Immunofluorescencyjna lokalizacja białka ZTL i NPH1 w liścieniach siewek Pharbitis nil.
Najważniejszym czynnikiem środowiskowym wpływającym na funkcjonowanie zegara okołodobowego u roślin jest światło. Zegar biologiczny składa się z trzech elementów: drogi wejścia (ang. input), wewnętrznego oscylatora oraz drogi wyjścia (ang. output) (Hayama i Coupland 2004, Salome i McClung 2004). Droga wejścia jest układem związanym z percepcją sygnałów środowiskowych i ich przekazywaniem do wewnętrznego oscylatora. Centralny oscylator działa na zasadzie pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego generując rytmy biologiczne. Droga wyjścia to układ związany z przekazywaniem wygenerowanego rytmu do systemów wykonawczych, kontrolujących rytmiczność określonego procesu (np. ruchy aparatów szparkowych, fotosynteza itp.) (Zienkiewicz i in. 2004).
Pierwszym etapem transdukcji sygnału świetlnego do wewnętrznego oscylatora zegara jest jego percepcja przez wyspecjalizowane cząsteczki chromoprotein pełniące funkcje fotoreceptorów, do których zaliczamy:
receptory światła czerwonego i dalekiej czerwieni - fitochromy
receptory światła niebieskiego - kryptochromy
flawoproteiny z rodziny ZEITLUPE (ZTL/FKF1/LKP2)
receptory światła niebieskiego - fototropiny
Fototropiny (NPH1 - NON PHOTOTROPIC HYPOCOTYL/PHOT1) są kinazami białkowymi aktywowanymi przez światło niebieskie. Białka te zawierają w regionie N-końcowym fragmenty tworzące dwie domeny LOV (ang. LIGHT, OXYGEN, VOLTAGE), należące do klasy domen motywu PAS, odpowiedzialne za interakcje białko - białko. Natomiast w części C- końcowej występuje jedenaście charakterystycznych poddomen obecnych w serynowowo/treoninowych kinazach. Domena LOV występująca w NPH1 wiąże grupę chromoforowi (FMN), która odpowiada za absorbcję światła niebieskiego (Kopcewicz i Lewak, 2002). Jak dotąd wykazano, iż fototropina pośredniczy w reakcjach fototropicznych, migracji chloroplastów oraz otwieraniu aparatów szparkowych (Huala i in., 1997, Briggs i in., 2000, Sullivan i Deng, 2003)
Przygotowanie materiałów i odczynników
Utrwalanie materiału
Organy siewek Pharbitis nil cięto skalpelem na małe fragmenty, a następnie umieszczano w utrwalaczu na okres od 6 do 12 godzin w temp. 4oC. Do utrwalania materiału roślinnego zastosowano roztwór 4% formaldehydu z 0,25% aldehydem glutarowym w buforze 1 x PBS.
Przygotowanie utrwalacza chemicznego: do 20 ml H2O dodawano 2g paraformaldehydu, który rozpuszczano na mieszadle magnetycznym mierząc jednocześnie temperaturę roztworu. Gdy temperatura wzrosła do 55o C dodawano niewielką ilość 1 M NaOH w wyniku czego roztwór stał się klarowny. Następnie roztwór chłodzono i dodawano 0,5 ml aldehydu glutarowego oraz 25 ml buforu 1 x PBS. Powstałą mieszaninę przesączano z wykorzystaniem karbowanego sączka. Po przesączaniu ustalano pH do 7.2 i uzupełniano wodą do 50 ml.
Zatapianie materiału w żywicy BMM
Utrwalony materiał odpłukiwano w trzech zmianach 1 x PBS, każda po 10 minut, następnie materiał odwadniano w serii etanolu z dodatkiem DTT w stężeniu 0,015g na 1 ml etanolu.
Po odwodnieniu materiał przesycano żywicą BMM, którą przygotowywano w następujący sposób. Do 20 ml metakrylanu butylu dodawano 5 ml metakrylanu metylu, 125 mg 2-Ethoxy-2-phenylacetophenon oraz 0,0385g DTT. Mieszaninę przesycano następnie azotem gazowym przez ok.15 min. Następnie z żywicą szczelnie zamykano i przechowywano w temp. 4o C.
Przesycanie materiału żywicą BMM przebiegało kilkuetapowo poprzez umieszczanie materiału w każdym z przygotowanych roztworów na 24 godziny w 4oC:
- 25% roztwór BMM w alkoholu bezwodnym 99,8%,
- 50% roztwór BMM w alkoholu bezwodnym 99,8%,
- 75% roztwór BMM w alkoholu bezwodnym 99,8%,
- 100% roztwór BMM.
Przesycony żywicą materiał przenoszono do UV - odpornych kapsułek typu BEEM
firmy Polyscience i zatapiano w 100% żywicy BMM. Polimeryzację żywicy prowadzono w świetle UV w temp. -20oC przez 48h.
Przygotowanie półcienkich skrawków
Utrwalony i zatopiony w żywicy BMM materiał krojono na półcienkie skrawki (1500 nm) przy użyciu ultramikrotomu Leica UTC. Skrawki umieszczano na pokrytych silanem szkiełkach podstawowych.
