LABORATORIUM 3

Temat: WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK I KWASÓW NUKLEINOWYCH. REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE.

Zadanie 1. Wykrywanie aminokwasów w reakcji z ninhydryną.

Przebieg:

Do probówek odmierzono po 1 ml:

• 1 % hydrolizatu białka,

• 1% roztworu glicyny,

• 1% roztworu proliny,

• 1% roztworu żelatyny.

Następnie do wszystkich probówek wlano po 0,5 ml etanolowego roztworu ninhydryny.

Ogrzewano przez 3 minuty we wrzącej łaźni wodnej.

Po zakończeniu reakcji pojawiła się intensywne zabarwienie:

-Hydrolizat białka: fioletowe

-Glicyna: fioletowe

-Prolina: żółte

- Żelatyna: jasnoniebieskie

Wnioski:

Białko wykryto w probówce z żelatyną, o czym świadczy jasnoniebieska barwa. Aminokwasy występują w hydrolizacie białka, glicynie oraz prolinie o czym świadczy fioletowa barwa.

Reakcja aminokwasów z ninhydryną jest wykorzystywana do jakościowego i ilościowego oznaczania aminokwasów i wolnych grup NH₃. Aminokwasy reagują z ninhydryną przy wartościach pH powyżej 4, dając produkty o barwie niebieskofioletowej. Intensywność barwy jest proporcjonalna do zawartości wolnych grup α- NH₃ w próbie. W reakcji bierze udział zarówno grupa aminowa jak i karboksylowa. Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu- poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu uboższego
o 1 atom węgla. Następnie w wyniku kondensacji 2 cząsteczek ninhydryny: zredukowanej
i utlenionej z amoniakiem powstaje fioletowoniebieskie zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu α- aminowego aminokwasów. Dwa aminokwasy, prolina i hydroksyprolina nie posiadają wolnych grup NH₃, reagują więc inaczej niż pozostałe, dając produkt o barwie żółtej.

Zadanie 2. Wykrywanie białek i aminokwasów aromatycznych metodą

ksantoproteinową.

ZAPYTAC SANDRE :P

Zadanie 3. Wytrącanie białek jonami metali ciężkich.

Jeżeli wartość pH jest większa od pI, cząsteczki białka stają się anionami i mogą reagować z kationami. Kationy metali ciężkich (Fe³⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺) dają z białkami nierozpuszczalne kompleksy, powodując duże zmiany strukturalne w obrębie cząsteczki białka. Wytrącają się osady denaturowanego białka nierozpuszczalne w wodzie ani
w nadmiarze soli.

Przebieg

Do dwóch probówek odmierzono po 1ml 0,2% roztworu albuminy.

Do 1 probówki - dodano parę kropel octanu ołowiu

Do 2 probówki - dodano parę kropel chlorku rtęciowego

W probówce z octanem ołowiu powstał osad i było zauważalne zmętnienie.

W probówce z chlorkiem rtęciowym jest zauważalne zmętniene.

Wnioski

W probówce, w którym znajdował roztwór albuminy z octanem ołowiu pH było większe od pI, ponieważ wytrącił się osad denaturowanego białka. W drugiej probówce tj. chlorek rtęci połączony z roztworem albuminy wystąpiło zmętnienie, z którego można wywnioskować, że wartość pH nie jest wystarczająco wysoka, ponieważ białko nie uległo denaturyzacji w stopniu umożliwiającym powstanie osadu.

Zadanie 4. Wytrącanie białek etanolem.

Rozpuszczalniki organiczne, w tym etanol czy aceton, powodują dehydratację otoczki wodnej wokół cząsteczki białka zmniejszając tym samym jej rozpuszczalność (wypadanie białka z roztworu) oraz wywołując zmiany denaturacyjne w jej obrębie. Jeżeli rozpuszczalniki te działają krótko i w niskiej temperaturze (poniżej 0 ), białko nie ulega denaturacji i można je rozpuścić. Wytrącanie w temperaturze pokojowej przy długotrwałym działaniu rozpuszczalników organicznych, prowadzi do denaturacji białka i staje się ono nierozpuszczalne.

Przebieg:

Do dwóch probówek odmierzono po 2 ml etanolu i dodano po 0,5 ml roztworu białka jaja kurzego. Do jednej probówki natychmiast po wytrąceniu osadu dodano 10 ml wody, a drugą probówkę pozostawiono na 30 minut. Po tym czasie dodano do niej również 10 ml wody.

W pierwszej probówce na powierzchni roztworu utworzyła się otoczka.

W drugiej probówce badana próba zmętniała poprzez wytworzenie się drobinek białka. Otoczka się nie pojawiła.

Wnioski:

W pierwszej probówce etanol rozcieńczony woda spowodował denaturacje białka, przez co stało się ono nierozpuszczane.

W drugiej probówce białko nie uległo denaturacji, ponieważ etanol miał krotki czas działania.

Zadanie 5. Wysalanie białek

Przebieg:

Do probówki odmierzono 2 ml roztworu białka jaja kurzego i dodano 2 ml

nasyconego roztworu siarczanu amonowego. Wytrącił się kłaczkowaty osad globulin. Następnie dodano około 10 ml wody. Osad ulegl rozpuszczeniu.

Do 50 ml erlenmajerki odmierzono 10 ml roztworu białka jaja kurzego

i dodano 10 ml nasyconego roztworu siarczanu amonowego . Wytrąceniu ulegly globuliny.

Próbę przesączono przez sączek bibułowy do suchej probówki.

Pobrano 2 ml przesączu i dodawano małymi porcjami siarczan amonowy
w substancji do uzyskania nasyconego roztworu aż na dnie probówki pozostanie kilka nierozpuszczonych kryształów siarczanu amonu.
W tych warunkach wypadają wysolone albuminy w postaci kryształków.

Wytrącony osad albumin zebrano na sączku bibułowym a otrzymany przesącz zbadano w celu stwierdzenia obecności białek. W tym celu do przesączu należało dodać kroplę 1 % kwasu octowego i wstawić do wrzącej łaźni na parę minut. Po ostudzeniu probówki zauważono wytrącenie się białek.

Wnioski:

?