Główny dogmat genetyki i biologii molekularnej (F.Crick 1957): DNA – RNA – białko

Odstępstwa

- DNA – RNA (RNA pełni funkcję białka)

- RNA – DNA (retrowirusy)

Gen - region DNA, który określa dziedziczoną cechę organizmu; zwykle koduje pojedyncze RNA lub białko. Zawiera całą funkcjonalną podjednostkę wraz z sekwencją kodującą, niekodującymi sekwencjami regulatorowymi DNA oraz z intronami.

(definicja niedoskonała, trudno jednoznacznie zdefiniować gen)

Wyjątki definicji genu jako jednostki kodującej transkrypt

• geny kodujący rybosomowe RNA (18S; 5,8S; 28S) są transkrybowane w postaci pre-rRNA 45S, następnie zachodzi rozcinanie cząsteczki RNA na fragmenty odpowiadające poszczególnym rodzajom rRNA

• trans-splicing: Istnieją geny ‘ w kawałkach’. Transkrypt pochodzący z jednego fragmentu jest łączony z transkryptem z innego fragmentu, aby mógł powstać funkcjonalny RNA.

• geny nakładające się: Niektóre ‘geny’ nakładają się. Oznacza to, że pojedynczy fragment DNA może być częścią dwóch lub nawet trzech genów.

• redagowanie RNA: Niekiedy pierwotny transkrypt ulega intensywnemu redagowaniu zanim stanie się transkryptem funkcjonalnym. W najbardziej skrajnych przypadkach dochodzi do wstawiania lub usuwania nukleotydów. Oznacza to, że zawartość informacyjna ‘genu’ jest niepełna dla zapewnienia jego funkcjonalności i musi być uzupełniona z udziałem innych ‘genów’

Pojęcie ekspresji genów- wyprodukowanie funkcjonalnego białka lub RNA na podstawie zakodowanej informacji

• tradycyjne termin ten obejmował dwa etapy: transkrypcja i translacja

• współczesne obejmuje również: zmiany w strukturze chromatyny, dojrzewanie RNA, transport RNA, degradacje RNA, inicjacje translacji, zwijanie białka, zmiany potranslacyjne białka, degradacje białka

U Eukariontów tylko translacja (z mRNA na białko) ma miejsce w cytoplazmie!

Nić sensowna 5’3” (kodująca lub niematrycowa)

Cały RNA:

1. kodujący 4%

- pre-mRNA (hnRNA) i mRNA

1. niekodujący 96%

- pre-rRNA i rRNA

- pre-tRNA i tRNA

- snRNA

- snoRNA

- scRNA

- siRNA i miRNA - ekspresja genów

Transkrypcja wymaga:

• rybonukleozydotrifosforanów (ATP, GTP, UTP,CTP)

• matrycy – nić antysensowna DNA

• enzymu – polimeraza RNA

Cechy charakterystyczne:

• nie wymaga startera

• synteza w kierunku 5’ →3’

Polimeraza RNA zależna od DNA – enzym, który rozplata DNA, katalizuje polimeryzację RNA na matrycy DNA, a następnie łączy ponownie obie nici DNA

Jednostka transkrypcyjna – od promotora do temrinatora

Etapy transkrypcji na przykładzie bakterii:

Holoenzym RNA polimerazy

1. Wiązanie do promotora; kompleks zamknięty

2. Rozplatanie DNA; kompleks otwarty

3. Synteza krótkich fragmentów RNA

4. Rozpoczęcie elongacji

5. Faza szybkiej elongacji [50 nukl/s u bakterii]

6. Pojawienie się sygnału terminacji

7. Terminacja

Polimeraza (I, II lub III) może przyłączyć się bezpośrednio lub pośrednio (przez platformę utworzoną z białek wiążących DNA)

Orientacja polimerazy RNA względem DNA wyznacza kierunek transkrypcji i sekwencję powstałego RNA

Porównanie polimerazy RNA bakteryjnej i eukariotycznej

Prokariotyczna pol RNA	Eukariotyczna pol RNA
4 podjednostki: α,β,β’ + 1 białko dodatkowe (sigma) – holoenzym α – uczestniczy w wiązaniu RNA polimerazy z promotorem β – centrum katalityczna; ma 2 domeny jedna uczestniczy w inicjacji transkrypcji, druga w elongacji β’ – odpowiedzialna za wiązanie z DNA	12 podjednostek
czynnik δ – odpowiedzialny za rozpoznawanie promotora	wymaga wielu tzw. ogólnych czynników transkrypcyjnych
	Zn – stanowią element strukturalny polimerazy

Rejon promotorowy genu obejmuje podstawowy promotor i znajdujące się blisko elementy regulatorowe, do których przyłączą się czynniki transkrypcyjne

Promotor podstawowy - zawiera miejsce startu transkrypcji i miejsce wiązania kompleksu preinicjacyjnego, w którego skład wchodzą ogólne czynniki transkrypcyjne i polimeraza RNA.

Inicjacja transkrypcji u eukariontów wymaga polimerazy RNA II oraz ogólnych czynników transkrypcyjnych – powstawanie kompleksu inicjującego transkrypcję

Kasetę TATA (przed el. inicjatorowym) rozpoznaje i wiąże pierwszy ogólny czynnik transkrypcyjny TFID (wł. TBP). Następnie dołączają się następne czynniki wraz z polimerazą RNA tworząc kompleks inicjujący transkrypcję

TFIIH z udziałem ATP fosforyluje polimerazę RNA zmieniając jej konformację tak, e polimeraza uwalnia się z kompleksu i rozpoczyna transkrypcję.

mRNA musi wejść do cytoplazmy (zabezpieczenie), czyli czapeczkowanie!

