Biofizyka lipidów

Błony lipidowe jako modele błon biologicznych

Fizykochemiczna charakterystyka lipidów (rozpuszczalność

• Zróżnicowana grupa substancji, które w wodzie rozpuszczają się słabo, albo nie rozpuszczają w ogóle.

• Ekstrahują się rozpuszczalnikami organicznymi (eterem, benzenem, chloroformem).

• O rozpuszczalności w wodzie decyduje duża wartość elektrycznego momentu dipolowego, albo zdolność polaryzowania się pod wpływem wody.

Fizykochemiczna charakterystyka lipidów (właściwości amfofilowe)

• Cząsteczki lipidów są apolarne, co wynika z nagromadzenia dużej liczby grup -CH₂-.

• Oprócz łańcuchów węglowych w cząsteczkach lipidów występują grupy polarne lub jonowe (np. estrowe, fosforanowe, aminowe, hydroksylowe i in.).

• W cząsteczkach lipidów grupy polarne znajdują się obok siebie tworząc część hydrofilową, podczas gdy reszta cząsteczki stanowi część hydrofobową.

Fizykochemiczna charakterystyka lipidów (aktywność powierzchniowa)

Aktywność powierzchniowa lipidów wynika ze zdolności absorbowania się na powierzchni cieczy

Czynność powierzchniowa lipidów obniża napięcie powierzchniowe cieczy

Najwyższą aktywnością powierzchniową odznaczają się fosfolipidy

Amfofilowość decyduje o właściwościach biologicznych lipidów, które występują przede wszystkim w składzie błon biologicznych

Lipidy - funkcje biologiczne

Lipidy jako składniki błon biologicznych. Podwójna błona lipidowa jest stabilnym termodynamicznie układem stanowiącym barierę dla większości substancji wymienianych między oddzielonymi błoną przedziałami.

Współczynniki dyfuzji (D) [cm²/s] i czasy dyfuzji (t) przez podwójną błonę lipidową o grubości 5nm oraz przez taką samą warstwę wody

Ze względu na napięcia powstające na błonach biologicznych (na skutek różnego stężenia jonów po obu ich stronach) szczególnie ważne są takie właściwości lipidów, jak:

• wysoki opór właściwy (10⁸ - 10¹⁶ ၗm),

• wysoka wytrzymałość elektryczna (10⁷ - 10⁸ V/m)

Lipidy występujące najczęściej w błonach biologicznych:

• Fosfolipidy (uniwersalny składnik błon),

• Glikolipidy (w chloroplastach),

• Cholesterol (w komórkach Eucariota),

• Karotenoidy (w chloroplastach, w komórkach siatkówki oka).

Monomolekularna warstwa powierzchniowa

- sposoby otrzymywania

1. Adsorbcja substancji powierzchniowo czynnych na granicy międzyfazowej (dotyczy substancji absorbujący się na powierzchni wody, tj. wyższe alkohole, kwasy tłuszczowe, fosfolipidy)

2. Naniesienie kropli roztworu lipidu w lotnym rozpuszczalniku na powierzchnię wody

Definicja termodynamiki

• Matematyczny opis ciepła i jego związku z energią mechaniczną i innymi formami pracy. W układach chemicznych umożliwia określenie możliwości przeprowadzenia reakcji, jej kierunek i położenie stanu równowagi

Podstawowe wielkości termodynamiki

• Energia wewnętrzna (U) - suma całej energii kinetycznej i potencjalnej układu.

• Funkcja stanu - wielkość termodynamiczna zależna jedynie od stanu w jakim znajduje się układ a nie od sposobu w jaki ten stan został osiągnięty.

• Funkcja zależna od drogi - wielkość, której wartość zależy od drogi przemiany od stanu początkowego do końcowego

• Rodzaje układów termodynamicznych:

- otwarty,

- zamknięty,

- izolowany.

• Pierwsza zasada termodynamiki - Energia układu izolowanego jest stała. W układzie otwartym energia może być wymieniana z otoczeniem tylko na sposób pracy lub ciepła

• 
  Praca - energia w postaci uporządkowanego ruchu. Najbardziej powszechne jej rodzaje to:

- praca zwiększania objętości przeciwko ciśnieniu,

- praca elektryczna.

• 
  Entalpia - funkcja stanu zdefiniowana zależnością

• 
  
  Entropia (S) - w ujęciu termodynamicznym funkcja stanu określona zależnością

lub dla procesów nieodwracalnych

w ujęciu statystycznym miara nieuporządkowania układu

gdzie W jest liczbą możliwych konfiguracji układu

• Druga zasada termodynamiki - entropia układu izolowanego zwiększa się w przypadku procesów nieodwracalnych lub pozostaje stała w przypadku procesów odwracalnych. Entropia układu izolowanego nigdy nie maleje.

