MARKERY NOWOTWOROWE

Test ELISA do oznaczania markerów nowotworowych

Metody immunoenzymatyczne i immunoluminescencyjne najczęściej stosowane metody do oznaczania markerów.

1. Metody immunoenzymatyczne (EIA)

• W metodach EIA wykorzystuje się przeciwciało związane z aktywnym enzymem,

• Znacznikiem jest peroksydaza chrzanowa (najczęściej), rzadziej fosfataza alkaliczna,

β-galaktozydaza, oksydaza glukozy, katalaza, ureaza.

• TMB (tetrametylobenzydyna) lub orto-fenylodiamina (OPD) są substratami dla peroksydazy,

• Dla fosfatazy substratem jest p-nitrofenylofosforan,

• Pomiar - detekcja fotometryczna,

• Chemiluminescencja (immunoluminescencyjne)

Zalety:

• Wysoka czułość i wysoka swoistość,

• Nie wymaga kosztownej aparatury,

• Proste i szybkie w wykonaniu,

• W porównaniu z radioimmunologicznymi metodami nie wymaga izotopów promieniotwórczych.

Klasyfikacja:

• Homogenne (reakcja zachodzi w roztworze),

• Heterogenne (antygen lub przeciwciało związane jest z fazą stałą).

• Kompetencyjne (oznaczany antygen współzawodniczy z innym antygenem o miejsce wiązania z przeciwciałem),

• Niekompetencyjne (nie ma współzawodnictwa).

Testy podział:

1. W zależności co wykrywają:

• Antygen,

• Przeciwciało.

2. Dzieli się na:

• Jakościowe,

• Ilościowe,

• Półilościowe.

3. Mogą być:

• Jednostopniowe,

• Dwustopniowe.

4. Klasyfikacja w zależności od konstrukcji, czułości i swoistości testu, wyróżniamy I, II, III, IV generację.4

Test ELISA (odmiana testu immunoenzymatycznego):

• Test immunoenzymatyczny fazy ciekłej, immunoenzymosorbcyjny,

• Uzyskuje się większą czułość w porównaniu z metodami bezpośrednimi (aglutynacją).

• Unieruchomienie antygenu na fazie stałej zwiększa czułość, oraz zastosowanie do detekcji oznakowanych przeciwciał.

• Czułość metod immunochemicznych:

10^-9 - 10^-6 g/l, 10^-12 - 10^-9 g/ml, pg-ng/ml

Rodzaje testów ELISA:

5 formatów:

1. Test bezpośredni (1 przeciwciało detekcyjne).

2. Test pośredni z podwójnym przeciwciałem detekcyjnym.

3. Tzw. Test „kanapkowy” z przeciwciałem wychwytującym i detekcyjnym.

4. Test pośredni „kanapkowy” z przeciwciałem wychwytującym i podwójnym detekcyjnym.

5. Test konkurencyjny (kompetencyjny).

Ad.1 Antygen jest immobilizowany na płytce, dodaje się przeciwciało znakowane, które go wykrywa. Jest prosty i szybki pod warunkiem, że antygen oznaczany jest wcześniej wyizolowany z materiału biologicznego. Może być mało czuły i swoisty jeżeli antygen nie został wyizolowany i inne substancje białkowe będą reagować tak jak antygen. Wtedy stosuje się test podwójny.

Ad.2 Antygen jest immobilizowany na płytce, przeciwciało I generacji reaguje z antygenem, następnie przeciwciało II ze znacznikiem reaguje z kompleksem antygen przeciwciało I. Bardziej czuły.

Ad.3 Immobilizowane jest przeciwciało wychwytujące, badany antygen jest znakowany enzymem, stosowany jest najczęściej. Bardziej czuły i swoisty niż 2 poprzednie testy.

2 przeciwciała wychwytujące i detekcyjne. Eliminuje to reakcje krzyżowe z innymi antygenami o podobnej budowie, oznaczany antygen nie musi współzawodniczyć o miejsce przyłączania z innym antygenem (przeciwciało wychwytujące jest monoklonalne).