Polimeraza RNA II wymaga do inicjacji transkrypcji także specyficznych czynników transkrypcyjnych (aktywatorów), mediatorów oraz enzymów modyfikujących chromatynę

Wczesny etap elongacji przez polimerazę RNA II u eukariontów – rola fosforylacji domeny CTD oraz przyłączenie czynników elongacyjnych

CTD (domena C-końcowa, ang. C-terminal domain)

• największa podjednostka Pol II RNA

• zbudowana z ok. 52 powtórzeń heptapeptydowych o sekwencji zgodnej Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser

• inicjacja transkrypcji zachodzi gdy domena CTD nie jest ufosforylowana, natomiast elongacja wymaga ufosforylowania w pozycji 2 Ser w każdym powtórzeniu heptapeptydowym

Rola czynników elongacyjnych:

• stabilizacja pol RNA na matrycy

• pomoc w przejściu przez strukturę chromatyny

• pomoc w pokonaniu skręceń DNA

Transkrypcja i obróbka RNA są sprzężone

• na poszczególnych etapach tworzą się kompleksy różnych białek z polimerazą RNA:

- inicjacja/ synteza czapeczki

- elongacja/ splicing

- termiancja/ poliadenylacja

• kluczowym obszarem jest C-koniec polimerazy II (CTD) – regulacja przez fosforylację

Obróbka mRNA:

1. czapeczka (m7GpppN, 7-metyloguanozyna) na końcu 5’

2. wycinanie intronów – składania (splicing)

3. poliadenylacja końca 3’

4. transport z jądra do cytoplazmy

5. degradacja

6. przycinanie (rRNA i tRNA)

7. modyfikacje chemiczne (rRNA, tRNA)

Modyfikacje końca 5’ transkryptu (czapeczkowanie) odbywa się tuż po inicjacji transkrypcji.

Defosforylacja i 2x metylacja to czapeczkowanie.

Fosfataza, transferaza guanylowa, metylaza przyłączają się do foso-Ser5 (TFIIH) w domenie CTD pol RNA [ pol I i III, brak CTD, brak czapeczkowania]

Funkcje czapeczki:

• ochrona mRNA przed degradacją

• wzmacnia efektywność splicingu

• umożliwia eksport mRNA z jądra

• inicjacja translacji mRNA (bez czapeczki się nie rozpocznie)!

WYKŁAD 2

Splicing to proces, w którym w ściśle określonych miejscach w obrębie połączenia intron – egzon z prekursorowego RNA usuwane są introny, natomiast końce pozostałych fragmentów RNA są łączone i tworzą ciągłe cząsteczki

Reakcja splicingu:

1. Atak nukleofilowy, inicjowany przez grupę 2’-OH, wypętlonego, wewnętrznego nukleotydu adenozyny(A), znajdującego się w obrębie intronu

2. Dochodzi do rozcięcia RNA w miejscu splicingowym 5’, wolny koniec 5’ intronu zostaje kowalencyjnie przyłączony do adeniny i powstaje nowe wiązanie 2’-5’fosfodiestrowe.

3. Drugi atak nukleofilowy skierowany jest na miejsce splicingowe 3’, a katalizowane jest przez grupę 3’-OH z końca odciętego egzonu poprzedzającego intron.

Splicosom to 5 kompleksów RNA-białko, określanych jako snRNP. SnRNP tworzą snRNA wraz z przynajmniej 7 białkami. Zostały one nazwane U1, U2, U4, U5, U6 snRNA

Maszyneria splicosomu wiąże się z traskryptem jeszcze podczas trwania transkrypcji, a wiązanie to stymuluje kompleks białek wiążących się z Capem na końcu 5’ mRNA.

Sekwencje i czynniki wzmacniające/ hamujące splicing:

ESE (Exonic Splicing Enhancer) + aktywator składania

ESS (Exonic Splicing Silencer) + represor składania

Białka regulatorowe splicingu:

• białka SR [bogate w Ser (S) i Arg (R)] – aktywatory, wiążą ESE i przyciągają U1 snRNP oraz U2AF do miejsc splicingowych

brak białka SR powoduje, ze czapeczka nie powstanie!!!

Przyłączenie białek SR przyczynia się do prawidłowego naprowadzenia snRNPs na granice intronu / eksonie (znaczą one 3’ i 5’ miejsca splicingowe na 5’ końcu powstającego RNA) i zapobiegają błędom splicingu

• białka hnRNP (heterogenous nuclear ribonucleoproteins) – represory, wiążą ESS

3 typy spliceosomów:

• MAJOR – podstawowy splicing; bierze udział cząsteczka U5

• U12-type – 0,1% transkryptów; budują go 4 cząsteczki snRNP (U11, U12, U4atac, U6atac) + cząsteczka U5

• TRANS – trypanosoma (wszystkie mRNA), nicienie (1%), eugleniny

Znane są również dwie klasy intronów „samo-splicingujących się” bez udziału białek spliceosomów, np.:

• jądrowe rRNA geny u orzęsków Tetrahymena

• niektóre geny mitochondrialne i chloroplastowe

• kilka genów u bakteriofaga T4

Terminacja transkrypcji połączona jest z poliadenylacją końca 3’ mRNA u eukariontów

• prawie wszystkie eukariotyczne mRNA mają serię 50-250 adenozyn na końcach 3’

• koniec poli(A) niezbędny do terminacji transkrypcji, transportu mRNA z jądra do cytoplazmy , decyduje o stabilności transkryptu (chroni przed nukleazami) i efektywności jego translacji oraz o degradacji mRNA po zakończeniu translacji.

Poliadenylacja

- dotyczy większości mRNA, z wyjątkiem tych kodujących histony

- mRNA histonów stabilne w fazie S, pod koniec szybko degradowane – synchroniczna regulacja

Mechanizm poliadenylacji końca 3’ mRNA

Koniec 3’ mRNA powstaje w wyniku cięcia endonukleolitycznego pre–mRNA pomiędzy motywem zachowawczym AAUAAA a sekwencją bogatą w G/U , które są od siebie oddalone o ok. 20 nukleotydów. Pomiędzy znajduje się sekwencja CA niezbędna dla etapu cięcia.

Rejon AAUAAA rozpoznawany jest przez specyficzny czynnik cięcia i poliadenylacji (CPSF), natomiast drugi rejon bogaty w G/U rozpoznawany jest przez drugi czynnik stymulujący cięcie CstF. Dodatkowo u ssaków zaangażowane w cięcie są dwa wielopodjednostkowe kompleksy , czynnik cięcia I i II (CFIm, CFIIm).

Oba czynniki cięcia CPSF i CstF podróżują/poruszają się wraz z polimerazą RNA.

Gdy pojawią się specyficznych sekwencji nukleotydowych na pojawiające cząsteczka RNA, CstF i CPSF wiążą się do nich i następuje rekrutacja pozostałych bialek, aby utworzyć koniec 3’ mRNA. Nastepuje cięcie, a następnie po uwolnieniu konca 3’ jest on poliadenylowany

Poliadenylacje przeprowadza polimeraza PAP, substratem dla PAP jest ATP . Polimeraza PAP w odróżnieniu od polimeraz RNA nie wymaga matrycy, stąd poliA ogon eukariotycznych mRNA nie jest bezpośrednio kodowany w genomie.