• Proces samorzutny - proces wykazujący dążność do zachodzenia bez konieczności wykonania pracy w układzie

• Proces niesamorzutny - wymagający dostarczenia energii na sposób pracy

• Trzecia zasada termodynamiki - Entropia doskonałego kryształu w temperaturze 0 K (zera bezwzględnego) wynosi zero

• Entalpia swobodna (energia Gibbsa) (G)

• 
  Energia swobodna (energia Holmholtza)

Energia swobodna i entalpia swobodna - funkcje stanu, których wartości bezwzględne są niemiarzalne

Elementy termodynamiki powierzchni międzyfazowej: wnioski

Substancje zmniejszające napięcie powierzchniowe rozpuszczalnika, gromadzą się na powierzchni międzyfazowej

Wyższe alkohole, kwasy tłuszczowe i fosfolipidy, jako substancje silnie zmniejszające napięcie powierzchniowe wody, gromadzą się na jej powierzchni

Naniesienie kropli roztwory lipidu w lotnym rozpuszczalniku na powierzchnię wody

Warunki jakie musi spełniać rozpuszczalnik:

• Lipid musi się w nim dobrze rozpuszczać

• Musi doskonale rozpływać się po powierzchni wody

Kropla cieczy spoczywająca na powierzchni ciała stałego: ၧa - napięcie powierzchniowe ciała stałego, ၧb - napięcie powierzchniowe cieczy, ၧab - napięcie międzyfazowe, ၑ - kąt graniczny

Jeżeli następuje dokładne zwilżanie ciała a przez ciało b, kąt ၱ nie ma żadnej określonej wartości

Wielkości charakteryzujące lipidową błonę powierzchniową (dane podstawowe)

• Powierzchnia przypadająca na jedną cząsteczkę A = S/n (iloraz całkowitej powierzchni błony i liczby cząsteczek)

• 
  Ciśnienie powierzchniowe

Wielkości charakteryzujące lipidową błonę powierzchniową (rodzaje błon w zależności od analogii ze stanami skupienia ciał trójwymiarowych)

1. 
   Błonka gazowa: A>4nm². Odpowiada gazowi dwuwymiaro-wemu, spełniając równanie:

, gdzie k - stała Boltzmana, T - temperatura w skali Kelvina,

lub (dla błon elektrycznie obojętnych)

Przy odpowiednio dużych powierzchniach właściwych

II. Przejście fazowe do stanu ciekłej błonki rozciągniętej (ၰ=1-3 x 10^-4N/m; A<4nm²).

- ၰ^V utrzymuje wartość stałą.

- Błona jest niejednorodna (złożona z pary nasyconej i błony rozciągniętej pozostających w stanie równowagi dynamicznej),

- cząsteczki orientuję się równolegle do powierzchni wody

III. Błona ciekła rozciągnięta

3. Przejście od ciekłej błony rozciągniętej do skondensowanej

W obszarze III i IV powierzchnia właściwa cząsteczki jest większa od jej przekroju poprzecznego.

V i VI. Stany skondensowane

- powierzchnia właściwa zbliżona do przekroju poprzecznego cząsteczki,

- cząsteczki orientują się prostopadle do powierzchni wody

Wielkości charakteryzujące lipidową błonę powierzchniową (potencjał powierzchniowy)

Potencjał powierzchniowy błonki

gdzie: V₁ - różnica potencjałów między cieczą a powietrzem, a V₂ - różnica potencjałów między cieczą pokrytą warstwą monomolekularną a powietrzem,

Zakładając, że powierzchnia błonki stanowi kondensator płaski

gdzie: Q - ładunek na okładce kondensatora, S - powierzchnia okładek, c - odległość między okładkami, P_ၞ - moment dipolowy powierzchni S, A - powierzchnia przypadająca na 1 cząsteczkę lipidu, ၭ_ၞ - składowa momentu dipolowego cząsteczki lipidu prostopadła do cząsteczki międzyfazowej, ၥ - przenikalność dielektryczna przy powierzchni, ၥ₀ - przenikalność dielektryczna próżni

Zakładając, że ၥ = 1, otrzymujemy momentu dipolowego cząsteczki lipidu prostopadła do cząsteczki międzyfazowej

Uwaga:

Otrzymane z powyższych równań dane o potencjale powierzchniowymmają charakter przybliżony i mogą być stosowane przy planowaniu doświadczeń

Zastosowanie błon monomolekularnych w badaniach biologicznych

• Opublikowanie danych umożliwiających opracowanie hipotezy o budowie błony komórkowej, głoszącej że składa się ona z dwóch warstw lipidowych (Gorter i Grendel; 1925-1926),

• Odkrycie mechanizmu działania antybiotyków polienowych (np. filipina, nystatyna, amfoterycyna B) polegającego na częściowym pozbawieniu błony komórkowej właściwości bariery dyfuzyjnej, na skutek reakcji z cholesterolem obecnym w błonie. Antybiotyki te nie działają na bakterie w związku z brakiem w ich błonach cholesterolu,

• Analiza wpływu zorientowania cząsteczek na ich zachowanie się i właściwości (tj. aktywność chemiczna, właściwości optyczne i in.)