Ad.4 przeciwciało wychwytujące → antygen → przeciwciało I detekcyjne → przeciwciało II detekcyjne z znacznikiem

Ad.5 Istnieje współzawodnictwo

Antygen I znakowany

Przeciwciało wychwytujące

Antygen II nieznakowany

Współzawodniczenie o miejsce wiązania z przeciwciałem. (oznaczane przeciwciało może też współzawodniczyć z innym przeciwciałem o miejsce wiązania na antygenie).

Zastosowanie testów płytkowych:

1. Do oznaczania antygenów

2. Do oznaczania przeciwciał

3. Do oznaczania haptenów

Ad.1 - testy kanapkowe

Dla: hormonów, markerów nowotworowych, markerów sercowych, białek ostrej fazy, cytokin, cząsteczek adhezyjnych oraz antygenów organizmów patogennych.

Ad.2 - faza stała jest opłaszczona antygenem enzymów patogennych

W diagnostyce chorób infekcyjnych, zakażeniach HIV, HBV, HCV i wirusami grypy.

Ad.3 - testy konkurencyjne

Dla: hormonów tarczycy, hormonów steroidowych, leków, metabolitów leków, narkotyków (kontrola dopingowa - jakościowo i ilościowo).

Zasada metody ELISA (oznaczenie CEA)

• Wykonuje się na mikropłytce z 96 dołkami,

• 1 reakcja immunologiczna - do przeciwciał związanych z mikroprobówkami dodajemy antygen z materiału badanego (osocze, surowica). Powstaje na fazie stałej kompleks przeciwciało (wychwytujące) - antygen.

• 2 reakcja immunologiczna - dodajemy przeciwciało znakowane enzymem przeciwko CEA (znakowane peroksydazą chrzanową). Powstaje kompleks przeciwciało -antygen - przeciwciało znakowane enzymem.

• Odpłukanie niezwiązanych przeciwciał znakowanych enzymem.

• Reakcja wskaźnikowa - barwna, dodajemy substrat dla enzymu (tetrametylobenzydynę).

• Zatrzymanie reakcji barwnej przez zakwaszenie środowiska (HCl lub H₂SO₄) - 1N HCl u nas. Tetrametylobenzydyna djae niebieskie zabarwienie, po zakwaszeniu powstaje żółte.

• Mierzy się intensywność zabarwienia za pomocą czytnika mikropłytek, przy odpowiedniej długości fali λ=450nm MULTISKAN

• Obliczanie stężenia badanego antygenu na podstawie krzywej kalibracyjnej, z wykorzystaniem programu komputerowego GENESIS przy odpowiedniej metodzie statystycznej (4 parametrowa funkcja logistyczna lub cubic spline).

CEA - ELISA - zestaw odczynników IBL (RE 591 01)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

S1

S1

U1

U1

U9

U9

U17

U17

U25

U25

U33

U33

B

S2

S2

U2

U2

U10

U10

U18

U18

U26

U26

U34

U34

C

S3

S3

U3

U3

U11

U11

U19

U19

U27

U27

U35

U35

D

S4

S4

U4

U4

U12

U12

U20

U20

U28

U28

U36

U36

E

S5

S5

U5

U5

U13

U13

U21

U21

U29

U29

U37

U37

F

S6

S6

U6

U6

U14

U14

U22

U22

U30

U30

U38

U38

G

C1

C1

U7

U7

U15

U15

U23

U23

U31

U31

U39

U39

H

C2

C2

U8

U8

U16

U16

U24

U24

U32

U32

U40

U40

S1, S2, S3, S4, S5, S6 - surowice wzorcowe (standard)

( 0, 3, 12, 30, 60, 120 ng/ml)

C1, C2 - surowice kontrolne (kontrole)

U1 - U40 - surowice badane

Wykonanie oznaczenia

Odmierzyć po 50 µl surowic wzorcowych, kontrolnych i badanych do dołków mikropłytki

Odmierzyć po 100 µl konjugatu enzymu i przeciwciał do każdego dołka. Mieszać przez 30 sekund

Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej

Wylać zawartość dołków płytki, przemyć 5x wodą destylowaną; osuszyć płytkę na biblue.

Dodać po 100 µl roztworu substratu - TMB do każdego dołka

Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej

Dodać po 100 µl roztworu zatrzymującego reakcję - 1N HCl. Mieszać przez 30 sekund

Pomiar absorbancji przy 450nm w ciągu 15 minut

---