Wydłużanie ogona poliA

PABN bierze udział w syntezie poliA, zwiększając aktywność polimerazy PAP i określa długość nowo syntetyzowanego ogona. Koniec gdy PAP utraci kontakt z CPSF

Degradacja RNA

• stała (obrót RNA)

- głównie w cytoplazmie

• regulowana

- przez małe RNA (siRNA,miRNA)

- przez białka

- cytoplazma i jądro

• kontrola jakości

- w jądrze (RNA niekodujące)

- w jadrze i cytoplazmie (mRNA)

Transkrypcja genów rRNA

Geny kodujące rRNA (18S, 5,8S, 26S) są wysoce homologiczne i wykazują podobieństwo nawet między odległymi ewolucyjnie organizmami. Natomiast regiony ITS ewoluowały znacznie szybciej i wykazują duże zmiany w długości i zawartości zasad GC pomiędzy odległymi eukariontami

5SRNA nie podlega modyfikacjom

Modyfikacje chemiczne i nukleolityczne cięcia prekursorowego 45S rRNA

• nukleotydy, które mają zostać zmetylowane, są wyznaczane poprzez tworzenie par z komplementarnymi zasadami w odpowiednich rejonach snoRNA

• tworzenie par nie zachodzi na całej długości snoRNA, a dotyczy jedynie kilku nukleotydów

• dla każdej zmodyfikowanej pozycji nukleotydowej w pre-rRNA istnieją odmienne snoRNA

Modyfikacje chemiczne rRNA

Jedynie część snoRNA powstaje w wyniku transkrypcji standardowych genów snoRNA, większość natomiast jest kodowana przez sekwencje znajdujące się w obrębie intronów licznych genów i zostaje uwolniona poprzez cięcie intronów po zakończeniu procesu ich wycinania

Ultrastruktura jąderka

• gęsty składnik fibrylarny – DFC

• składnik ziarnisty – GC

• centrum fibrylarne - FC

- struktura choinki – obraz transkrypcji genów rRNA

- jąderko pojawia się i znika w każdym cyklu komórkowym

Dojrzewanie tRNA – przycinanie końców oraz endonukleolityczne wycięcie intronu odbywa się w jąderku.

Podobnie jak większość innych eukariotycznych RNA, tRNA muszą być zmodyfikowane przed ich

wyjściem z jądra. Eukariotycznych tRNA są syntetyzowane przez polimerazę RNA III. Oba bakteryjne i eukariotycznych tRNA są zwykle syntetyzowane jako dłuższe tRNA prekursorowe, które jest następnie przycinane do wytworzenia dojrzałego tRNA. Ponadto, niektóre prekursory tRNA (z obu bakterii i eukariotów) zawierają introny, które muszą być wycinany. Reakcja ta różni się chemicznie od splicingu pre-mRNA; zamiast generowania lassą, tRNA składanie wykorzystuje mechanizm wycinania i wklejania, który jest katalizowane przez białka

• 10% nukleotydów w tRNA podlega 50 różnym modyfikacjom

WYKŁAD 3 – translacja

Cząsteczki tRNA dopasowują aminokwasy do kodonów w mRNA

Trzecia pozycja w kodonie zwana jest chwiejną (wobble). Może ona tworzyć parę z każdą z zasad przedstawionych w drugiej kolumnie sąsiedniej ilustracji. Tak więc jeśli w chwiejnej pozycji antykodonu występuje zasada inozyna (I) taki tRNA bakteryjny może rozpoznać trzy różne kodony. W pierwszej i drugiej pozycji kodonu tworzą się tylko klasyczne pary zasad.

Zdegenerowanie kodu genetycznego powoduje, że jeden aminokwas może być prezentowany przez kilka różnych tRNA lub jeden tRNA rozpoznaje kilka kodonów dzięki regule „chwiejności” („wooble”) w 3 poz. kodonu

Aminoacylacja tRNA

Za rozpoznanie i przyłączenie odpowiedniego aminokwasu odpowiedzialny jest enzym syntetaza aminoacylo-tRNA, która kowalencyjnie łączy każdy aminokwas z jego odpowiednią cząsteczkę tRNA. Większość komórek ma różne enzym syntetazy aminoacylo-tRNA dla każdego aminokwasu (to jest 20 syntetaz w sumie)

1. Aminokwas, podczas reakcji z ATP, podlega adenylacji (przyłaczany jest do niego AMP- powstaje aminoacyloadenylan), a równocześnie zostaje uwolniony pirofosforan. Grupa karboksylowa aminokwasu połączona jest z grupą fosforanową AMP za pomoca wysokoenergetycznego wiązania estrowego.

2. Uwolnienie AMP a aminokwas jest przenoszony na 3‘ koniec tRNA i wiązany jest przez syntazy aminoacylo-tRNA

Odczytanie kodu genetycznego jest dwustopniowe i wymaga dwóch adaptorów

Podstawą reakcji syntezy białka jest tworzenie wiązania peptydowego pomiędzy grupą karboksylowa na końcu rosnącego łańcucha polipeptydowego a grupą aminową (przychodzącego) dołączanego aminokwasu. Białko syntetyzowane jest się stopniowo od N-końca do jego C-końca

Informacja zawarta w mRNA jest dekodowana w rybosomach

Proces translacji 2aa/s

• do wolnego miejsca A przyłącza się amnioacylo-tRNA

• przeniesienie łańcucha polipeptydowego na aminoacylo-tRNA w miejscu A

• następuje translokacja dużej podjednostki rybosomu, tRNA z peptydem wchodzi w miejsce

• translokacja małej podjednostki rybosomu. Rybosom jest gotów na przyjęcie kolejnego aminokwasu

• wchodzi kolejny tRNA załadowany aminokwasem

W jaki sposób komórka zapobiega błędom podczas translacji?

• aminoacylo tRNA wchodzi w miejsce A w towarzystwie czynnika elongacyjnego EF-Tu związanego z GTP

• jeśli wiązanie kodonu z antykodonem jest poprawne, GTP ulega hydrolizie i czynnik elongacyjny zmienia kształt i oddysocjowuje umożliwiając właściwe ustawienie aminokwasu w rybosomie.

