Bibioteka genomowa: kolekcja fragmentow DNA danego osobnika wprowadzona do okreslonego wektora i klonowana w komórkach gospodarza

Etapy tworzenia biblioteki genomowej:

-izolacja dna z komorek organizmu, dla ktorego bedzie tworzona biblioteka

- trawienie wyizolowanego dna i wybranego wekrtora enzymem restrykcyjnym

- utworzenie zrekombinowanych wektorow

- transformacja komorek gospodarza (bakterie, drozdze)

- wprowadzenie klonow

Czym jest biblioteka genomowa BAC? : BAC- sztuczne chromosomy bakteryjne, konstrukcja oparta na plazmidach typu F naturalnie wystęoujących w komorkach E. coli

Zaleta - mozliwosc klonowania duzych fragmentow do 300Kb

Wykorzystanie biblioteki genomowej: poznawanie sekwencji genomu, identyfikacja fragmentow dna ktore zawieraja znzne sekwencje dna np: sekwencje powtarzalne (mikrosatelity)m sekwencje znanego markera genetycznego, ktory jest sprzezony z nieznanym, poszukiwanym gene,m, mapowanie fizycvzne sklonowanych insertow, o ktorych wiadomo jaki gen zawieraja

Biblioteka cDNA: kmolekcja czateczek cDNA zawierajaca wszystkie czasteczki mRNA pochodzace z oikreslonych konmorek porzypisane przy pomocy odwrotnej transkryptazy na komplementarny DNA

Retrowirusy- wirusy w ktorych genom jest zbudowany z RNA

cDNA (komplementarny DNA): enzym odwrotna transkryptraza wystepuje w genomie retrowirusów: przepisanie RNA na sekwencję jednoniciową DNA, dobudowywanie komplementarnego lancucha --> powstanie dwuniciowego cDNA (enzym polimeraza DNA)

w komorkach eukariotycznych na bazie matrycowego DNA (eksony+introny): powstaje dojrzaly mRNA (zawiera jedynie eksony), na matrycy dojrzalego mRNA mozna zsyntetyzowac cDNA ktory reprezentuje jedynie sekwencje eksonów

czyli cdna powstaje na matrycy mrna czyli odpowiada tym fragmentim dna ktore podlegaly eksporesji w danej komorce , tkance lub organie, totez uzyskamy rozne cdna w zaleznosci czy pobralismy z tkanki nablonkowej czy nnerwowej.

etapy tworzenia biblioteki cDNA:

- izolacja mRNA

- odwotna transkrypcja i synteza dwuniciowych fragmentow cDNA

-urtworzenie zrekombinowanych wektorów

- transformacja komorek gospodarza

-wyprowadzenie klonów

wykorzystanie biblioteki cDNA: identyfikacja genow, ktorytch ekspresja ma kluczowe znaczenie dla danej komorki, tkanbki lub organu,, identyfikacja wariantopw transkrypcyjnych nokreslonego genu,m bedacych efektrem alternatywnego wycinania intronow lub redagowania mRNA

Porównanie biblioteki genomowej i cDNA: biblioteka genomowa zawiera kolekjcjue fragm. DNA reprezentuje caly genom danego gatunku, biblioteka CDNA zawiera kolekcjne fragm. DNA która odzwierciedla aktywność transkrypcyjną w danej tkance, organie itp.

Dla danego gat można stworzyć jedna bibliotekę genomową i wiele bibliotek cDNA

Analiza genomu przy pomocy technik hybrydyzacyjnych (southern blotting, hybrydyzacja in situ)

Hybrydyzacja kwasow nukleinowych: utworzenie dwuniciowej hybrydy poprzez komplementarne polaczenie dwóch polinukleotydów

Zastosowanie: poszukiwanie określonej sekwencji przy pomocy sondy

Sonda: sklonowany lub zamplifikowany frgament DNA, który może być wykorzystany do poszukiwania komplementarnego fragmentu na drodze hybrydyzacji

Hybrydyzacja DNA-DNA: hybrydyzacja metodą southerna (wyizolowane DNA)

Hybrydyzacja typu in situ (na preparatach cytogenetycznych jak chromosomy, jadra komórkowe, na preparatach histologicznych)

Hybrydyzacja metodą southerna: poszukiwanie określonej sekwencji nukleotydowej przy pomocy wyznajkowanej sondy w DNA (genomowym lub cDNA) poddanemu trawieniu endonukleazami i rozdzieleniu elektroforetycznie

Dna trawione jest enzymami które nie przecinają sekwencji powtarzających się

Wykorzystanie: identyfikacja osobnicza – odcisk palca DNA

Etapy hybrydyzacji metodą southerna: izolacja dna, trawienie enzymem restrykcyjnym, elektroforeza, przeniesienie rozdzielonego dna na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy, znakowanie sondy, denaturacja dna na filtrze i dna sondy, naniesienie sondy na filtr, nałożenie kliszy radiograficznej, wywołanie kliszy(detekcja miejsc gdzie zaszla hybrydyzacja)

DNA fingerprinting: hybrydyzacja metodą southerna z wykorzystaniem sondy dla sekwencji potarzajacych się tandemowo, stosujemy np. sondy Jeffreysa i inne

Analiza wielopunktowa tzn analiza wielu loci, w ktotych wystepuje sekwencja powtrarzajaca się tandemowo , porownuje się układ prazkow ktory jest praktycznie niepowtarzalny (odcisk palca dna)

Hybrydyzacja in situ: rodzaje: izotopowa (radioaktywna)- niestosowana oraz najczęściej stosowaną wersję FISH (znakowanie fluorescencyjne)

Hybrydyzacja DNA-DNA na preparacie chromosomowym: uzyskanie preparatu mikroskopowego np. z hodowanych in vitro limfocytow, znakowanie sklonowanej sondy, denaturacja sondy oraz chromosomow, naniesienie zdenaturowanej sondy na preparat, renaturacja i hybrydyzacja , detekcja w mikroskopie miejsca hybrydyzacji

FISH – denaturacja sondy i chromosomow, hybrydyzacja sondy z chromosomami, obserwacja miejsca hybrydyzacji, identyfikacja chromosomu