Materiały do ćwiczeń
Kuwetki szklane, szkiełka podstawowe i nakrywkowe, wilgotna komora,
100% aceton
Bufor 1 x PBS pH 7,2 ( na 1000 ml: 8g NaCl; 0,2g KCl, 1,44g Na2HPO4; 0,24g KH2PO4)
Woda bidestylowana
Roztwory przeciwciał:
- pierwotne przeciwciało królicze anty-NPH1 (stężenie 1:250, 1 μl przeciwciała na 250 μl 1% BSA w 1 x PBS),
- wtórne przeciwciało anty-króliczym IgG znakowane fluorochromem Alexa Fluor 488 ( stężenie 1:500, 1 μl przeciwciała na 500 μl 1% BSA w 1 x PBS),
DAPI,
Antyfadant CitiFluor
Immunofluorescencyjna lokalizacja białka fototropiny NPH1
Dzień I.
Odpłukiwanie żywicy BMM
Przygotować 5 szklanych kuwetek. Do dwóch nalać 100% aceton, do jednej wody bidestylowanej i do dwóch buforu PBS.
Szkiełko podstawowe z materiałem roślinnym umieścić w kuwetce wypełnionej 100% acetonem na okres 10 min.
Przenieść (przy pomocy pęset) szkiełko podstawowe do drugiej kuwetki z acetonem na 10 min.
Przenieść szkiełko podstawowe do kuwetki z wodą bidestylowaną na 5 min.
Wylać wodę, nalać świeżej wody bidestylowanej i inkubować przez 5 min.
Przenieść szkiełko podstawowe do kuwetki z 1 x PBS na 5 min.
Przenieść szkiełko podstawowe do drugiej kuwetki z buforem 1 x PBS na okres 5 min.
Inkubacja z przeciwciałami pierwotnymi
Szkiełko podstawowe z materiałem roślinnym położyć na brzegu szklanej kuwetki (sprawdzić czy materiał roślinny jest na górze!!!), do kuwetki nalać niewielką ilość wody bidestylowanej, w celu zwiększenia wilgotności powietrza.
Nałożyć na szkiełko 30 μl (na materiał roślinny) roztworu pierwotnego przeciwciała króliczego anty-NPH1. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
Szkiełko podstawowe z kuwetką umieścić w wilgotnej komorze (pudełko plastikowe wyłożone ręcznikiem papierowym zwilżonym wodą), szczelnie zamknąć i pozostawić na noc w temperaturze 4oC.
Dzień II.
Odpłukiwanie przeciwciał pierwotnych
Wyciągnąć kuwetkę ze szkiełkiem podstawowym z wilgotnej komory,
Na szkiełko nałożyć 1 ml buforu 1 x PBS, gdy szkiełko nakrywkowe podniesie się zrzucić energicznym ruchem szkiełko nakrywkowe ze szkiełka podstawowego,
Umieścić szkiełko podstawowe ponownie na brzegu kuwetki (materiałem roślinnym do góry!!!)
Nałożyć na szkiełko 1 ml buforu 1 x PBS i inkubować 10 min.
Odsączyć bufor ze szkiełka (poprzez przyłożenie szkiełka dłuższym bokiem pod kątem prostym do bibuły), następnie umieścić szkiełko podstawowe ponownie na kuwetce.
Nałożyć na szkiełko 1 ml buforu 1 x PBS i inkubować 10 min.
Odsączyć bufor ze szkiełka i nałożyć 1 ml buforu 1 x PBS - inkubować 10 min.
Inkubacja z przeciwciałami wtórnymi
Odsączyć bufor 1 x PBS, szkiełko podstawowe z materiałem roślinnym położyć na szklanej kuwetce (sprawdzić czy materiał roślinny jest na górze!!!), do kuwetki nalać niewielką ilość wody bidestylowanej.
Nałożyć na szkiełko 30 μl (na materiał roślinny) roztworu wtórnego przeciwciała anty-króliczego IgG znakowanego fluorochromem Alexa Fluor 488. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
Szkiełko podstawowe z kuwetką umieścić w wilgotnej komorze, szczelnie zamknąć i pozostawić na 1 godz. w temp. 37oC.
Odpłukiwanie przeciwciał wtórnych
Wyciągnąć kuwetkę ze szkiełkiem podstawowym z wilgotnej komory.
Na szkiełko nałożyć 1 ml buforu 1 x PBS, gdy szkiełko nakrywkowe podniesie się zrzucić energicznym ruchem szkiełko nakrywkowe ze szkiełka podstawowego,
Umieścić szkiełko podstawowe ponownie na kuwetce (materiałem roślinnym do góry!!)
Odpłukać nadmiar przeciwciała wtórnego (w ten sam sposób jak w punkcie 1) poprzez inkubację 3 x 10 min. w buforze 1 x PBS.
Następnie 3 x 5 min. wodą bidestylowaną.
Wizualizacja DNA
Odsączyć wodę bidestylowaną, szkiełko podstawowe z materiałem roślinnym położyć na szklanej kuwetce (sprawdzić czy materiał jest na górze!!!),
Na szkiełko podstawowe nałożyć 30 μl barwnika DAPI i inkubować przez 10 min
Odpłukać DAPI przez nałożenie na szkiełko na 5 min 1 ml buforu 1 x PBS.
Nałożenie roztworu przedłużającego efekt fluorescencji (antyfadant)
Odsączyć bufor 1 x PBS bardzo dokładnie za pomocą bibuły, szkiełko podstawowe z materiałem roślinnym położyć na szklanej kuwetce (sprawdzić czy materiał roślinny jest na górze!!!),
Nałożyć 15 μl roztworu antyfadantu CitiFluor, przykryć szkiełkiem nakrywkowym.
Tak przygotowane preparaty można przechowywać w temp. - 20oC przez okres ok. tygodnia
Obserwacja wyników w mikroskopie fluorescencyjnym
DAPI -świecenie niebieskie
Fluorochrom Alexa Fluor 488 - świecenie zielone
Autofluorescencja chlorofilu - świecenie czerwone