Ekspresja genów jest najważniejszym dla funkcjonowania komórek i organizmów procesem. Ekspresja genów składa się z wielu złożonych etapów, z których każdy może podlegać regulacji; dzięki temu komórki różnego typu tego samego organizmu, ale mające ten sam zestaw genów, produkują różne zestawy białek; także w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne komórki zmieniają zestaw produkowanych białek

Każdy gen może ulegać transkrypcji i translacji z inną wydajnością, pozwalając, aby komórki wytwarzały w dużych ilości niektóre białka i w małych ilościach inne

Ekspresja genów prokariotycznych

• dominuje regulacja na poziomie transkrypcji

• policistronowe jednostki transkrypcyjne o wspólnej regulacji transkrypcyjnej – operony

• mRNA szybko degradowane, translacja zachodzi zasadniczo równocześnie z transkrypcją

Elementy systemów regulacji ekspresji genów

1. Elementy cis - znajdują się w obrębie tej samej cząsteczki, co element podlegający regulacji

• elementy cis w obrębie DNA, np. promotory, operatory, enhancery

• elementy cis w obrębie RNA - sekwencje wiążące białka regulujące translację, splicing, degradację itp.

1. Elementy trans - odrębne cząsteczki oddziałujące z elementami cis i modulujące ekspresję

• białka regulujące transkrypcję (czynniki transkrypcyjne), aktywatory, represory itp.

• białka regulujące inne etapy ekspresji (aktywatory/represory translacji, splicingu itp.)

• RNA regulatorowe (siRNA, miRNA itp.)

Podstawy regulacji ekspresji genów

• regulacja pozytywna - cczynnik trans jest aktywatorem – zwiększa ekspresję

• regulacja negatywna - czynnik trans jest represorem – osłabia ekspresję

• regulacja indukowalna - sygnał zwiększa (indukuje) ekspresję

• regulacja reprymowalna - sygnał zmniejsza (reprymuje) ekspresję

Kluczowym zjawiskiem dla regulacji inicjacji transkrypcji jest bezpośrednia interakcja białek regulatorowych (czynników transkrypcyjnych) z DNA

Przyłączanie białka regulacyjnego do DNA odbywa się dzięki interakcjom między łańcuchami bocznymi reszt aminokwasów w białkach a atomami zasad azotowych w DNA. Jest silne, gdyż w interakcji białko-DNA bierze co najmniej kilka reszt aminokwasowych

Motyw helisa-skręt-helisa (HTH) to najprostsza i najczęściej występująca struktura trzeciorzędowa w białkach regulacyjnych

Homeodomena to inny przykład domeny wiążącej DNA m.in. z motywem helisa-skręt-helisa (HTH)

Motyw palca cynkowego to inny przykład struktury charakterystycznej dla czynników transkrypcyjnych

Pasma beta i pętle mogą również brać udział w przyłączaniu białka do DNA

Motyw zamka leucynowego umożliwia jednocześnie dimeryzację jak i przyłączanie do DNA (bZIP)

Heterodimeryzacja zwiększa liczbę sekwencji, które są rozpoznawane przez dany kompleks białek regulacyjnych – kontrola kombinatoryczna. Motyw helisa-pętla-helisa (HLH) może również brać udział w dimeryzacji i przyłączaniu do DNA

WYKŁAD 4 – kontrola ekspresji genów prokariotycznych

–dominuje regulacja na poziomie transkrypcji

–policistronowe jednostki transkrypcyjne o wspólnej regulacji transkrypcyjnej – operony

–mRNA szybko degradowane, translacja zachodzi zasadniczo równocześnie z transkrypcją

Regulacja inicjacji transkrypcji

1.Polimeraza stosunkowo prosta, proste sekwencje promotorowe

• rdzeń katalityczny wspólny, kilka podjednostek sigma o różnej specyficzności odpowiadających za rozpoznanie promotorów

- σ70 (RpoD) – główny czynnik sigma ("housekeeping”) – większość genów

- σ54 (RpoN) – głód azotowy

- σ38 (RpoS) – głód/faza stacjonarna

- σ32 (RpoH) – szok cieplny

- σ28 (RpoF) – ruch i chemotaksja

Liczba czynników sigma na komórce waha się od 1 u Mycoplasma genitalia do 63 u Streptococcus coelicoulour.

• aktywatory i represory wpływają na wiązanie polimerazy z DNA

Operony

- typowy dla bakteri i archeonów system ekspresji

- policistronowy transkrypt – wspólna ekspresja wielu genów z jednego promotora

- przeważnie geny związane funkcją, ale są wyjątki

W rejonie odległym od operonu lac znajduje się gen, który koduje białko aktywatora katabolicznego (CAP). Białko to jest często określane jako CRP (cAMP receptor protein), gdyż jest one receptorem cyklicznego AMP. CAP wiąże się do sekwencji DNA wewnątrz operonu lac, w miejscu zwanym CAP.

Ekspresja operonu lac jest hamowana przez represor LacI

• represor ulega konstytutywnej ekspresji spod własnego promotora. W nieobecności laktozy represor wiąże się do sekwencji operatora

• w obecności laktozy operon lac jest indukowany.

• rzeczywistym induktorem jest alternatywna forma laktozy allolaktoza.

• ponieważ represja operonu lac nie jest nigdy całkowita, zawsze jest obecny ale na bardzo niskim poziomie enzym beta-galaktoazydaza, tak wiec pewna ilość laktozy może zostać przez bakterię pobrana i metabolizowana.

Represja kataboliczna operonu lac

• to kolejny mechanizm regulacji, dzięki któremu operon laktozowy reaguje na obecność cukru glukozy

• w pierwszej kolejności jest rozkładana glukoza, gdyż na ten proces potrzeba mniej energii - wówczas operon jest wyłączany przez represję kataboliczną

• najważniejszą rolę odgrywa tu białko CAP (aktywator kataboliczny), które wiąże się z DNA (nad promotorem lac) i zwiększa transkrypcję operonu.

