, d - odległość między sąsiednimi płaszczyznami sieciowymi

Uzasadnienie stosowania promieniowania x:

Z warunku Wulfa-Bragga wynika, że kryształy przepuszczają promienie UV i Vis oraz uginają promienie x, γ oraz elektrony i neutrony.

METODA IZOMORFICZNYCH PODSTAWIEŃ:

Jednoczesne wykorzystanie danych dyfrakcyjnych otrzymanych z kryształów kilku pochodnych oznaczanego związku

Metody hydrodynamiczne

Dostarczają przybliżonych danych o wielkości i kształcie makromolekuł w oparciu o właściwości ich roztworów

Są mniej dokładne, ale łatwiejsze do wykonania od metod rentgenograficznych

Metody hydrodynamiczne:

• lepkość,

• dyfuzja makrocząsteczek w roztworze,

• sedymentacja w wirówce.

Lepkość

• gradient prędkości cząsteczek w cieczy rzeczywistej

• 
  siły wprawiające w ruch obrotowy makrocząsteczki, którego utrzymanie wymaga dodatkowej energii, pochodzącej ze wzrostu lepkości roztworu

• dla cząsteczek kulistych (równanie Einsteina)

gdzie ၨ₀ - lepkość rozpuszczalnika, a ၆ - stosunek objętości cząsteczki do objętości całego roztworu

• dla cząsteczek o innych kształtach lepkość wzrasta co można wykorzystać do określania przybliżonego kształtu makromolekuł

Dyfuzja makrocząsteczek w roztworze

Wykorzystuje zależność współczynnika dyfuzji od kształtu i rozmiaru makrocząsteczek

gdzie: N_A - liczba cząsteczek w jednym molu substancji,

η- lepkość i r - promień cząsteczki.

Sedymentacja w wirówce

Sedymentacja - osiadanie cząsteczek zawieszonych w ośrodku dyspersyjnym (rozpuszczalniku) w polu grawitacyjnym lub odśrodkowym

Umożliwia wyznaczenie mas molowych w oparciu o równanie Svenberga

gdzie: ၲ - gęstość rozpuszczalnika

Metody optyczne

Rozpraszanie światła (efekt Tyndalla)

Rozpraszanie promieni Rentgena

Metody spektrofotometryczne

Poziomy organizacji cząsteczki białka

• Struktura pierwszorzędowa (sekwencja aminokwasów)

• Struktura drugorzędowa (układ przestrzenny głównego łańcucha polipeptydowego, np. ၡ-helix, struktura ၢ)

• Struktura trzeciorzędowa (sposób zwinięcia w przestrzeni łańcucha o określonej strukturze drugorzędowej)

• Struktura czwartorzędowa (układ przestrzenny podjednostek oraz zespół oddziaływań i kontaktów między nimi

Cechy wiązania peptydowego

• Podwójny charakter wiązań C' - N umożliwia swobodną rotację atomów, która wymaga jednak pewnych nakładów energii. Kąt obrotu wokół C' - N, czyli kąt torsyjny oznaczany jest symbolem ၷ

• Polarność ugrupowania peptydowego stwarza możliwość występowania konfiguracji cis i trans. Konfiguracja trans jest korzystniejsza energetycznie i bardziej typowa dla otwartych łańcuchów peptydowych

• Ugrupowania peptydowe mogą się ze sobą łączyć wiązaniami wodorowymi

Konformacja polipeptydów (założenia podstawowe)

• Cząsteczki w stanie równowagi termodynamicznej przyjmują konformację najbardziej korzystną energetycznie

• Konformację prostych związków organicznych można ustalić w oparciu o mechanikę kwantową

• Celem ustalenia konformacji makrocząsteczek (np. białek), ze względu na ich złożoność, stosuje się metody półempiryczne

Warunki trwałości konformacji łańcucha peptydowego

(Pouling, Carey i Branson 1951)

Wszystkie aminokwasy wchodzące w skład łańcucha peptydowego muszą należeć do tego samego szeregu konfiguracyjnego

Każda wiązanie peptydowe ma konformację płaską (koplanarną) o parametrach typowych dla związków niskocząsteczkowych

Grupy C' = O i N - H tworzą wewnętrzne wiązania wodorowe o długości 0,272 nm, odchylające się od lini prostej o kąt nie większy od 30º

Ustawienie przestrzenne wiązań C' - C₂ i C' - N odpowiada minimalnej energii obrotu wokół tych wiązań

Charakterystyka ၡ - heliksu

Średnica heliksu wynosi 1,01 nm

Odległości między skrętami wynoszą 0,54 nm

Translacja (tzn. przesunięcie wzdłuż osi o 1 resztę aminokwasową wynosi 0,15 nm

Może być prawo- (dla D-aminokwasów) lub lewoskrętny (dla L-aminokwasów)

Charakterystyka struktury - ၢ

Struktura warstwowa, zbudowana z położonych obok siebie łańcuchów peptydowych

Wiązania wodorowe powstają między ugrupowaniami peptydowymi sąsiednich łańcuchów

W strukturze ၢ-cross wiązania wodorowe powstają zarówno między ugrupowaniami peptydowymi sąsiednich łańcuchów jak i w obrębie tego samego łańcucha

Charakterystyka struktury kolagenu

Jednostkę struktury stanowią trzy łańcuchy polipeptydowe o konformacji rozciągniętego lewoskrętnego heliksu

Parametry pojedynczego heliksu: promień heliksu 0,1 nm; skok 0,251 nm przy 3 resztach aminokwasowych na zwój

Wiązania wodorowe występują tylko między łańcuchami polipeptydowymi w liczbie 1 mostek na 3 jednostki peptydowe

Małe heliksy skręcają się wokół wspólnej osi tworząc duży prawoskrętny heliks

---