Bimolekularne błony lipidowe

Model bimolekularnej (dwuwarstwowej, czarnej) błony lipidowej jako fazy lipidowej błon biologicznych opracowany został na początku lat 60-tych przez Muellera, Rudina i Tiena.

Bimolekularne błony lipidowe - sposoby otrzymywania

1. Uzyskiwanie błony sferycznej

2. Złożenie dwóch błon utworzonych na powierzchni cieczy (możliwe jest uzyskiwanie błon niesymetrycznych)

3. 
   Naniesienie kropli roztworu lipidu w rozpuszczalniku niepolarnym (np. ciekły węglowodór) na otwór w środkowej ścianie pojemnika wypełnionego wodą lub płynnym elektrolitem (np. 0.1M KCl)

Ustalanie grubości bimolekularnej błony lipidowej

1. Pomiar współczynnika odbicia światła od błony c.d.

n - współczynnik załamania błony, n₀ - współczynnik załamania roztworu wodnego (n< n₀), ၤ - grubość błony, ၬ - długość fali użytego światła

Metoda pozwala na pomiar całkowitej grubości warstwy bimolekularnej (tzn. zarówno jej części hydrofobowej, jak i obu - hydrofilowych

2. Pomiar pojemności elektrycznej właściwej c.d

Grubość błony oblicza się przyjmując, że stanowi ona kondensator płaski, zakładając, że wartość stałej dielektrycznej wynosi ၥ = 2,3 do 2,5

Metoda pozwala na pomiar grubości jedynie hydrofobowego „wnętrza” błony bimolekularnej

Znaczenie biologiczne błon bimolekularnych

1. Modelowanie zjawisk transportu (głównie elektrolitów) przez błony biologiczne

Modyfikatory przewodnictwa jonowego błon lipidowych:

1. substancje funkcjonujące wewnątrz błony jako przenośniki jonów. Należą tu niektóre antybiotyki, tj. walinomycyna, nonaktyna, eniatyna i ich pochodne. Tworzą z docierającymi do powierzchni błony kationami kompleksy, które dyfundują w poprzek błony zgodnie z przyłożonym napięciem. Po osiągnięciu drugiej strony błony kompleks rozpada się, a kation przechodzi do fazy wodnej. Oznaczają się selektywnością związaną z różnymi wartościami K dla reakcji tworzenia kompleksów z różnymi jonami.

b) substancje tworzące w błonie komórkowej pory zwane kanałami jonowymi. Do grupy tej należą np. gramicydy, alametycyna, monazomycyna, nystatina, hemocyjanina i in. Tworzone przez nie kanały jonowe odznaczają się brakiem ciągłości w czasie. Ich częstość i czas trwania zmniejsza się wraz ze wzrostem grubości błony. Selektywność jest znacznie mniejsza niż w przypadku przenośników.

2. Modelowanie błon fotosyntetycznych

a) transport elektronów przez błonę pod wpływem światła (fotoprzewodnictwo). Światło powoduje wzbudzenie optyczne cząsteczek chlorofilu, co prowadzi do reakcji redox po obu stronach błony, połączonej z transportem elektronów. Metoda ta umożliwia ponadto pomiary fotoprądu generowanego przez padające na błonę światło, co pozwoliło na zbadanie udziału poszczególnych barwników w zjawisku fotoprzewodnictwa.

2. spektroskopia błon lipidowych połączonych z barwnikami fotosyntetycznymi umożliwiła:

• ustalenie struktury tych błon,

• kierunku wzajemnego oddziaływania na siebie cząsteczek barwników,

• ustalenie, że pierścienie porfirynowe chlorofilu zlokalizowane są na powierzchni błony, tworząc z nią kąt 45°

LIPOSOMY (mikropęcherzyki lipidowe)

• Zamknięte ciągłe powierzchnie złożone z dwóch lub więcej warstw lipidów,

• Rozdzielają dwie fazy wodne,

• Mają kształt kulisty o średnicy od kilkudziesięciu nm do kilkudziesięciu ၭm.

Zalety

• Stabilność,

• Możliwość precyzyjnego określenia składu oraz ciągłego jego kontrolowania w trakcie eksperymentu,

• Duża powierzchnia całkowita,

• Możliwość wykorzystania takich metod badawczych jak: elektroforeza, ultrawirowanie, kolorymetria, fluorescencja, spektrofotometria, magnetyczny rezonans jądrowy, elektronowy rezonans spinowy

Zastosowanie w badaniach biologicznych

• Mechanizm transportu dużych i małych nieelektrolitów przez błony,

• Oddziaływania międzycząsteczkowe (np. w układzie lipid-białko, lipid-antybiotyk)

• Właściwości i mechanizm działania barwników fotosyntetycznych obecnych w błonach.

---