• wiązanie DNA i CAP jest możliwe tylko przy obecności cAMP

• jeśli w komórce jest glukoza to poziom cAMP jest niski i CAP nie łączy się z DNA nad promotorem lac. Jeśli glukoza nie jest dostępna, rośnie poziom cAMP i CAP-cAMP wiąże się z DNA nad promotorem i rośnie transkrypcja operonu

Operon laktozowy

- regulacja na poziomie inicjacji transkrypcji

- negatywna indukowalna – przez laktozę/represor lacI

- pozytywna reprymowalna – przez glukozę/białko CAP

- białko to reguluje szereg operonów związanych z wykorzystywaniem źródeł węgla - regulon

Aktywacja transkrypcji na odległość u bakterii

• represor jest tetrtramerem składającym się z 4 identycznych podjednostek

• w czasie wiązania pojedynczej sekwencji operatora podjednostki pracują parami, tak wiec represor może wiązać się jednocześnie z dwoma trzech miejsc operatorowych. Możliwe że wiązanie pary podjednostek w rejonie głównego operatora, jest wzmocnione i stabilizowane przez przyłączenie w rejonie dodatkowego operatora

• możliwe jest, ze represor wiąże dwie sekwencje operatorowe w ten sposób, że nie blokuje przyłączenia polimerazy, ale blokuje dalsze etapy inicjacji, np. powstanie kompleksu otwartego

Terminacja transkrypcji

• podczas transkrypcji cały czas konkurencja między kontynuowaniem a dysocjacją polimerazy

• zależy od związanych białek, struktury transkryptu

• terminatory:

- samodzielne

- Rho zależne

Terminatory właściwe

- nić matrycowa DNA zawiera odwrócony palindrom (około 20 pz), a za nim ciąg nukleotydów adenozynowych

- powstający RNA fałduje się tworząc stabilna strukturę typu „ pętla i trzonek”

• spinka tworzona przez transkrypt promuje dysocjację polimerazy destabilizując połączenie RNA-DNA

• połączenie RNA-RNA redukuje liczbę styków między matrycą i transkryptem

• oddziaływanie RNA-DNA ulega dalszemu osłabieniu, gdy następuje transkrypcja ciągu A. A z U mają tylko dwa wiązania wodorowe

• polimeraza RNA odłącza się od matrycy dopiero po oddysocjowaniu transkryptu

Terminatory Rho różnią się od tych niezależnych od Rho. Mogą one przyjmować strukturę spinki, ale jest ona mniej stabilna i nie mają również w sekwencji ciągu A.

• czynnik Rho łączy się z nowopowstałym transkryptem RNA w miejscu zwanym rut (Rho utilisation)

• białko Rho przesuwa się wzdłuż nici RNA w stronę polimerazy

• jeżeli polimeraza zatrzymuje się przy sygnale terminacji, to Rho może dogonić polimerazę

• białko Rho jest helikaza, co oznacza, że może aktywnie rozbijać pary zasad, w tym przypadku miedzy matryca a transkryptem, powodując zakończenie

Regulacja na poziomie terminacji - antyterminacja

• regulacja pozytywna, czynnik trans wiążąc się z DNA znosi działanie terminatora

• proces ten polega na tym, ze polimeraza ignoruje sygnał terminacyjny i kontynuuje wydłużanie transkryptu aż osiągnie drugi sygnał zakończenia transkrypcji

• kontrolowany jest przez białko antyterminacyjne

• obecność tego białka powoduje, ze polimeraza ignoruje sygnał terminacji, prawdopodobnie przeciwdziałając właściwością destabilizującym samodzielnego terminatora lub zapobiegając zatrzymywaniu się polimerazy przy terminatorze

Regulacja na poziomie terminacji - atenuacja

• powoduje przedwczesna terminację

• fakultatywna sekwencja terminatora na początku transkryptu, zależnie od warunków

- kinetyka translacji – dostępność naładowanego tRNA (operon trp u E. coli)

- wiązanie ligandów drobnocząsteczkowych – ryboprzełączniki (niektóre)

Operon tryptofanowy u bakterii (regulacja negatywna reprymowalna)

Kontrola operonu tryptofanowego opiera się o komórkowy poziom tryptofanu. To on decyduje o aktywności represora, który jest białkiem allosterycznym. Przyłączenie tryptofanu (korepresora) do białka represorowego powoduje nieznaczne zmiany w trójwymiarowej strukturze utworzonego aktywnego represora

Operon tryptofanowy - atenuacja

Poza genami strukturalnymi znajdującymi się w tym operonie, operon ten zawiera tzw. sekwencję liderową w obrębie której znajduje się region atenuatora

Zależnie od dostępności załadowanego tRNATrp sekwencja lidera mRNA przyjmuje różne konformacje

Jeżeli w komórce znajduje się dużo tryptofanu peptyd liderowy zostanie zsyntetyzowany, a terminator powstaje w transkrypcie sekwencji liderowej, co powoduje, ze transkrypcja ulega zatrzymaniu. Natomiast przy braku tryptofanu nie powstanie peptyd liderowy, ponieważ rybosom zatrzymuje się na jednym z kodonów tryptofanowych.

Ryboprzełączniki

• wyspecjalizowane domeny wewnątrz określonych mRNA odgrywają rolę elementów włącz/wyłącz

• występują one przede wszystkim u bakterii, w regionach mRNA nieulegających translacji (UTR) na 5’końcu

• wiązanie związków drobnocząsteczkowych bezpośrednio z mRNA zmienia konformację, wpływając na ekspresję

- atenuacja

- dostępność miejsca wiązania rybosomu

• funkcjonalnie można wyróżnić element wiążący ligand - aptamer, oraz platformę ekspresyjną. Domeny aptamerowe są wysoce zachowawcze, natomiast platforma ekspresyjna wykazuje w różnych organizmach różnice w sekwencji, strukturze oraz mechanizmie działania.

Ryboprzełącznik TPP – operon thi E. coli

• odpowiada za biosyntezę tiaminy

• modulowana jest dostępność sekwencji Sine-Dalgarno (SD), oraz kodonu AUG. Aby proces translacji podlegał inhibicji region ten musi być włączony w strukturę drugorzędową. Jest wówczas niedostępny dla podjednostki 30S rybosomu.

• podczas niedoboru tiaminy lub TPP region przełącznika RNA blokuje sekwencję jednego z ramion spinki atenuacyjnej, uniemożliwiając jej poprawne uformowanie.

Transdukcja sygnału – systemy dwuskładnikowe

Systemy umożliwiające regulację genów w odpowiedzi na czynniki zewnętrzne (transdukcja sygnału)

• sensor– domena wiążąca ligand + domena kinazy histydynowej (HK) – autofosforylacja w odpowiedzi na sygnał

• efektor (RR – response regulator) – fosforylowany przez aktywny sensor (w asparaginie) reguluje transkrypcję

Życie społeczne bakterii – quorum sensing

• mechanizm wyczuwania liczebności

• ekspresja zależna od gęstości bakterii

• komórki wydzielają cząsteczki sygnałowe – autoinduktory (peptydy, związki laktonowe)

• przekroczenie progowego stężenia autoinduktorów – aktywacja systemu dwuskładnikowego, zmiana ekspresji

Quorum sensing Vibrio fischeri

Bioluminescencja tylko przy dużej gęstości

–w planktonie - nie

–w symbiozie z głowonogiem – tak

Produkowany przez enzym LuxI autoinduktor wiąże aktywator LuxR (tylko przy dużym stężeniu autoinduktora), co aktywuje operon lucyferazy.

Degradacja RNA u bakterii (zwykle następuje zaraz po terminacji translacji; czas trwania 10 s -20 min)

• RNaza E i RNaza III- endonukleazy, które dokonują cięcia wewnątrz cząsteczek RNA

• RNaza II- eksonukleaza, która usuwa nukleotydy w kierunku 3’- 5”

• fosforylaza polinukleotydową (PNPazę), która również usuwa nukleotydy od 3’ końca, ale w odróżnieniu od typowych nukleaz wymaga fosforu nieorganicznego jako substratu.

• kierowana przez sRNA

Degradosom: kompleks zawierający RNazę E, PNPazę, helikazę RNA RhlB oraz enolazę

Globalne systemy regulujące - regulony

Skoordynowana regulacja działania wielu operonów

• represja kataboliczna (aktywator CAP)

- zależny od poziomu glukozy poziom cAMP

- reguluje szereg operonów związanych z wykorzystywaniem węgla

• odpowiedź ścisła

- brak składników odżywczych, alarmon ppGpp, interakcja z polimerazą RNA, wybór podjednostki σ38 (RpoS)

• odpowiedź SOS

- uszkodzenia genomu, białko RecA – indukowana aktywność proteazy, tnie m. in. represor LexA

Odpowiedź ścisła – alarmon ppGpp (guanozyno 3’,5’ tetrafosforan)

- odpowiedz ścisła jest aktywowana, gdy bakterie znajda się w warunkach np. niskiego poziomu niezbędnych aminokwasów

- w aktywacji odpowiedzi biorą udział nietypowe nukleotydy ppGpp (guanozyno 3’,5’ tetra fosforan) zwane alarmonami, które są syntetyzowane przez białko relA w odpowiedzi na głodzenie aminokwasowe

- w kontroli transkrypcji regulowanej przez odpowiedź ścisła oprócz ppGpp, zarówno pozytywnie jak i negatywnie bierze udział czynnik transkrypcyjny DksA

Uszkodzenia DNA aktywują odpowiedź SOS. System SOS prokariontów regulują dwa kluczowe białka: LexA i RecA

• LexA jest represorem transkrypcji, przyłączającym się do sekwencji operatorowych

• RecA/ssDNA przyłącza represor LexA , co aktywuje jego aktywność proteazową i prowadzi do samocięcia LexA i odłączenie od operatorów, a potem jego degradację.

WYKŁAD 5 – regulacja ekspresji genów eukariotycznych

• procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie

• każdy gen ma własny promotor, nie występują operony

• proces ekspresji genu składa się z wielu etapów

• na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne

• informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) – złożoność proteomu przekracza złożoność genomu

- genom człowieka: ~23 000 genów kodujących białka

- proteom człowieka: co najmniej 500 000 form

Inicjacja transkrypcji u Eukariontów regulowana jest przez kombinacje białek

• jest głównym mechanizmem regulacji ekspresji genów

• regulacja inicjacji wynika z oddziaływań między białkami regulatorowymi tj. czynnikami transkrypcyjnymi działającymi trans (aktywatory lub represory transkrypcji) z sekwencjami regulatorowymi DNA cis

• elementy regulacyjne cis w promotorze genu:

- TATA box: wiązanie kompleksu preinicjującego (w tym polimeraza RNA) wzmacniacze (enhancery): sekwencje niezbędne do indukcji i zwiększenia ekspresji

- wyciszacze (silencery): sekwencje niezbędne do hamowania ekspresji

• czynniki trans:

- czynniki podstawowe: łączą się z polimerazą RNA i są niezbędne do inicjacji transkrypcji, wspólne dla wielu promotorów, łącza się z częścią proksymalną promotora

- czynniki specyficzne: łączą się do elementów cis w części dystalnej promotora i enhancerach, specyficzne tkankowo (powst. w odpowiedzi na sygnały regulacyjne), oddziałują z metylazami, acetylazami

Regulacja kombinatoryczna

• w sekwencjach regulatorowych występują różne kombinacje elementów cis wiążących różne czynniki trans, co daje bardzo wiele możliwości regulacji przy udziale stosunkowo niewielkiej liczby regulatorów – kombinatoryka

• promotor polimerazy RNAII można opisać jako serię modułów, z których każdy działa jako miejsce wiązania białka mającego wpływ na składanie kompleksu inicjującego transkrypcję.

• moduły promotora podstawowego, z których najważniejsze to sekwencja TATA i sekwencja Inr,

• moduły tkankowo specyficzne- znajdują się w promotorach genów, które ulęgają ekspresji tylko w jednym typie tkanki

• moduły odpowiedzi- regulują inicjację transkrypcji w odpowiedzi na sygnały z zewnątrz, np. moduł odp. na cAMP- CRE, czy moduł odp. na szok cieplny

• moduł rozwoju- aktywne tylko w specyficznych etapach rozwoju.

Jedno białko regulatorowe może koordynować transkrypcję wielu różnych genów

Alternatywny start transkrypcji

• wiele genów wyższych eukariontów posiada wiele alternatywnych miejsc startu transkrypcji (promotorów), specyficznych tkankowo

• dzięki temu z jednego powstają różne transkrypty i białka w różnych komórkach i tkankach

Regulacja inicjacji transkrypcji. Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory

1.Ogólne czynniki transkrypcyjne (podstawowe) – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora

2.Specyficzne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach

• polimeraza RNA II wymaga do inicjacji transkrypcji oprócz ogólnych czynników transkrypcyjnych i specyficznych czynników transkrypcyjnych (aktywatorów), także mediatorów oraz enzymów modyfikujących chromatynę

• koaktywatory –uczestniczą w aktywacji transkrypcji, ale nie wiążą się z DNA. Działają przez oddziaływania z białkami kompleksu transkrypcyjnego

- kompleks mediatora jest ogólnym koaktywatorem polimerazy II

- niezbędny do regulowanej transkrypcji

- absolutnie wymagany do transkrypcji większości genów eukariotycznych

- oddziałuje bezpośrednio z aktywatorami transkrypcji i polimerazą II RNA

- ważny zarówno dla pozytywnej jak i negatywnej regulacji transkrypcji

Struktura domenowa aktywatorów transkrypcji

HTH

HLH

palec cynkowy

zamek leucynowy

Konsekwencją nawinięcia DNA na nukleosomy i jego ścisłego upakowania w jądrze komórkowym jest utrudniony dostęp innych białek do DNA: transkrypcja, replikacja i naprawa DNA odbywa się w kontekście chromatyny

2 podstawowe stany chromatyny:

• heterochromatyna

- konstytutywna – jest obecna stale w komórce, DNA wchodzący w jej skład nie zawiera genów, dzięki czemu zachowuje zwartą strukturę (obszary centromerów i telomerów)

- fakultatywna – ta forma chromatyny pojawia się w jądrze okresowo i tylko w niektórych komórkach, prawdopodobnie zawiera geny nieaktywne w czasie niektórych faz cyklu komórkowego, W mitozie cały DNA występuje jako heterochromatyna

• euchromatyna – to luźno upakowana forma chromatyny, zawierająca geny aktywne transkrypcyjnie

Regulacja dostępności chromatyny:

- odsłonięty promotor dostępny dla czynników transkrypcyjnych

- struktura chromatyny ogranicza wiązanie czynników transkrypcyjnych

Regulacja organizacji chromatyny w czasie i przestrzeni – kluczowa rola w regulacji transkrypcji

1. Kowalencyjne modyfikacje potranslacyjne histonów

2. ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny (wymiana histonów na ich warianty sekwencyjne lub na histony o innych modyfikacjach potranslacyjnych, a także przesuwanie nukleosomów wzdłuż DNA)

3. Metylacja DNA

Aktywatory transkrypcji wpływają lokalnie na strukturę chromatyny w obrębie promotora

Modyfikacje histonów rdzeniowych:

• fosforylacja

• acetylacja

• metylacja

• ADP-rybozylacja

• ubikwitynylacja

• sumoylacja

Enzymy modyfikujące histony rdzeniowe zależnie od ich aktywności mogą być aktywatorami bądź represorami transkrypcji

Acetylacja histonów rdzeniowych rozluźnia strukturę chromatyny

Acetylacja reszt lizyny histonów powoduje zmianę ładunku elektrycznego tych białek z dodatniego na obojętny, co w konsekwencji hamuje interakcje z ujemnie naładowaną resztą kwasu fosforowego DNA. Następstwem jest zmiana struktury nukleosomu, rozwinięcie nici DNA, zwiększona dostępność dla wiązania czynników transkrypcyjnych oraz enzymów biorących udział w transkrypcji, a w związku z tym aktywacja ekspresji swoistych genów

Ponieważ modyfikację kowalencyjne wpływają na dostępność chromatyny dla podstawowej maszynerii transkrypcyjnej, uważa się je za nadrzędny czynnik decydujący o włączeniu/wyłączeniu aktywności genu.

• modyfikowane hsitony hamują wiązanie białek z danym rejonem chromatyny

• modyfikowane histony rekrutują specyficzne białka rozpoznające określone modyfikacje

- bromodomena – domena białkowa, która wiąże specyficznie reszty acetylowanej licyny

- chromodomena – domena białkowa, która wiąże specyficznie etylowane histony

Hipoteza kodu histonowego

Kod histonowy - specyficzny wzór modyfikacji histonów, który determinuje jakie białka regulacyjne mogą się przyłączać do danego obszaru chromatyny

• chromatyna posiada specyficzne wzory modyfikacji potranslacyjnych, które można uznać za zakodowaną informację odczytywaną przez białka modyfikujące i przebudowujące chromatynę

• odpowiednie wzory modyfikacji chromatyny umożliwiają przyłączanie się do chromatyny białkom regulacyjnym biorącym udział w regulacji transkrypcji i naprawie DNA lub/oraz odsłaniają DNA, do którego mogą się przyłączać bezpośrednio inne czynniki regulacyjne

• określona modyfikacja specyficznej reszty aminokwasu w histonie może regulować modyfikację tej samej reszty aminokwasowej w innym histonie lub innej reszty w tym samym histonie

• odpowiedni wzór modyfikacji chromatyny w danym regionie chromosomu może być dziedziczony

ATP-zależna przebudowa chromatyny (remodeling) – wymiana histonów i nukleosomów:

• wymiana histonów na warianty histonowe lub na te same, ale o innych modyfikacjach

• usunięcie histonów z regionów regulacyjnych DNA

• przesunięcie nukleosomów (cis – wzdłuż tej samej cząsteczki DNA i trans – między różnymi cząsteczkami DNA)

• odciąganie fragmentów DNA od histonów, tworzy się pętla DNA

Za „remodeling” chromatyny odpowiedzialne sa kompleksy wielobiałkowe zawierające podjednostki ATPazowe, które warunkują ATP-zależne zmiany konformacyjne w nukleosomach; wyróżniamy 4 typy kompleksów odpowiedzialnych za remodleing:

1. SWI2 (zawierają bromodomenę, wszystkie rodzaje przebudowy chromatyny)

2. ISWI (przesuwanie nukleosomów)

3. INO80/SWR (wymiana histonów)

4. CHD (zawierają chromodomenę, regulacja transkrypcji)

Aktywność kompleksów przebudowujących chromatynę zależy od ATP, w wyniku ich działania zmienia się sposób oddziaływania pomiędzy histonami a DNA.

Kompleksy remodelujące zaangażowane są zarówno w aktywację jak i represję transkrypcji (koaktywatory i korepresory transkrypcji)

Regulacja struktury nukleosomowej chromatyny: przesuwanie nukleosomów - zwalnianie dostępu do miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych

Kompleksy przebudowujące chromatynę zależne od ATP składają się z wielu białkowych podjednostek Drożdżowy SWI/SNF

• 11 białek

• potrzebny do ekspresji genów decydujących o typie koniugacyjnym drożdży (switching), oraz ekspresji genów regulujących metabolizm sacharozy (sucrose non-fermenting)

• niektóre supresory mutacji swi/snf są mutacjami w genach kodujących histony

• aby aktywować transkrypcję regulowanych przez siebie genów kompleks SWI/SNF oddziałuje z chromatyną

• kompleks jest ATPazą

ATP-zależna przebudowa chromatyny:

• ślizganie lub przesunięcie oktameru histonowego w nowe miejsce, odsłonięcie DNA

• usuniecie oktameru histonowego z obszaru DNA

• usunięcie dimerów H2A-H2B, pozostawienie jedynie centralnej części oktameru – tetrameru l H3-H4, odsłonięcie DNA i destabilizacja nukleosomu

• zastąpienie dimerów– wymiana dimeru H2A-H2B na dimer zawierający histon H2B i wariant H2A.Z (Htz1 in S. cerevisiae)

Domeny funkcjonalne i izolatory

• izolatory oddzielają domeny funkcjonalne w chromatynie

• białka wiążące się z izolatorami uniemożliwiają interferencję regulatorów z sąsiedniej domeny (innych genów)

• izolator umieszczony między genem a położoną wyżej jego sekwencją regulatorową uniemożliwia dotarcie do genu sygnału regulującego

• w swoim normalnym położeniu izolator zapobiega wymianie informacji między domenami funkcjonalnymi - sekwencje jednego genu nie wpływają na ekspresję innego genu położonego w sąsiedniej domenie.

Metylacja DNA wpływa na strukturę chromatyny i reguluje proces transkrypcji genów eukariotycznych

- metylacja cytozyn w DNA znakuje geny przeznaczone do wyciszenia

- w metylacji DNA donorem grup metylowych jest S-adenozylometionina (SAM). Reakcja katalizowana jest przez metylotransferazę DNA(DNMT)

Metylacja DNA przyłączenie grupy metylowej do cytozyny (u ssaków metylacji podlegają sekwencje CpG, do 10% cytozyn jest metylowanych u ssaków )

• powoduje zamknięcie danego obszaru chromatyny

• może być podtrzymywana podczas podziałów komórkowych

• może powstawać de novo

Udział metylacji DNA w rozprzestrzenianiu i utrzymywaniu stanu wyciszonej chromatyny

Proces metylacji DNA jest ściśle powiązany z innymi mechanizmami zapewniającymi wyciszanie chromatyny.

Zmetylowana grupa K9H3 jest miejscem przyłączenia białka adapterowego HP1, które z kolei pozwala na przyłączenie DNMT i metylazy HMT, dzięki czemu metylowane są wyspy CpG w pobliżu, jak również inne Lys9H3.

Z drugiej strony do zmetylowanych cytozyn przyłącza się białko MBD (methyl-CpG-binding domain), do którego przyłącza się HDAC, które deacetyluje Lys9H3, co umożliwia z kolei jej metylację.

Metylacja DNA:

• odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów oraz w dziedziczeniu epigenetycznym

• jest znacznikiem epigenetycznym decydującym o prawidłowym zachodzeniu piętna genomowego (ang. genetic imprinting), znacznik ten powstaje w rozwijającym się oocycie i jest niezbędny do utrzymania mono-allelicznej ekspresji piętnowanego genu (np. gen Igf2 – koduje czynnik wzrostowy, wyłącznie allel od ojca jest aktywny) Proces ten jest niezbędny do właściwego rozwoju

• odgrywa podstawową rolę w inaktywacji chromosomu X. Dzięki inaktywacji jednego z chromosomów X, u samic tak jak i u samców aktywna jest tylko jedna kopia genów sprzężonych z płcią.

• utrzymuje się podczas mitozy, u zwierząt w procesie mejozy jest usuwana

Epigenetyczna regulacja genów to zjawisko polegające na dziedziczeniu zmian w ekspresji genów, które są niezależne od zmian w sekwencji DNA

WYKŁAD 6 – post-translacyjna regulacja ekspresji genów eukariotycznych

Alternatywne dojrzewanie RNA

- alternatywny splicing

- alternatywne miejsca poliadenylacji

- redagowanie (edycja) RNA

Splicing to proces, w którym w ściśle określonych miejscach w obrębie połączenia intron – egzon z prekursorowego RNA usuwane są introny, natomiast końce pozostałych fragmentów RNA są łączone i tworzą ciągłe cząsteczki

Alternatywny splicing

• wybór różnych miejsc łączenia (tzw. miejsca kryptyczne)

• składanie różnych kombinacji eksonów (w układzie cis i trans)

• jeden gen – wiele białek

• często tkankowo-specyficzne

• może powodować wstawienie przedwczesnego STOP – mechanizm regulacji

W przypadku splicingu alternatywnego z pre-mRNA transkrybowanego na matrycy jednego genu, formowane może być kilka rodzajów dojrzałych mRNA, zdolnych do udziału w translacji różnych białek

Transkrypty wielu eukariotycznych genów może być łączone w więcej niż jeden sposób, pozwalając tym samym na wytworzenia odpowiedniego zbioru różnych białek z tego samego genu.

Alternatywny splicing - przykłady

1. Bardzo wiele genów człowieka

–~75% genów (może nawet 90%)

–1 gen średnio 3 końcowe transkrypty

–Rekordy

•Neurexin 3 (człowiek) – 2000 alternatywnych transkryptów

•DSCAM (Drosophila) – 40 000 form!!!

1. Amylaza śliniankowa i wątrobowa

2. Tachykininy:

–neurotransmitery w narządach zmysłów

–neuropeptyd P w układzie nerwowym

–neuropeptyd K w tarczycy i jelicie

1. Determinacja płci Drosophila

- zależy kaskady alternatywnego składania RNA

- produkty trzech kluczowych genów przekazują informacje o tym stosunku do wielu innych genów, które określają cechy męskie i żeńskie

- gen Sxl-to nadrzędny gen który reguluje inicjację kaskady genów biorących udział w determinacji płci u muszki owocowej

- pierwszym genem w tej kaskadzie jest sxl, którego transkrypt zawiera fakultatywny ekson: po jego dołączeniu do poprzedzającego go eksonu powstaje nieaktywna forma białka SXL. Białko DSX, które jest specyficzne dla samca i samicy odgrywa role fizjologiczną w determinacji płci u Drosophila

Poliadenylacja końca 3’ mRNA u eukariontów

• prawie wszystkie eukariotyczne mRNA mają serię 50-250 adenozyn na końcach 3’.

• koniec poli(A) niezbędny do terminacji transkrypcji, transportu mRNA z jądra do cytoplazmy , decyduje o stabilności transkryptu (chroni przed nukleazami) i efektywności jego translacji oraz o degradacji mRNA po zakończeniu translacji.

• dotyczy większości mRNA, wyjątkiem są mRNA kodujące histony